溶桿菌屬細(xì)菌鑒定及生防機(jī)制概況

王 娜，武坤毅，崔浪軍，章華偉

(1 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，藥用植物資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710062；2 浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

溶桿菌屬細(xì)菌鑒定及生防機(jī)制概況

王 娜1，武坤毅1，崔浪軍1，章華偉2

(1 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，藥用植物資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710062；2 浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

溶桿菌屬的大部分細(xì)菌具有重要的生防前景，因而受到了高度關(guān)注。為了明確目前溶桿菌屬細(xì)菌的研究現(xiàn)狀，分析了已報(bào)道的26種溶桿菌屬細(xì)菌的分布環(huán)境及典型的生化特征，基于16S rDNA序列相似性和脂肪酸組成構(gòu)建了26種溶桿菌屬細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并輔以DNA-DNA雜交結(jié)果進(jìn)行佐證，闡述了溶桿菌屬細(xì)菌對(duì)病原菌、線(xiàn)蟲(chóng)病害的生物防治物質(zhì)及其作用機(jī)理，并對(duì)其生物安全和應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

溶桿菌屬；細(xì)菌鑒定；DNA-DNA同源雜交；生物防治

溶桿菌屬(Lysobacterspp.)屬于變形桿菌門(mén)(Proteobacteria)、γ-變形菌綱(Gmmaproteobaeteria)、黃單胞菌目(Xanthomonadaceae)、黃單胞科(Xanthomonadaeeae)。早在1966年，有研究者發(fā)現(xiàn)，有1株細(xì)菌能產(chǎn)生堆囊黏菌素，這種堆囊黏菌素是一種吩嗪類(lèi)抗生素，對(duì)大多數(shù)細(xì)菌和真菌具有廣譜的抑制作用[1]。在此基礎(chǔ)上，1978年，Christensen等[1]在加拿大舉行的細(xì)菌分類(lèi)學(xué)大會(huì)上首次提出溶桿菌屬，該屬與假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、 寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、熱單胞菌屬(Thermomonas)和木桿菌屬(Xylella)等的親緣性較近[2]。目前已報(bào)道的溶桿菌屬的大多數(shù)細(xì)菌對(duì)病原真菌、G+細(xì)菌、線(xiàn)蟲(chóng)和綠藻均有突出的拮抗作用[3]。隨著近年來(lái)溶桿菌屬新種的不斷發(fā)現(xiàn)，該屬細(xì)菌在生物防治領(lǐng)域巨大的應(yīng)用前景受到高度關(guān)注。本研究就溶桿菌屬細(xì)菌的主要鑒定特征和生物防治病蟲(chóng)害機(jī)制的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為該屬細(xì)菌的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 溶桿菌屬細(xì)菌種類(lèi)

在溶桿菌屬提出之前，大部分細(xì)菌新種的分類(lèi)和鑒定是根據(jù)滑動(dòng)性和溶菌活性將具有相似表型的細(xì)菌分開(kāi)。1978年，Christensen等[1]發(fā)現(xiàn)了溶桿菌屬細(xì)菌，雖然其與黏細(xì)菌表型相似，但不具有黏細(xì)菌產(chǎn)生子實(shí)體的特征，且溶桿菌屬細(xì)菌DNA的G+C含量大于60%，而黏細(xì)菌DNA的G+C含量相對(duì)較低[3]。因此，溶桿菌屬作為一個(gè)新屬被提出。

溶桿菌屬自1978年命名以來(lái)，截至2012年底，在國(guó)際菌種鑒定權(quán)威雜志《國(guó)際微生物體系分類(lèi)學(xué)》(IJSEM)期刊上命名的溶桿菌屬細(xì)菌有26種[1,2,4-22]。如表1所示，在這26種溶桿菌屬細(xì)菌中，在韓國(guó)發(fā)現(xiàn)的有12種，在中國(guó)發(fā)現(xiàn)的有7種，其余7種分別在加拿大、印度和菲律賓被發(fā)現(xiàn)；這些細(xì)菌中除5株是在淡水、胡椒根系、水系沉積物、深海海綿和水稻根系中發(fā)現(xiàn)的外，其余21株均在不同類(lèi)型的土壤中被發(fā)現(xiàn)。這些土壤類(lèi)型包括濕度相對(duì)較大的溫室土壤和人參根際土壤、受強(qiáng)紫外線(xiàn)或地?zé)彷椛涞母稍锿寥?、金屬礦集區(qū)土壤、被厭氧細(xì)菌或百菌清嚴(yán)重污染的土壤，其中在濕度相對(duì)較大土壤中發(fā)現(xiàn)的種類(lèi)較多，說(shuō)明溶桿菌屬細(xì)菌在土壤中有廣泛的適應(yīng)性。

