兩個側(cè)耳科真菌的形態(tài)學(xué)及ITS鑒定

田慧敏 王秀艷 呂國帥 曹 蝶 劉 爽

（赤峰學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰 024000）

側(cè)耳屬Pleurotus（Fr.）P.Kumm.建屬于1871 年，最初隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycotina）、傘菌目（Agaricales）、口 蘑 科Tricholomataceae[1]。1951 年Singer 在研究多孔菌相關(guān)屬的子實層髓時指出香菇屬Lentinus、革耳屬Panus、側(cè)耳屬Pleurotus應(yīng)歸為多孔菌科[2]。1980年Kühner將該屬從多孔菌科分離出來獨立成側(cè)耳科Pleurotaceae Kühner[3]。《菌物字典》第10版的分類系統(tǒng)，側(cè)耳屬隸屬于側(cè)耳科（Pleurotaceae），該科包括側(cè)耳屬Pleurotus、亞側(cè)耳屬Hohenbuehelia等[4]。該科真菌一般木生，多為掌狀或扇狀的擔(dān)子果，菌褶延生，色淺，常白色；菌柄側(cè)生、偏生、中生或無柄，孢子印白色，擔(dān)孢子無色，長橢圓形或臘腸形。據(jù)統(tǒng)計，我國現(xiàn)有側(cè)耳科真菌52種，其中側(cè)耳屬36 個種、5 個變種，亞側(cè)耳屬11 個種[5-6]。該科真菌多數(shù)種類具有重要的經(jīng)濟價值或藥用價值，在我國的栽培面積較廣。據(jù)統(tǒng)計，2019年我國側(cè)耳類食用菌的產(chǎn)量達600 萬t[7]，并逐年上升，主要栽培種有糙皮側(cè)耳Pleurotus ostreatus（Jacq.）P.Kumm.、肺形側(cè)耳（鳳尾菇）P.pulmonarius（Fr.）Quél.、金頂側(cè)耳P.CitrinopileatusSinger、囊狀側(cè)耳P.cystidiosusO.K.Mill.，扇形側(cè)耳P.flabellatusSacc.、美味側(cè)耳P.SapidusQuél.和阿魏側(cè)耳P.eryngiivar.Ferulae（Lanzi）Sacc.等。部分側(cè)耳屬真菌可以專性產(chǎn)毒，在防治線蟲中具有重要應(yīng)用價值[8-11]。同時側(cè)耳科真菌多數(shù)為木腐菌，有利于維持生態(tài)平衡，促進環(huán)境修復(fù)[12-13]。根據(jù)真菌索引統(tǒng)計，側(cè)耳科真菌有900 多種（包括變種、亞種等），其中側(cè)耳屬758 種，亞側(cè)耳屬192 種[14]，而我國僅有50 余種。筆者對采自內(nèi)蒙古自治區(qū)賽罕烏拉自然保護區(qū)樺樹上的2 個野生側(cè)耳菌株采用形態(tài)學(xué)與ITS 測序相結(jié)合的方法進行分類鑒定，為食用菌品種的鑒別、菌種的純化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試標(biāo)本來源

供試標(biāo)本CFSZ 10112和CFSZ 10286由劉鐵志、田慧敏、趙艷龍、萬威、吳晶等于2013年8月15日采自內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗賽罕烏拉國家級自然保護區(qū)（東經(jīng)118°18'～118°55'，北緯43°59'～44°27'），同時拍攝彩色生境照片，晾干后制成干標(biāo)本存放于赤峰學(xué)院菌物標(biāo)本室（CFSZ）。

1.2 形態(tài)鑒定

觀察新鮮子實體形狀、顏色、附屬物、菌褶著生方式、菌柄等并測量其大小，顏色主要依據(jù)采集時拍攝的彩色照片判斷；宏觀特征以觀察2 個以上子實體為依據(jù)，顯微結(jié)構(gòu)觀察擔(dān)孢子、擔(dān)子、囊狀體、子實層菌絲，菌蓋表皮菌絲等結(jié)構(gòu)。孢子大小以不同孢子的長寬范圍為依據(jù)，將標(biāo)本的菌褶、菌蓋表皮等組織做成徒手切片（通常以4%～5%KOH 溶液作為浮載劑）。孢子測量25～30 個，其他結(jié)構(gòu)測量10～20 個，然后進行形態(tài)學(xué)分類鑒定，用顯微照相系統(tǒng)（Olympus BX53）拍攝顯微結(jié)構(gòu)。

