秀珍菇上一種黏菌的鑒定及其防治初探

胡積祥 徐 明 高 波 王 凡 蔣穎潔 張俊喜*

（1江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇鹽城 224002；2鹽城市雨露農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇鹽城 224002）

秀珍菇即肺形側(cè)耳Pleurotus pulmonarius[1]，是一種深受消費(fèi)者喜食的高蛋白低脂肪的食用菌，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及得天獨(dú)厚的抗病養(yǎng)生功效。秀珍菇的多糖具有抗炎[2]、鎮(zhèn)痛[3]、降血壓[4]和控制糖尿病[5]的療效，對(duì)肝癌具有預(yù)防和化療增效作用[6]，可以改善因飲食高脂肪而造成的腦海馬區(qū)域的損害和失憶現(xiàn)象[7]；其漆酶可用于紡織工業(yè)中染料的脫色[8]、食品和飼料中真菌毒素的解毒[9]、土壤修復(fù)中清除二噁英、呋喃等有毒化學(xué)物質(zhì)[10]。

近幾年，江蘇省秀珍菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展較快，年栽培量至少2 000 萬(wàn)袋，主要分布在常州、淮安、連云港、泰州和鹽城等市，其中鹽城市達(dá)100萬(wàn)袋以上，年產(chǎn)值1 億元以上。栽培秀珍菇往往是在全年氣溫較高時(shí)6-9 月出菇，因此除極易受木霉、菇蠅和菇蚊[11]等為害外，還時(shí)常遭受黏菌的侵害。出菇棚一旦出現(xiàn)黏菌，如不采取有效防治措施，產(chǎn)量將遭受毀滅性的損失。

2018 年，江蘇省鹽城市秀珍菇菇棚內(nèi)出現(xiàn)一種黏菌，該菌吞噬秀珍菇的菌絲和子實(shí)體，且生長(zhǎng)和擴(kuò)展迅速，水解膠化菇體能力強(qiáng)，一旦子實(shí)體被感染，72 h 內(nèi)將變?yōu)橐粩傸S色的膠狀水。據(jù)2022 年的調(diào)查，鹽城市秀珍菇菇棚的產(chǎn)量因其損失近三分之一，給當(dāng)?shù)氐纳a(chǎn)者造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為此，筆者對(duì)該黏菌進(jìn)行純化分離和鑒定，初步探討了一種防治方法，以期為防控秀珍菇黏菌提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）培養(yǎng)基

燕麥瓊脂培養(yǎng)基：1 L 蒸餾水中加30 g 燕麥片，煮沸1 h 后用三層紗布過(guò)濾，取濾液加入20 g 瓊脂粉，加熱溶解后定容1 L，121 ℃滅菌20 min。

（2）供試菌株

黏菌YCTH 于2022年6月采自鹽城市亭湖區(qū)南洋鎮(zhèn)月青村，雨露農(nóng)業(yè)科技有限公司的菇棚。

（3）主要試劑和藥劑

2× 超 光 速PCR mix（MF848）、M5 HiClear DL2000 plus DNA marker（MF026）、M5 HiPure Agarose 瓊脂糖（MF103）和M5 HiPure Gelred 核酸染料（MF079）均購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、氯仿、異丙醇和乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純；二氧化氯消毒片（規(guī)格為100 g：12.0 g），由南京水立美生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離和培養(yǎng)

利用黏菌的移動(dòng)性，挑取受害菌蓋上的黃色原生質(zhì)體至燕麥瓊脂培養(yǎng)基平板中心，于24 ℃黑暗培養(yǎng)24 h 后，切取最前段純凈的菌絲體至新的燕麥瓊脂培養(yǎng)基平板上，如此重復(fù)移切，直到菌株純化。此后每?jī)商煜蚱桨逯腥黾s0.5 g 無(wú)菌燕麥片覆蓋部分培養(yǎng)基，并加無(wú)菌水濕潤(rùn)燕麥片。

1.2.2 菌株分子鑒定

刮取培養(yǎng)基平板中燕麥片上的原生質(zhì)體，以CTAB 法提取其基因組總DNA；利用引物ITS-F（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS-R（TCCTCC GCTTATTGATATGC）PCR 擴(kuò)增黏菌ITS 序列[12]，其中PCR 擴(kuò)增體系和程序參照試劑說(shuō)明書(shū)，退火溫度為45 ℃。PCR 產(chǎn)物委托北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行Blast 檢索，下載同源性較好的序列后利用MEGA 11中最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，重復(fù)1 000 次，其他參數(shù)默認(rèn)。其中序列比對(duì)采用內(nèi)嵌程序ClustalW，外群菌株選擇為鱗鈣皮菌，GenBank 中登錄號(hào)為HQ450508.1。