2 溶桿菌屬細(xì)菌的生化特征

溶桿菌屬菌株菌體呈桿狀，兩端鈍圓，單生，大小一般為(0. 2～0. 5) μm×(2～70) μm[23]，無(wú)鞭毛，但具有滑行能力，表面光滑有規(guī)則，好氧性強(qiáng)，革蘭氏染色陰性，無(wú)芽孢，能夠生長(zhǎng)的溫度為15～42 ℃，最適生長(zhǎng)溫度為25～40 ℃，大部分可以在TSA、NA和LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落顏色有奶油色、淡黃、黃色幾種[1,2,4-22]。細(xì)菌不同種之間的表型差異很小，僅憑形態(tài)學(xué)特征難以區(qū)分和鑒別，需要根據(jù)其生理生化指標(biāo)的差異進(jìn)行分析與鑒定。

綜合前人的研究成果[1,2,4-22]可知，G+C含量高(61.7%～70.7%)且含有輔酶Q-8是溶桿菌屬細(xì)菌的2個(gè)標(biāo)志性特征。其他特征還有：氧化酶(L.koreensis、L.ximonensis除外)、過(guò)氧化氫酶(L.daejeonensis、L.yangpyeongensis和L.panaciterrae除外)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；硝酸鹽還原性(L.daejeonensis、L.brunescens和L.defluvii除外)檢測(cè)結(jié)果為陰性；大部分能水解利用七葉樹(shù)素(L.daejeonensis、L.antibioticus、L.concretionis、L.niaboensis、L.niastensis和L.spongiicola除外)和明膠(L.korlensis除外)；α-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶等細(xì)菌代謝關(guān)鍵酶活力大部分檢測(cè)顯示陰性。溶桿菌屬細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求相對(duì)較低，碳源的利用范圍廣泛，能利用D-葡萄糖、D-樹(shù)膠醛醣、D-甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖等單糖，還可以利用麥芽糖等二糖以及糖原等多糖，也能利用其他碳源，如蘋(píng)果酸、檸檬酸鈉；但其中一部分細(xì)菌如L.dokdonensis、L.ruishenii和L.daecheongensis對(duì)碳源的利用情況尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。這些結(jié)果表明，用傳統(tǒng)的經(jīng)典分類(lèi)方法，僅僅依據(jù)形態(tài)特征和生理生化特性進(jìn)行溶桿菌屬種的確定是不夠的，因此還需要采用其他有效的分析手段對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)研究。

3 基于16S rDNA序列的溶桿菌屬細(xì)菌的進(jìn)化分析

由于細(xì)菌的全基因組數(shù)量迅速增加，利用比較基因組學(xué)能更清晰地分析基因組進(jìn)化。通過(guò)基因組分析可以識(shí)別噬菌體或其他具有DNA的區(qū)域，從而預(yù)測(cè)是否發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移，分析相關(guān)基因組之間的演變，也可說(shuō)明距離較遠(yuǎn)的發(fā)育相關(guān)細(xì)菌之間的關(guān)系[2]。16S rDNA基因大小1.5 kb 左右,含有高度保守的基因片段，同時(shí)在不同的菌株間也含有變異的核酸片段。通過(guò)對(duì)其序列的分析，結(jié)合完善的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以簡(jiǎn)單、快速地對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定，確定細(xì)菌在進(jìn)化中的位置，是細(xì)菌分類(lèi)學(xué)中非常重要的方法[24]。當(dāng)鑒定同源性較高的細(xì)菌時(shí)，可用其他方法作為補(bǔ)充。

