宏基因組二代測序技術(shù)在免疫功能低下肺部感染患者診斷中的應(yīng)用研究進展

考吾沙爾·巴合提江，夏宇，穆坎代斯·吐爾迪

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與呼吸危重中心二病區(qū)，烏魯木齊 830011

宏基因組二代測序（mNGS）是一種可同時獨立無偏移檢測數(shù)千至上億基因片段的檢測技術(shù)，其可以同步迅速檢測各類標本中的多種病原體，如細菌、病毒、真菌和寄生蟲等，在感染性疾病診斷中的臨床應(yīng)用越來越多。免疫功能低下患者包括接受長期或大劑量類固醇或其他免疫抑制藥物的患者、實體器官移植患者、過去5年需要化療的實體瘤患者或自診斷和接受治療以來的任何時間患有血液系統(tǒng)惡性腫瘤，以及患有原發(fā)性免疫缺陷的患者［1］。在免疫功能低下的肺部感染患者中，細菌性肺炎最多見，其次是病毒和侵襲性真菌感染，常規(guī)微生物檢測方法（CMTs）存在周期長、準確性有限等缺點，尤其在處理多種病原體混合感染、危重癥患者時，易出現(xiàn)診斷延遲或疏漏［2］。mNGS作為一種新的檢測手段，拓寬了病原體檢查的途徑和范圍，提高了檢測效率，從而幫助患者改善預(yù)后?，F(xiàn)就mNGS在免疫功能低下肺部感染患者診斷中的臨床應(yīng)用綜述如下。

1 mNGS在惡性血液病肺部感染患者診斷中的應(yīng)用

自體干細胞移植是某些血液系統(tǒng)惡性腫瘤的主要治療方法之一，在移植之前要進行大劑量的化療，因而會引發(fā)免疫功能低下，這也是該類患者發(fā)生較高治療相關(guān)并發(fā)癥及病死率的原因。肺部感染是自體干細胞移植中最常見的并發(fā)癥，占所有并發(fā)癥的60%［3］。在干細胞移植后，mNGS早期可起到鑒別肺部滲出病變是否為肺部感染的作用，晚期可迅速檢測出感染的病原體，而且mNGS檢測結(jié)果不受免疫抑制或粒細胞缺乏的影響［4］。

一項回顧性研究納入了71例造血干細胞移植后發(fā)熱患者，根據(jù)mNGS和CMTs結(jié)果確診54例肺部感染，比較mNGS與CMTs對肺部感染的診斷價值發(fā)現(xiàn)，mNGS總體敏感度高于CMTs，但特異度低于CMTs，考慮其原因可能與標本類型及mNGS測序序列數(shù)設(shè)置有關(guān)［4］。在mNGS檢測結(jié)果中，最多被識別到的病原體是病毒，其中巨細胞病毒（CMV）占比最高；其次是混合感染，以細菌—病毒混合感染最多。感染類型在移植的不同時期各不相同，但不論哪個時期，主要致病菌都是CMV， 血液中CMV DNA的熒光定量PCR是首選診斷方法， 但在免疫抑制狀態(tài)的患者中，有50%無法在血液中檢測到CMV DNA［5］，而血清抗體在這些免疫功能低下患者中可能是陰性或者不確定有沒有產(chǎn)生相應(yīng)抗體［6］。與CMTs比較，mNGS對CMV有更好的診斷效率，彌補了CMTs肺部CMV感染檢出率低的不足。對于高度懷疑病毒性肺炎且CMTs持續(xù)結(jié)果陰性患者，mNGS技術(shù)能為其診斷提供進一步的線索。

有研究發(fā)現(xiàn)，mNGS在血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者中有比CMTs更高的肺部感染檢測敏感性（87.3%vs34.5%）［7］。mNGS檢測結(jié)果顯示，血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者肺部感染最常見的細菌、病毒和真菌分別為肺炎鏈球菌、CMV和曲霉菌，最常見的混合感染類型是細菌—病毒、真菌—病毒。通過mNGS檢測結(jié)果，該研究中90.9%的肺部感染患者及時進行了合適抗菌藥物治療，30 d病死率為7.3%，這提示mNGS技術(shù)對于提高血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者抗菌藥物治療療效以及降低病死率具有積極意義。

研究顯示，肺部感染是血液病中性粒細胞減少伴發(fā)熱患者死亡的獨立危險因素［8］。ZHANG等［9］在抗生素治療失敗后伴有發(fā)熱性中性粒細胞減少癥的惡性血液病患者中檢測出192例重癥肺炎患者，使用mNGS技術(shù)聯(lián)合CMTs進行病原體檢測，發(fā)現(xiàn)mNGS和CMTs的病原體總檢出率分別為80%和25%，其中細菌檢出率分別為48%及9%、病毒檢出率分別為42%及12%、真菌檢出率分別為22%及4%。mNGS和CMTs檢測出的常見細菌、病毒和真菌種類是一致的，分別是葡萄球菌、CMV及曲霉菌；二者在混合感染中的檢測敏感度分別為80%和4%。該研究中，臨床醫(yī)生根據(jù)mNGS檢測結(jié)果對45%的患者調(diào)整了抗生素治療方案，并且有52%的患者癥狀得到有效緩解。