1.2.3 二氧化氯防治試驗(yàn)

參照盧成苗等[13]采用室內(nèi)層架式栽培‘臺(tái)秀57’，棚中鐵架長(zhǎng)3.5 m，寬0.6 m，高3 m，分三層，每層80 袋。聚丙烯塑料袋的規(guī)格為17 cm × 33 cm ×0.005 cm；培養(yǎng)料為雜木屑72%，麩皮20%，玉米粉5%，石膏粉1.5%，石灰1.5%。

將10 g 二氧化氯消毒片投入1 kg 水中，稀釋成0.12%（質(zhì)量比）的工作液。當(dāng)秀珍菇的菌蓋長(zhǎng)至約3 cm，菌柄2 cm 時(shí)，選取鐵架中層最上面的20 個(gè)菌袋；將帶菌的燕麥片貼在菌蓋上近菌柄處的一側(cè)，每個(gè)菌袋處理2～3 個(gè)菌蓋；6 h 后將這些菌袋縱向割開(kāi)，一半噴清水作為對(duì)照，另一半與同一菇架上的其他菌袋一起噴（霧狀）二氧化氯工作液，此時(shí)對(duì)照組用塑料袋短暫遮蓋；12 h 后測(cè)量菌蓋上黏菌原生質(zhì)體前端離燕麥片的距離，即遷移距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 為害特征

堆料被黏菌侵染后，料面會(huì)出現(xiàn)鮮黃色的扇面形膠狀體，其多分枝而脈絡(luò)狀。菇棚內(nèi)的菌袋黏菌侵染后，開(kāi)口處培養(yǎng)料和秀珍菇菌絲表現(xiàn)為濕腐；子實(shí)體受害時(shí)，菌柄、菌褶和菌蓋逐漸被黏菌全覆蓋，導(dǎo)致整個(gè)子實(shí)體腐爛，散發(fā)一股酸臭味（圖1a和圖1b）。隨之，腐爛膠體掉落到下層的菌袋上，直接引起新一輪的侵害，而掉落到地面上的黃色原生質(zhì)團(tuán)也會(huì)主動(dòng)遷移至距離地面最近的菌袋（圖1d）。因此，菇架底部的菌袋一般受害最嚴(yán)重。受害菌袋若不及時(shí)消毒處理，會(huì)縮水變褐，不再出菇，但光禿禿的菌袋上也不產(chǎn)生黏菌的繁殖體（圖1c）。

圖1 黏菌為害秀珍菇癥狀

筆者5 年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該黏菌畏光。將受害菌棒置于陽(yáng)光下暴曬，菌棒上的黏菌原生質(zhì)體由黃色變?yōu)楹稚淝趾λ俣茸兙?，甚至死亡。秀珍菇出首潮菇時(shí)，一般不會(huì)出現(xiàn)該黏菌，2018 年第4～第5潮發(fā)病，2019—2021 年第3～4 潮菇發(fā)病，2022 年第2潮菇發(fā)病。

2.2 菌株培養(yǎng)特征

在燕麥瓊脂培養(yǎng)基上，該黏菌形成黃色扇形結(jié)構(gòu)的原生質(zhì)團(tuán)，前緣加厚，具有遷移、融合和吞噬等特征，有特殊的芳香氣味，后期黃色更亮，氣味更濃。原生質(zhì)團(tuán)在遷移過(guò)程中形態(tài)不斷發(fā)生變化，可以形成管狀形態(tài)和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖2）。這些特征與史立平等[14]，谷碩等[15]報(bào)道的多頭絨泡菌Physarum polycephalum較吻合，因此初步判定該黏菌為絨泡菌屬Physarum中的一個(gè)成員。

圖2 黏菌在燕麥瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1 d（a）、4 d（b）和6 d（c）的形態(tài)特征

2.3 菌株分子鑒定

2.3.1 ITS序列PCR擴(kuò)增

1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，樣品的PCR 產(chǎn)物在500～750 bp 處有一條較亮的特異性條帶（圖3），大小符合預(yù)期，表明ITS 序列片段被成功擴(kuò)增，盡管CK（以水為模板）在500 bp 以下有一條非特異性條帶。

圖3 菌株的ITS序列擴(kuò)增結(jié)果

2.3.2 ITS序列分析

測(cè)序結(jié)果顯示ITS 擴(kuò)增片段為840 bp 的rDNA序列（GenBank 登錄號(hào)：OQ085095）。將該序列在NCBI GenBank 中進(jìn)行Blast 檢索，結(jié)果顯示其與數(shù)據(jù)庫(kù)中的多頭絨泡菌的序列同源性最高，與序列V01159.1、M13612.1 在覆蓋區(qū)域內(nèi)的相似性分別為99.66%、100%，且系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示它與V01159.1 聚為一簇（圖4）。因此，最終將該菌株鑒定為多頭絨泡菌。