對(duì)表1中26種溶桿菌屬細(xì)菌的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源比對(duì)，并用MEGA 4.0軟件包中的Kimura-2-parameter法計(jì)算遺傳距離，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，L.thermophilus和L.xinjiangensis分成2個(gè)單獨(dú)的分支，其他24株細(xì)菌分成了4個(gè)單獨(dú)但相關(guān)的集群。

由圖1可知，L.gummosus，L.antibioticus，L.capsici，L.niastensis，L.soli，L.enzymogenes，L.xinmonensis，L.dokdonensis，L.ginsengisoli，L.panaciterrae，L.brunescens和L.daecheongensis組成1個(gè)集群；L.daejeonensis，L.ruishenii，L.defluvii，L.spongiicola，L.concretionis和L.arseniciresistens組成1個(gè)集群；L.koreensis，L.niabensis，L.yangpyeongensis和L.oryzae組成1個(gè)集群；L.bugurensis和L.korlensis組成1個(gè)集群。26種溶桿菌屬細(xì)菌中，L.capsici與L.gummosus和L.antibioticus16S rDNA序列的相似百分率為100%，三者相似性最高；其次是L.daejeonensis與L.ruishenii，其16S rDNA序列相似百分率為98%，二者相似性較高。該系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)清楚地說(shuō)明了這26個(gè)溶桿菌屬細(xì)菌之間的親緣性關(guān)系。

目前，采用16S rDNA測(cè)序方法鑒定細(xì)菌親緣關(guān)系時(shí)主要依靠序列間的相似百分率。Bosshard等[25]將16S rDNA序列相似百分率大于99%的細(xì)菌定義為同種內(nèi)的不同亞種，相似性在95%～99%的則定義為屬內(nèi)相關(guān)的種。但隨著細(xì)菌基因組測(cè)序的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)16S rDNA序列相似百分率即使達(dá)到99%以上，在分類(lèi)學(xué)上也可能屬于不同的種[26]，說(shuō)明對(duì)細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)分類(lèi)鑒定不能采取單一的標(biāo)準(zhǔn)。如L.capsici與L.gummosus和L.antibioticus的 16S rDNA序列相似百分率為100%，三者之間同源性很高，但為不同的種。因此，必須同時(shí)結(jié)合DNA同源雜交、形態(tài)特征、生理生化特征、脂肪酸含量測(cè)定等多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，才能給予溶桿菌屬新種準(zhǔn)確的鑒定結(jié)論[27]。

4 基于脂肪酸組成的溶桿菌屬細(xì)菌的聚類(lèi)分析

脂肪酸具有結(jié)構(gòu)多樣性和較高的生物學(xué)特異性，是特別有效的生物標(biāo)記物[28]。通過(guò)微生物脂肪酸的組分來(lái)鑒定微生物的種屬，分析微生物的多樣性，是一種簡(jiǎn)便、可靠的分析方法。根據(jù)26種溶桿菌屬細(xì)菌脂肪酸含量的百分比可知，溶桿菌屬細(xì)菌標(biāo)志性的脂肪酸主要是iso-C15:0、iso-C16:0和iso-C17:1ω9c，其中iso-C15:0的含量相對(duì)最高。根據(jù)26種細(xì)菌的脂肪酸含量，用SPSS 18.0中的聚類(lèi)分析(Hierarchicalcluster)以類(lèi)間平均連鎖法(Between-groups linkage)進(jìn)行聚類(lèi)，通過(guò)平均距離法制圖，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可見(jiàn)，全部26種細(xì)菌聚為一類(lèi)時(shí)，類(lèi)合并距離尺度為25；在距離尺度僅約為10時(shí)可分為4類(lèi)，其結(jié)果與基于16S rDNA序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分類(lèi)結(jié)果保持相對(duì)較高的一致性，這與前人在其他革蘭氏陰性菌中的研究結(jié)果[28]一致。在這26種細(xì)菌中，L.ruishenii與L.ginsengisoli為2個(gè)單獨(dú)的分支，L.gummosus、L.panaciterrae、L.soli、L.niastensis、L.daecheongensis、L.enzymogeneL.capsici和L.antibioticus組成1個(gè)集群，L.bugurensis和L.korlensis組成1個(gè)集群，其余的組成1個(gè)集群。