1.3 ITS測序鑒定

1.3.1 基因組DNA的提取、PCR擴增及測序

干品子實體菌蓋部分經(jīng)研磨稱量30 mg 后，按照參考文獻[15]完成PCR 擴增反應(yīng)，正向引物和反向引物為ITS1/ITS4 引物[16]。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)Takara膠純化試劑盒（大連寶生物工程有限公司）純化回收后委托上海生工生物科技有限公司完成測序。

1.3.2 ITS序列比較和系統(tǒng)發(fā)育分析

將已測序列在GenBank 和UNITE 數(shù)據(jù)庫中進行Blast 比對，從結(jié)果中挑選出同源性較高的ITS 序列，采用軟件MEGA5.1構(gòu)建發(fā)育樹，比較親緣關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，CFSZ10112 為肺形側(cè)耳Pleurotus pulmonarius（Fr.）Quél.，CFSZ10286 為暗藍(lán)亞側(cè)耳Hohenbuehelia atrocoerulea（Fr.）Singer。

2.1.1 CFSZ10112標(biāo)本特征

擔(dān)子果叢生，菌蓋直徑為1.8～7.0 cm，扇形（腎形、倒卵形），不黏，灰白色、白色或米白色；邊緣色淺，表面光滑，邊緣有時稍內(nèi)卷，成熟后呈波浪狀。菌褶白色，延生，不等長，干后米白色。菌柄短或無，（0.6～2.0）cm ×（1.0～1.5）cm，側(cè)生，白色；基部有白色短絨毛（圖1a）。

孢 子（7.5～10.0）μm×（3.0～5.0）μm，（Q=1.95～2.77，Q=2.53±0.39），長橢圓形或圓柱形，常有小尖，光滑，無色，非淀粉質(zhì)（圖1b、d）。擔(dān)子（19.2～29）μm×（5.0～7.2μm），棒狀，4 個小梗，較細(xì)，長2.5～4.0μm，梗徑小于0.5μm，無色（圖1c），擔(dān)子基部具鎖狀聯(lián)合。菌絲直徑5.0～8.4μm，無色透明，薄壁，具隔膜，鎖狀聯(lián)合多（圖1d），菌髓菌絲不規(guī)則排列。菌蓋表皮由無色菌絲組成，薄壁，分枝多，具較多鎖狀聯(lián)合，似菌褶菌絲，菌絲直徑4.8～7.2μm（圖1e），菌蓋菌絲無色。菌柄表皮有排列整齊的無色菌絲組成。

圖1 CFSZ10112標(biāo)本子實體形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)

2.1.2 CFSZ10286標(biāo)本特征

擔(dān)子果疊生，菌蓋直徑為1.7～2.6 cm，扇形（半圓形、腎形），表面黃褐色、深棕色至灰棕色，邊緣色淺（黃棕色），表面密被灰褐色、暗棕綠色短絨毛，蓋緣處絨毛少，邊緣內(nèi)卷或波浪狀（圖2a），菌褶白色，干后米白色，稀，每毫米2～3 片，延生，不等長；菌柄無，菌褶延伸至假菌柄，長度0.5～1.0 cm（圖2b）。菌肉白，兩層，上層為灰色，下層為白色菌肉，孢子印白色。

擔(dān)孢子（5.7～8.2）μm×（3.1～4.6）μm，（Q=1.95～2.77，Q=2.53±0.39），長橢圓形，臘腸形，有小尖，光滑，無色，非淀粉質(zhì)（圖2c）；擔(dān)子（14.6～45.6）μm×（4～5.3）μm，棒狀，四個小梗，擔(dān)子基部未見鎖狀聯(lián)合，褶側(cè)囊狀體多，（31.5～67.2）μm×（10.0～12.5）μm，壁厚，梭形、紡錘形或腹鼓形，有的頂端具有無色透明顆粒狀結(jié)晶帽狀結(jié)構(gòu)（圖2d、e）。褶緣囊體棒狀，（19～35）μm×（5.5～8.0）μm，子實層菌絲無色透明，壁薄，具隔膜，具鎖狀聯(lián)合且多，5.0～8.4μm（圖2f），菌髓菌絲凝膠化，無色，具鎖狀聯(lián)合。菌蓋表皮由頂端淺黃色菌絲組成，密集處呈棕色，菌絲直徑為4.8～6.2μm，壁薄，無色，有隔膜，頂端鈍圓，漸變窄（圖2g）；菌柄表皮有排列整齊的無色菌絲組成。