圖4 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 二氧化氯防效

噴施二氧化氯溶液后黏菌在秀珍菇菌蓋上的平均遷移距離為1.62 cm，而清水對(duì)照為2.66 cm，相差1 cm 左右，因此噴施二氧化氯溶液可以顯著降低黏菌在菌蓋的遷移距離，即減緩黏菌對(duì)菌蓋的吞噬速度（圖5）?；诙趸仁且环N廣譜和高效的滅菌劑，試驗(yàn)結(jié)果最終表明0.12%二氧化氯對(duì)該黏菌病具有一定的防效。

圖5 噴施二氧化氯后黏菌的遷移距離

3 結(jié)論與討論

通過(guò)觀察菇棚內(nèi)黏菌為害秀珍菇癥狀，并對(duì)黏菌菌株進(jìn)行分離與純化培養(yǎng)以及黏菌ITS 序列的分析，最終確定為害鹽城市秀珍菇的黏菌為多頭絨泡菌。該菌常見(jiàn)于林中朽木及落葉，在人工培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速，固體培養(yǎng)基中能順利完成生活史[15]，在液體培養(yǎng)基中可形成微原生質(zhì)團(tuán)[16]。該菌因其智慧的覓食方式、微原生質(zhì)團(tuán)細(xì)胞核分裂的一致性和無(wú)細(xì)胞壁的特征，常常被當(dāng)作一種重要的試驗(yàn)材料，用于研究群體智能和真核細(xì)胞周期以及細(xì)胞分化與發(fā)育等。但鮮為人知的是，該菌也為害食用菌，且相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。

黏菌是一類(lèi)特殊的真核生物，營(yíng)養(yǎng)階段的構(gòu)造、運(yùn)動(dòng)和攝食方式與變形蟲(chóng)相似，具有動(dòng)物特征，而繁殖體為子實(shí)體，此時(shí)又具有菌物的特性。若從菌物角度出發(fā)，黏菌與宿主之間的侵染關(guān)系顯然不符合科赫法則，算不上一種病原物，只是表面上的腐生物，因此不受關(guān)注。然而從近些年的文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)看，一些黏菌在活體植物[17-19]和食藥用菌上的為害還是很?chē)?yán)重。植株表面一旦被黏菌覆蓋，光合作用受阻，輕則導(dǎo)致生長(zhǎng)不良，產(chǎn)量和品質(zhì)降低，重則幼苗和植株直接枯死。而食用菌一旦感染黏菌，食用菌子實(shí)體腐爛，失去商品價(jià)值或變?yōu)橐粩偰z狀水。隨著食用菌栽培模式由原來(lái)的季節(jié)性逐漸變?yōu)橹苣晷裕瑐€(gè)體農(nóng)戶生產(chǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)槠髽I(yè)規(guī)模生產(chǎn)，早期菇棚也成為老菇棚，黏菌病害勢(shì)必逐漸加重。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中要重視黏菌病害的預(yù)防，尤其是食用菌。

二氧化氯消毒劑是一種高效低毒低殘留的廣譜消毒劑，在食用菌栽培中除常用來(lái)熏蒸消毒接種室、培養(yǎng)室以及出菇房外，還可以用于防治競(jìng)爭(zhēng)性雜菌和食用菌病害。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，低至0.375 mg/L的二氧化氯可有效地抑制褐斑病病原菌托拉斯假單胞桿菌的生長(zhǎng)（抑制率＞95%），且此體積質(zhì)量濃度對(duì)平菇、金針菇、雙孢蘑菇、香菇和杏鮑菇的菌絲生長(zhǎng)不影響[20]；采用25 mg/L、50 mg/L、50 mg/L 的二氧化氯分別處理綠色木霉、擬康氏木霉、青霉的孢子，10 min 就可將其徹底滅活[21]。研究結(jié)果表明，噴霧0.12%的二氧化氯可以減輕多頭絨泡菌對(duì)秀珍菇的為害，并抑制其在菇棚內(nèi)的進(jìn)一步擴(kuò)展。但二氧化氯防治該病的最佳用藥濃度和方式、對(duì)秀珍菇生長(zhǎng)的影響以及滅殺機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

致謝：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)劉淑艷教授在菌株的鑒定方面給予了詳細(xì)指導(dǎo)。