由圖2還可知，具有相似脂肪酸組成的細(xì)菌聚合為單一集群，這些細(xì)菌來(lái)自相近的環(huán)境，其16S rDNA序列具有較近的“親緣關(guān)系”(圖1)。如L.daejeonensis、L.yangpyeongensis、L.dokdonensis等均分離自相對(duì)潮濕的土壤，這些細(xì)菌在16S rDNA序列相似性和脂肪酸組成上保持高度一致。此外，均分離自中國(guó)干旱地?zé)嵬寥乐械腖.xinjiangensis和L.thermophilus等細(xì)菌之間，也存在16S rDNA序列相似性和脂肪酸組成保持高度一致的現(xiàn)象。以上結(jié)果有力地說(shuō)明，環(huán)境因素極可能對(duì)脂肪酸組成造成影響，相似環(huán)境下的細(xì)菌具有更為相似的脂肪酸組成。

5 溶桿菌屬細(xì)菌的DNA-DNA同源性雜交鑒定

細(xì)菌分類(lèi)學(xué)上不同物種之間能進(jìn)行DNA同源雜交，其基本原理是用DNA解鏈的可逆性和堿基配對(duì)的專(zhuān)一性，將不同來(lái)源的DNA在體外加熱解鏈，并在合適條件下使互補(bǔ)的堿基重新配對(duì)，測(cè)算雜交百分?jǐn)?shù)。百分?jǐn)?shù)越高，雜交的2個(gè)DNA堿基線(xiàn)性序列的同源性就越高，說(shuō)明其親緣關(guān)系就越近[29]。因此通過(guò)DNA同源雜交鑒定物種之間的親緣關(guān)系，是細(xì)菌鑒定中最為重要的證據(jù)。按照國(guó)際分類(lèi)委員會(huì)的建議，將DNA同源性70%作為定種的界限，即同源性≥70%為同一個(gè)種群，同源性<70%為不同種群[28]。例如通過(guò)DNA同源雜交鑒定溶桿菌屬新菌株L.ginsengisoliGsoil357T、L.daecheongensisDae08T和L.spongiicolaKMM329T，結(jié)果表明L.ginsengisoliGsoil357T與L.gummosusDSM6980T、L.antibioticusDSM2044T之間的DNA同源性分別為16.3%和16.2%[19]，L.daecheongensisDae08T與L.brunescensDSM6979T之間的DNA同源性為28%[15]，L.spongiicolaKMM329T與L.concretionisKCTC12205T之間的DNA同源性為48%[9]，因此鑒定L.ginsengisoliGsoil357T、L.daecheongensisDae08T和L.spongiicolaKMM329T為溶桿菌屬中獨(dú)立的種。但最新的研究表明，即使溶桿菌屬2種細(xì)菌的16S rDNA序列相似率達(dá)到99%以上，二者基因組DNA雜交同源性百分?jǐn)?shù)也可能遠(yuǎn)在70%以下[30-31]，而且其生理生化指標(biāo)、細(xì)胞化學(xué)組分等方面的特征也有明顯的差異，在分類(lèi)鑒定中可命名為不同的種，這對(duì)于新種的確定和細(xì)菌不同種的鑒定提供了準(zhǔn)確、快速、有效的證據(jù)[27]。如1978年，Christensen 和Cook 提出了L.enzymogenes細(xì)菌的亞種，命名為L(zhǎng).enzymogenes，但此亞種的名稱(chēng)在細(xì)菌命名中一直未得到批準(zhǔn)，該名稱(chēng)的術(shù)語(yǔ)也未被驗(yàn)證[5]。最新研究報(bào)道表明[26]，此亞種細(xì)菌L.enzymogenesPAGU1119T與L.enzymogenesDSM2043T、L.capsiciYC5194T之間16S rDNA序列的相似率分別為97.2%和99.4%，全基因組DNA同源雜交百分?jǐn)?shù)分別為20.7%～26.1%和60.9%～62.0%，這說(shuō)明與L.enzymogenesDSM2043T細(xì)菌相比，L.enzymogenesPAGU1119T與L.capsiciYC5194T的親緣關(guān)系更近。但進(jìn)一步的試驗(yàn)分析表明，L.enzymogenesPAGU1119T與L.capsiciYC5194T的生化特征、脂肪酸含量等特征差異性較大[26]，因此Kawamura等[26]提出，將L.enzymogenesPAGU1119T視為溶桿菌屬1個(gè)獨(dú)立的新種，并重新命名為L(zhǎng).cookiisp.。