圖2 CFSZ10286標(biāo)本子實體形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)

2.2 rDNA-ITS測序鑒定結(jié)果

經(jīng)檢測CFSZ10112 長度為676 bp（登錄號為KR086878、KR086879）；CFSZ10286 為667 bp（登錄號為KR082882）。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

以Tricholoma matsutake作為外群，對CFSZ 10286、CFSZ 10112 兩個標(biāo)本的ITS 序列及相似序列等21 個ITS 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果聚為三類，第一組為側(cè)耳屬Pleurotus，第二組為亞側(cè)耳屬Hohenbuehelia，第三組為扇菇屬Panellus、小香菇屬Lentinellus，CFSZ10112與P.pulmonarius（Fr.）Quél.及Lentinus sajor-caju（Fr.）Fr.聚為一類，CFSZ 10286與H.reniformis（G.Mey.）Singer、H.grisea（Peck）Singer、H.atrocoerulea（Fr.）Singer 聚為一類，結(jié)合形態(tài)特征將CFSZ10112 鑒 定 為肺 形 側(cè) 耳P.pulmonarius（Fr.）Quél.，CFSZ 10286 鑒定為暗藍(lán)亞側(cè)耳H.atrocoerulea（Fr.）Singer。

表1 與供試側(cè)耳2個標(biāo)本ITS序列相似的序列

圖3 供試標(biāo)本及來自Genbank的最相似物種的ITS序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

3 小結(jié)

CFSZ10112 與 糙 皮 側(cè) 耳P.ostreatus（Jacq.）P.Kumm.、白側(cè)耳P.albellus形態(tài)上相似，但糙皮側(cè)耳子實體覆瓦狀疊生，淺灰色，褐灰色，而該標(biāo)本菌蓋灰白色或米白色，白側(cè)耳P.albellus具有較大白色或米白色菌蓋，最大直徑可達11 cm[5，17]，但供試標(biāo)本菌蓋顏色淺黃褐色或肉色。分子水平分析結(jié)果，肺形側(cè)耳Pleurotus pulmonarius與Lentinus sajor-caju相似度為99%以上，而L.sajor_caju、P.sajor_caju與P.pulmonarius是同物異名[18]，是同一種，因此將CFSZ10112鑒定為肺形側(cè)耳Pleurotus pulmonarius（Fr.）Quél.。

分子水平分析表明，標(biāo)本CFSZ 10286 與H.reniformis（G.Mey.）Singer、H.grisea（Peck）Singer、H.atrocoerulea（Fr.）Singer相似度高（99%），較難區(qū)分，而H.grisea有長1.0～1.5 cm 的菌柄，有較多結(jié)晶的蓋囊體[5，19]，CFSZ 10286 無此特征。H.reniformis菌蓋被白色或灰白色細(xì)絨毛，孢子較大（10～14）μm ×（5～6）μm[5]，而CFSZ 10286 菌蓋被灰褐色、暗棕綠色短絨毛，孢子（5.7～8.2）μm×（3.1～4.6）μm，綜合其他特征將CFSZ 10286 鑒定為暗藍(lán)亞側(cè)耳H.atrocoerulea（Fr.）Singer；該種可食，同時含有灰側(cè)耳素，具有抗菌作用，對線蟲具有防治效果[5，20]，具有潛在經(jīng)濟價值，我國僅分布于海南省，為內(nèi)蒙古新記錄種。

研究結(jié)果為我國側(cè)耳科真菌的分布及資源現(xiàn)狀做了重要補充，對我國菌物資源生物多樣性研究和可食用菌開發(fā)利用提供依據(jù)。