高良姜多糖提取工藝的優(yōu)化及抗氧化活性研究

王 藝，劉思思，張彤赫，黃儒強

（華南師范大學生命科學學院，廣東廣州 510631）

高良姜生長于熱帶、亞熱帶地區(qū)，為姜科植物，別名風姜、小良姜、良姜等，在我國的廣東、廣西、海南等地都有分布[1]，其干燥根莖可以入藥，為藥食同源植物之一[2]，并且營養(yǎng)成分豐富?，F(xiàn)代藥學研究表明高良姜具有抗菌、抗氧化、散寒止痛等功效[3]。

近年來，多項研究結(jié)果顯示，許多植物多糖具有多種生物活性[4]，如免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、降血脂和護肝等作用[5]。植物多糖可通過激活超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等抗氧化酶來有效地清除自由基[6]。研究發(fā)現(xiàn)，羅平小黃姜多糖清除DPPH 自由基的IC50為0.96 mg/mL[7]；生姜多糖清除DPPH 自由基的IC50值可達0.42 mg/mL[8]；大高良姜多糖質(zhì)量濃度與抗氧化能力呈相關性，其IC50分別為2.21 mg/mL 和2.15 g/mL[9]；高良姜多糖清除DPPH自由基有效質(zhì)量濃度（EC50） 為0.59±0.01 mg/mL，清除羥自由基EC50為0.05±0.003 g/L，螯合鐵離子能力的EC50為2.75±0.20 g/L[10]。

選取熱水提取法浸提高良姜多糖，以響應面法對提取工藝進行優(yōu)化，在此基礎上，以清除DPPH自由基及ABTS 自由基的能力和還原力為指標評價高良姜多糖的抗氧化活性。旨在充分開發(fā)利用這一寶貴的藥食兩用保健植物，為豐富發(fā)掘應用高良姜資源提供更多的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥高良姜根莖，購自農(nóng)貿(mào)市場；葡萄糖標準品，上海源葉生物科技有限公司提供；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SFG-02B600 型電熱恒溫鼓風干燥箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；5804 R 型臺式高速冷凍離心機，艾本德中國有限公司產(chǎn)品；VIS-723N 型可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司產(chǎn)品；RE-52AAA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 高良姜粗多糖的提取與純化

（1） 粗多糖的提取。熱水提取法[11]：粉碎干燥的高良姜，60 目過篩，得干粉。稱取一定量的干粉，根據(jù)液料比加入定量的蒸餾水，恒溫振蕩器中提取一定時間，抽濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到一定濃度，然后進行醇沉，得粗多糖。

（2） 粗多糖除蛋白。采用Sevage 法[12]。

（3） 脫色。采用H2O2氧化法[13]。

1.3.2 多糖含量的測定

參考李承浩等人[14]的方法用苯酚- 硫酸法測定多糖含量。

1.3.3 高良姜粗多糖提取條件的優(yōu)化

（1） 單因素試驗。稱取5.0 g 高良姜粉末，考查料液比、提取溫度和提取時間對高良姜多糖提取率的影響，重復試驗3 次。

（2） 響應面法優(yōu)化試驗。以單因素試驗的結(jié)果為基礎，明確3 個因素變量的范圍，運用Desing Expert 10.0 軟件進行三因素三水平Box-behnken 試驗設計。每組做3 次平行試驗，取平均值。

響應面試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設計

根據(jù)公式擬合回歸方程，并對回歸方程進行方差分析。

1.3.4 抗氧化活性測定

（1） DPPH 自由基清除活性的測定。參考Huang X Q 等人[15]的方法。

（2） ABTS 自由基清除活性的測定。參考張乃珣等人[16]的方法。

（3） 還原力的測定。參考Oyaizu M[17]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 高良姜多糖提取條件的優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗結(jié)果分析

（1） 料液比對多糖提取率的影響。

料液比對多糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對多糖提取率的影響

由圖1 可知，高良姜多糖提取率在一定范圍內(nèi)與料液比呈正相關，可能是料液比的增大促進了多糖的溶出。但當料液比增至1∶40（W/V） 后，多糖的提取率增長趨于平緩，說明多糖大部分已溶出，此時提取過程已基本達到飽和。

（2） 提取溫度對多糖提取率的影響。

提取溫度對多糖提取率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對多糖提取率的影響

由圖2 可知，當提取溫度為50~90 ℃時，隨著提取溫度的升高，高良姜多糖提取率隨之明顯增大；而當提取溫度為90~100 ℃時，多糖提取率沒有明顯變化。

（3） 提取時間對多糖提取率的影響。提取時間對多糖提取率的影響見圖3。

由圖3 可知，當提取時間為1.0~3.0 h 時，高良姜多糖提取率隨時間增長顯著增高；提取時長超過3.0 h 后，多糖提取率增加不再明顯，此時多糖已基本完全提取。