6 溶桿菌屬細(xì)菌的生防物質(zhì)及作用機(jī)理

已報(bào)道的溶桿菌屬的大多數(shù)細(xì)菌對(duì)許多病原菌有顯著的拮抗作用[3]。截至2012年底，溶桿菌屬26種細(xì)菌中，只有L.enzymogenesC3等少數(shù)幾種細(xì)菌的胞外主要抑菌物質(zhì)被分離得到，這些物質(zhì)主要有胞外酶、小分子化合物及生物表面活性劑和抗生素3大類(lèi)(表2)。

6.1 胞外酶

與其他生防菌相比，溶桿菌屬細(xì)菌能夠分泌幾丁質(zhì)酶、β-1, 3-葡聚糖酶等多種胞外酶。如L．enzymogenesC3、L.enzymogenesOH11能大量分泌幾丁質(zhì)酶，該酶通過(guò)水解病原真菌細(xì)胞壁抑制其增殖，從而提高植物的抗真菌能力[34]。L．a(chǎn)ntibioticusHS124、L.enzymogenesOH11分泌的β-1,3-葡聚糖酶通過(guò)催化細(xì)胞壁中的β-1, 3-葡聚糖多聚體水解,將其降解為葡萄糖，從而抑制真菌的生長(zhǎng)及增殖[47]。L.enzymogenes3.1T8分泌的α-水解蛋白酶能降解線(xiàn)蟲(chóng)體壁的蛋白質(zhì)，該蛋白酶由前肽區(qū)(Pro)和蛋白酶區(qū)(Alp)組成，其中前肽區(qū)參與該酶的正常折疊，影響其水解活性[36]。

6.2 小分子化合物

溶桿菌屬細(xì)菌分泌于胞外的活性小分子物質(zhì)主要包括HSAF、WAP-8294A2、Lysobactin、Cephabacins和Tripropeptins等，其中L.enzymogenesC3、L.enzymogenesOH11分泌的熱穩(wěn)定抗真菌因子(HSAF)對(duì)絲狀真菌和卵菌有顯著的抑制作用。HSAF對(duì)絲狀真菌的作用機(jī)制，主要是通過(guò)抑制真菌神經(jīng)酞胺合成酶活性，改變細(xì)胞膜中的鞘脂類(lèi)化合物的組成，最終導(dǎo)致靶標(biāo)真菌菌絲的去極化[48]。目前，這些活性小分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)基本都已被闡明。

此外，關(guān)于HSAF與WAP-8294A2生物合成關(guān)鍵調(diào)控基因的研究報(bào)道較多。其中留醇脫氫酶基因(Sterol desaturase，SD)是HSAF生物合成中的關(guān)鍵基因，SD基因催化3-deOH HSAF(3-dehydroxy HSAF)轉(zhuǎn)化為HSAF,且鐵氧化還原酶基因(Ferredoxin reductase，F(xiàn)NR)的參與能夠明顯增強(qiáng)SD基因的催化活性[49]。WAP-8294A2生物合成過(guò)程中需要酞基轉(zhuǎn)移酶(Acyl-CoA ligase,ACL)激活3-OH脂肪酸鏈和酞基轉(zhuǎn)移蛋白，且WAP-8294A2已進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)階段[50]。

