HPLC法測定柳蘑麥角甾醇含量

尹昭曄 孔炯煒 趙 婷 趙引利 劉 湘 喬麗菲

（武安市第一人民醫(yī)院，河北武安 056300）

柳蘑學(xué)名毛栓菌Trametes hirsute，屬擔(dān)子菌綱，多孔菌目，多孔菌科[1]，是民間習(xí)用的治癬菌類生藥，具有消炎解毒、止癢的功效，其油膏劑已收入《衛(wèi)計委藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十五冊》，用于治療牛皮癬、干癬、風(fēng)癬及神經(jīng)性皮炎[2]。柳蘑治療癬癥療效確切，但藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，未有合理質(zhì)控方案，目前未見關(guān)于柳蘑的藥效成分含量測定研究報道，為了更好地控制藥材質(zhì)量，現(xiàn)采用高效液相色譜法測定其藥效成分含量，以有效地控制藥材的質(zhì)量。

麥角甾醇是真菌類的特征甾醇。據(jù)報道，麥角甾醇的量與真菌的生物量存在相關(guān)關(guān)系，是真菌生物量的重要標(biāo)志物之一[3-5]，藥理作用廣泛，現(xiàn)代藥理研究表明其具有良好的抗炎抗菌作用[6-10]。因此，筆者以麥角甾醇為指標(biāo)成分，測定其含量，為完善柳蘑藥材和制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

U-3000 型高效液相色譜儀（配置四元泵，紫外檢測器，化學(xué)工作站，美國戴安公司）；XS105型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

柳蘑（天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司提供）；麥角甾醇（中國食品藥品檢定研究院，批號：111845— 201604；質(zhì)量分?jǐn)?shù)：96.2%）；色譜級甲醇（德國默克公司）；水為超純水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：DIKMA C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：100%甲醇；流速：1.0 mL/min；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣體積：10μL；檢測波長：282 nm。

1.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品11.67 mg，用無水甲醇定容至10 mL 容量瓶中，超聲2 min 使其溶解完全，制備成1.123 mg/mL的對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備

1.3.3.1 麥角甾醇化合物制備

稱取預(yù)粉碎的毛栓菌藥粉4.0 kg，95%乙醇超聲提取2 次，1 h/次，每次溶劑用量均為20 倍量（kg/L），合并兩次提取液，濾過，60 ℃減壓回收溶劑至完全回收乙醇，得濃縮液；將濃縮液用超純水1∶1稀釋，用等體積的乙酸乙酯萃取3 次，合并3 次萃取液，低溫回收溶劑至干，得乙酸乙酯萃取干膏42 g；經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚-丙酮梯度洗脫，洗脫液中有大量無色針晶析出，濾過分離晶體與母液，得到混合物618 mg，制備色譜柱SHIM-pack PRC-ODS（20 mm×250 mm，5μm），二極管陣列檢測器，檢測波長為203 nm，柱溫為室溫，98%甲醇-水洗脫，流速為3 mL/min；做分離制備，回收制備液低溫干燥得到4種純品化合物，均為麥角甾類化合物[11]，并作為樣品。

1.3.3.2 供試品溶液制備

精密稱取柳蘑樣品約2.00 g，置具塞錐形瓶中，精密加入100 mL無水甲醇，并封口浸泡過夜，超聲提取1 h（40 kHz 500 W）冷卻至室溫，用無水甲醇補(bǔ)足，用0.45μm微孔濾膜濾過，取濾液作為供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]，得知麥角甾醇在紫外吸收區(qū)的最大吸收波長為282 nm，故采用282 nm 為檢測波長。

2.2 流動相的選擇

試驗(yàn)先后采用甲醇-水體積比（100∶0、98∶2、95∶5）及乙腈-水體積比（98∶2、95∶5）作為流動相進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)100%甲醇作為流動相，保留時間最短，為20 min，且能達(dá)到色譜峰形對稱，不拖尾，分離完全，故最終確定以100%甲醇作為流動相進(jìn)行洗脫。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性及線性關(guān)系考察

按1.3.1色譜條件進(jìn)行供試品及對照品HPLC檢測，供試品與對照品在相同的保留時間處有相應(yīng)的色譜峰，且與雜質(zhì)峰得到較好的分離，分離度大于1.5（圖1）。

圖1 麥角甾醇對照品溶液（A）和供試品溶液（B）HPLC色譜圖

精密稱取麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，用流動相溶解并稀釋成每1 mL 含麥角甾醇分別為22.5μg、44.9μg、112.3μg、224.5μg、449.1μg、1 122μg 的對照品溶液，分別取10μL 進(jìn)樣，麥角甾醇色譜峰面積分別為372 709、708 874、1 593 605、3 379 179、6 957 211、16 995 928，以麥角甾醇含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y=15 169x+5 842，R2=0.9998，表明麥角甾醇在0.022 5～1.122 7 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液10μL，按照1.3.1 色譜條件進(jìn)行測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，麥角甾醇的峰面積RSD為0.67%，表明該方法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次柳蘑樣品，按照1.3.3制備供試品溶液，分別在供試品溶液制備好后的0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h 進(jìn)樣，計算峰面積RSD 為1.56%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批次柳蘑樣品，精密稱取1.000 g，平行稱量6 次，按照1.3.1 色譜條件進(jìn)行測定，測得麥角甾醇的平均含量為1.718 mg/g，計算RSD 為1.29%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取柳蘑樣品2 g，平行6 次，精密稱量，按照1.3.3制備供試品溶液，并進(jìn)行測定，計算回收率。測得平均回收率為100.48%，RSD為1.38%。表明加樣回收率良好（表1）。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品含量測定

精密稱取一定質(zhì)量的柳蘑樣品，制備供試品溶液，按1.3.1 色譜條件進(jìn)行測定。供試品溶液進(jìn)樣5次，以外標(biāo)法中的標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算柳蘑藥材樣中麥角甾醇成分的含量。計算得柳蘑麥角甾醇含量為1.719 mg/g。

3 小結(jié)

試驗(yàn)建立了柳蘑中麥角甾醇的HPLC 測定方法，測定方法簡便且重現(xiàn)性好，可作為柳蘑中抗菌成分麥角甾醇含量的測定方法，為完善柳蘑藥材和制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。