圖3 提取時間對多糖提取率的影響

2.1.2 響應面試驗結(jié)果

根據(jù)試驗因素水平表設計試驗，每組試驗重復3 次，取平均值。

響應面試驗設計及結(jié)果見表2。

使用多元回歸擬合表2 試驗數(shù)據(jù)，得到料液比、提取溫度、提取時間及多糖提取率（Y）的回歸方程如下：

表2 響應面試驗設計及結(jié)果

回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析

該模型p＜0.000 1**達到極顯著水平，表明回歸方程模型具有高度顯著性；失擬項不顯著p=0.831 0（p＞0.05），表明該模型穩(wěn)定性較好；決定系數(shù)R2=0.989 4，表明高良姜多糖提取率約98.94%是由獨立變量決定的；校正決定系數(shù)R2Adj=0.975 8，變異系數(shù)CV=0.17%，表明該模型擬合度很高，能很好地模擬高良姜多糖真實提取率與各變量之間的關系。根據(jù)表3 回歸模型的系數(shù)進行顯著性分析可知，在一次項中X1達到顯著水平（p＜0.05），X2、X3達到極顯著水平；在平方項中，各回歸系數(shù)均達到極顯著水平，表明高良姜多糖的提取率與3 個因素之間存在明顯的二次關系；交互項中X1X2、X1X3均未達到顯著水平，而X2X3的回歸系數(shù)則達到了極顯著水平，說明提取時間與提取溫度的交互作用對多糖的提取率有較大影響。

根據(jù)擬合回歸方程，固定料液比、提取溫度和提取時間中的任意一個因素為零水平，做出2 組交互項的響應面圖，測驗其對高良姜多糖提取率的效用。

料液比與提取溫度的交互效應對高良姜多糖提取率影響的響應面見圖4，液料比與提取時間的交互效應對高良姜多糖提取率影響的響應面見圖5，提取溫度與提取時間的交互效應對高良姜多糖提取率影響的響應面見圖6。

圖4 液料比與提取溫度的交互效應對高良姜多糖提取率影響的響應面

圖5 料液比與提取時間的交互效應對高良姜多糖提取率影響的響應面

圖6 提取溫度與提取時間的交互效應對高良姜多糖提取率影響的響應面

由圖4 ~圖5 可知，提取溫度、提取時間與料液比交互作用的響應面曲面坡度較緩和，說明響應值受各變量變化的影響較小；提取時間與提取溫度交互作用的響應面曲面坡度較陡峭，隨著提取溫度的升高及提取時間的延長，多糖提取率呈現(xiàn)出先急劇增加后緩慢下降的趨勢，說明響應值受變量變化的影響較大。當提取溫度為90~100 ℃，提取時間為2.9~3.3 h 時，多糖提取率較高。這與表3 回歸模型系數(shù)所示含義相符合。

通過所得回歸模型對提取工藝進行優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件為料液比1∶40.71（W/V），提取溫度97.11 ℃，提取時間3.43 h，理論提取率為10.23%?？紤]實際操作情況，將最佳提取工藝修正為料液比1∶41（W/V），提取溫度97 ℃，提取時間3.5 h。在此修正條件下，實測提取率為10.28%，表明該回歸模型具有較可靠的預測性能，對于指導生產(chǎn)實踐具有一定的借鑒意義。

2.2 高良姜粗多糖純化結(jié)果（脫蛋白、脫色）

高良姜多糖經(jīng)Sevage 法脫蛋白后，按公式計算：

其脫色率為98.59%。

2.3 高良姜多糖抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH 自由基活性的檢測

自由基調(diào)節(jié)細胞生長，并抑制病毒和細菌，但體內(nèi)自由基增多（包括超氧陰離子、過氧化氫和NO） 會導致T 細胞損傷、免疫功能下降和衰老[18]。抗氧化劑有助于人體對抗由自由基損傷引起的氧化應激[19]。

高良姜多糖清除DPPH 自由基的能力見圖7。

圖7 高良姜多糖清除DPPH 自由基的能力

由圖7 可知，在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，高良姜多糖對DPPH 自由基的清除能力呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，且當質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時，清除率達到了90.0%。經(jīng)計算得高良姜多糖清除DPPH 自由基的EC50為1.412 mg/mL，由此可見高良姜多糖具有明顯清除DPPH 自由基的能力。

2.3.2 清除ABTS 自由基活性的檢測

高良姜多糖清除ABTS 自由基的能力見圖8。

圖8 高良姜多糖清除ABTS 自由基的能力

由圖8 可知，高良姜多糖對ABTS 自由基的清除能力具有劑量依賴性。在質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時，清除率最高為61.9%。計算得出高良姜多糖清除ABTS 自由基的EC50為4.33mg/mL。由此可知，高良姜多糖清除對ABTS 自由基清除能力較弱。多糖關于自由基的清除率可能與多糖的硫酸根含量、單糖組成和糖苷鍵類型有關[20]。研究發(fā)現(xiàn)，影響生物活性多糖抗氧化活性的各種因素包括多糖偶聯(lián)物，粗多糖提取物中的多糖混合物、多糖螯合離子，富含金屬離子的多糖、多糖的化學修飾和多糖的結(jié)構(gòu)特征等。

2.3.3 還原力的檢測

高良姜多糖還原力見圖9。

圖9 高良姜多糖還原力

由圖9 可知，在質(zhì)量濃度為0.05~1.50 mg/mL時，高良姜多糖的還原力與質(zhì)量濃度表現(xiàn)出良好的線性關系。當質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL 時，還原力最強，吸光度達到0.976。

3 結(jié)論

初步研究了高良姜多糖提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化作用。結(jié)果表明，采用響應面試驗模型能較好的優(yōu)化熱水提取法提取高良姜多糖工藝，得到的較優(yōu)工藝條件為料液比1∶41（W/V），提取溫度97 ℃，提取時間3.5 h，在該工藝下實測得多糖提取率為10.28%。高良姜多糖清除DPPH 自由基和ABTS 自由基的EC50分別為1.412 mg/mL 和4.33 mg/mL，在一定程度上均表現(xiàn)出濃度依賴性。而有關高良姜多糖的結(jié)構(gòu)鑒定及抗氧化活性機理有待進一步研究。