6.3 生物表面活性劑、抗生素

L.enzymogenes3.1T8、L.enzymogenC3分泌的生物表面活性劑，對(duì)由立枯絲核菌引起的肯塔基藍(lán)草病害(PoapratensisL.)等具有顯著的抑制效果，其作用機(jī)制是該活性劑能阻止真菌孢子游動(dòng)及萌發(fā)，建立與細(xì)菌細(xì)胞之間的聯(lián)系，克服細(xì)胞之間的疏水阻力，降低病原菌游動(dòng)孢子的表面張力，在細(xì)胞膜內(nèi)外膨壓的作用下，使游動(dòng)孢子細(xì)胞破裂而死亡[46]。該屬的其他細(xì)菌如Lysobactersp.strain SB-K88和L.enzymogenes3.1T8能產(chǎn)生抗生素，抑制瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)與螺殼狀絲囊霉(A.cochlioides)引起的猝倒病[51]。雖然這些抗生素的結(jié)構(gòu)尚未得到完全解析，但初步的研究表明，這些抗生素的拮抗機(jī)理是使F-actin(肌動(dòng)蛋白)斷裂、游走孢子的超微結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞壁水解和包囊萌發(fā)受抑制等[44]。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，L.enzymogenesOH11可以產(chǎn)生一種黃色素的抗生素使其菌落顏色呈黃色，這些黃色素通過(guò)Ⅱ型聚酮合酶(PKS)合成，是細(xì)菌賴(lài)以生存的遮光劑[52]。

此外，L.enzymogenesC3可以誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生對(duì)鐮刀菌引起的赤霉病的抗性，對(duì)根腐離蠕孢孢子的萌發(fā)和葉點(diǎn)病也有很好的防治作用[53]。最新的研究顯示，L.enzymogenesC3有許多分泌物能引發(fā)動(dòng)物和植物病原菌G+的三型分泌系統(tǒng)[26]，該系統(tǒng)參與調(diào)控L.enzymogenesC3在靶標(biāo)真菌菌絲上的有效附著[54]，但其機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，尚有待進(jìn)一步闡明。雖然對(duì)該屬少數(shù)細(xì)菌的抑菌機(jī)理已有初步了解，但大部分抑菌物質(zhì)的代謝途徑及其詳細(xì)的抑菌機(jī)制仍不明確，還需深入研究。

7 溶桿菌屬細(xì)菌對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的生物防治作用

線(xiàn)蟲(chóng)體壁主要由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物組成，卵殼主要由膠原質(zhì)狀的蛋白圍繞脂蛋白所組成，而溶桿菌屬大部分菌株能分泌幾丁質(zhì)酶和蛋白溶解酶，故溶桿菌屬細(xì)菌對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)引起的病害能起到高效的防治作用。L.enzymogenesOH11對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)(M.incognita)的2齡幼蟲(chóng)及其卵化有強(qiáng)烈的抑制作用[46]。L.enzymogenesC3對(duì)爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)(M.javanica)的卵化無(wú)抑制作用，但對(duì)γ-輻照的卵能起到破壞作用，主要作用機(jī)制是細(xì)菌可以降解線(xiàn)蟲(chóng)卵殼的幾丁質(zhì)層[54]。最近的研究顯示，L.enzymogenesC3和L.antibioticus能有效防治甜菜囊腫線(xiàn)蟲(chóng)(HeteroderaschachtiiSchmidt)引起的白菜囊腫和大豆囊腫線(xiàn)蟲(chóng)(Heteroderaglycines)引起的大豆囊腫，而且L.enzymogenesC3還可以殺死植物寄生的成年、幼年線(xiàn)蟲(chóng)及培養(yǎng)的線(xiàn)蟲(chóng)[23]。

8 溶桿菌屬的生物安全性及應(yīng)用前景

應(yīng)用微生物菌劑進(jìn)行生物防治之前必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，應(yīng)權(quán)衡其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對(duì)環(huán)境危害的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)，以確定該生物菌劑對(duì)人體是否有害。溶桿菌屬就是一個(gè)很好的例子，其在環(huán)境中有很高的豐度，且是自然種群，很難受到人為控制。因此，在使用溶桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行生物防治之前，一定要先進(jìn)行嚴(yán)格的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[3]。

Christensen等[1]研究表明，溶桿菌屬具有獨(dú)特的滑動(dòng)性和溶菌活性，這些屬性使得溶桿菌屬細(xì)菌在生物防治病原菌和線(xiàn)蟲(chóng)方面具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。目前使用的對(duì)溶桿菌屬細(xì)菌的詳細(xì)介紹主要是2001年Christensen的描述。隨著溶桿菌屬新種不斷被發(fā)現(xiàn)，對(duì)其描述需要大量修改，而且溶桿菌屬細(xì)菌的一些特殊特征需要通過(guò)不同種之間的差異性進(jìn)行分析，所以必須基于DNA的檢測(cè)方法，結(jié)合選擇性培養(yǎng)才能更深入地了解溶桿菌屬細(xì)菌的形態(tài)特征、棲息地和多樣性[27]。

溶桿菌屬高效、廣譜的拮抗作用具有誘人的應(yīng)用前景，現(xiàn)已成為植物病害生防微生物的重要組成部分，但與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等其他生防菌相比，其研究還處于起步階段，對(duì)溶桿菌屬相關(guān)抗菌物質(zhì)及其抗菌機(jī)理尚不甚了解。近年來(lái)，現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)特別是分離純化、波譜學(xué)等技術(shù)的突破，為溶桿菌屬的進(jìn)一步研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)手段。因此，今后應(yīng)該從以下方面加強(qiáng)研究：首先，溶桿菌屬細(xì)菌數(shù)量很多，已發(fā)現(xiàn)的數(shù)量相對(duì)較少，需深入發(fā)掘具有廣譜抗菌性的新細(xì)菌，并在評(píng)價(jià)其安全性的基礎(chǔ)上，研究其生防潛力、作用機(jī)制，發(fā)掘其具有巨大生防前景的活性分子。其次，需深入研究已發(fā)現(xiàn)的具有顯著抗菌活性的小分子物質(zhì)的抑菌機(jī)理。陜西師范大學(xué)藥用植物資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在遠(yuǎn)志根際分離得到1株菌株，經(jīng)鑒定其為溶桿菌屬細(xì)菌，并命名為L(zhǎng).yananisissp.nov.[27]；經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，其胞外抗菌物質(zhì)主要為蛋白類(lèi)，在建立該菌胞外和胞內(nèi)蛋白雙向電泳圖譜的基礎(chǔ)上[55]，進(jìn)一步分離得到了枯草桿菌蛋白酶、α水解蛋白酶和β水解蛋白酶3種具有抑菌活性的蛋白質(zhì)，其抑菌效果更強(qiáng)的小肽類(lèi)物質(zhì)正在分離純化中。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，L.yanansis細(xì)菌具有較好的定殖能力，能在玉米根部表皮和韌皮部定殖，這為L(zhǎng).yanansis細(xì)菌生物防治機(jī)理的研究和開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)(相關(guān)結(jié)果另文發(fā)表)；此外，利用誘變育種、原生質(zhì)融合及轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行改良，以提高菌株的抑菌能力；加強(qiáng)細(xì)菌活性物質(zhì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，使其規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化，從而推動(dòng)其從實(shí)驗(yàn)室和溫室的小規(guī)模研究向大田試驗(yàn)邁進(jìn)。

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Advance in bacteria identification and biocontrol mechanism ofLysobacterspp.

WANG Na1,WU Kun-yi1,CUI Lang-jun1,ZHANG Hua-wei2

(1KeyLaboratoryofMedicinalPlantResourcesandNaturalPharmaceuticalChemistry(MinistryofEducation，SchoolofLifeSciences,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an，Shaanxi710062,China；2SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou,Zhejiang310014,China)

Widely attention has been paid toLysobacterspeciessince they can inhibit growth of pathogens.The distribution environment and typical biochemical characteristics of 26 reportedLysobacterspecies were analyzed and their phylogenetic tree was conducted based on 16S rDNA sequence similarity and fatty acid composition.DNA-DNA hybridization results were used as evidence.Then,the biological control of pathogenic bacteria and nematodes ofLysobacterspecies were discussed and the biosafety and application for biological control were introduced.

Lysobacter;bacteria identification;DNA-DNA hybridization;biological control

2013-12-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101481)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(GK261001237)

王 娜(1989-)，女，陜西寶雞人，碩士，主要從事藥用植物內(nèi)生菌的開(kāi)發(fā)與利用研究。E-mail：shxwangna@163.com

崔浪軍(1977-)，男，陜西神木人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥用植物內(nèi)生菌的開(kāi)發(fā)與利用研究。 E-mail：ljcui@snnu.edu.cn

時(shí)間:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.010

Q93-331

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