2 mNGS在實體器官移植肺部感染患者診斷中的應(yīng)用

急性器官移植后排斥反應(yīng)隨著免疫抑制劑的應(yīng)用顯著下降，但實體器官移植患者機會性感染的發(fā)生率及病死率仍然較高，其中以肺部感染最為多見。孟現(xiàn)林等［10］報道了35例在ICU治療的器官移植后感染肺炎患者，通過mNGS技術(shù)檢測出20例病毒性感染，而CMTs僅檢測出2例，提示mNGS在檢測敏感度上有明顯優(yōu)勢；mNGS對細菌的敏感度為93%，陰性預(yù)測值（NPV）為91%，其中銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌及肺炎克雷伯菌的檢出率較高。該研究中mNGS聯(lián)合CMTs后確診混合感染患者為23例，僅通過mNGS技術(shù)診斷出21例患者為混合感染。對于真菌，mNGS沒有體現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，比如，CMTs在檢測白色念珠菌及熱帶念珠菌方面顯示出一定優(yōu)勢，而mNGS對曲霉菌的檢出率更高，這可能與mNGS技術(shù)核酸提取時破壁困難引起的低序列有關(guān)。因此，mNGS可以作為ICU住院的器官移植患者病毒及細菌感染的常規(guī)診斷方法，但在真菌鑒定中，mNGS和CMTs均有各自優(yōu)勢， 目前大部分學(xué)者也認為mNGS在檢測細菌方面其性能優(yōu)于CMTs，但在真菌檢測方面遜于 CMTs［10］。

對于肺移植后早期感染患者，mNGS診斷肺部感染的檢出率顯著高于CMTs（97.14%vs68.57%），并且mNGS具有更高的NPV（83.33%），有助于排除感染，從而協(xié)助臨床方案的選擇。在51份肺泡灌洗液（BALF）標本中，mNGS鑒定出148種病原體，體現(xiàn)了其檢測范圍廣泛的獨特優(yōu)勢。其中，細菌有94種（68%），最常見的細菌是葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌；鑒定出的真菌和病毒在綜合評估后被認為是定植菌。所以，臨床醫(yī)生需結(jié)合mNGS、CMTs、流行病學(xué)史和臨床特征后綜合判斷致病病原體。在臨床中，器官移植后早期很難區(qū)分感染與急性排斥反應(yīng)。研究顯示，器官移植早期mNGS檢測陰性結(jié)果對肺部感染鑒別診斷有輔助作用。尤其對于嗜肺軍團菌、膿腫分枝桿菌等非典型病原體，mNGS檢測具有絕對優(yōu)勢。根據(jù)mNGS和CMTs結(jié)果可以對62%的患者調(diào)整抗生素治療方案，從而使患者病情明顯好轉(zhuǎn)［11］。除了上述BALF的標本以外，血標本可以成為另一種替代選擇，尤其是在病因不明的無法選擇支氣管鏡檢查的肺部感染中［12］。

3 mNGS在先天性免疫缺陷肺部感染患者診斷中的應(yīng)用

先天性免疫缺陷（IEI）是由單基因突變引發(fā)的一種遺傳性疾病，肺部感染是IEI患者反復(fù)住院和最終死亡的主要原因［13］。在一項前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，IEI患者急性感染住院率為85%，雖然在早期會預(yù)防性使用抗感染治療，但仍有40%的患者病情無法得到控制，而且有藥物相關(guān)毒性反應(yīng)和抗病毒耐藥性的風(fēng)險發(fā)生［14］。因此，及時有效識別并進行抗感染治療對于降低感染相關(guān)病死率具有重要意義。

CMV是常見的機會性病原體，幾乎所有IEI患者都會感染CMV，CMV感染是IEI患者進行移植前后感染發(fā)病率及病死率的獨立危險因素［15］。TANG等［14］研究了15例IEI疑似肺部感染患者，發(fā)現(xiàn)CMTs和mNGS檢測結(jié)果一致率為73.3%，而細菌培養(yǎng)法與mNGS的一致性僅為33.3%，可能因為患者早期接受經(jīng)驗性抗菌藥物治療降低了細菌培養(yǎng)法的檢出率。mNGS與臨床診斷的陽性一致性顯著高于CMT和培養(yǎng)法（分別為93.75%、68.75%和31.25%）。先天性免疫缺陷患者更易感染機會性病原體和非典型病原體，而這些病原體很難通過傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)法、PCR、血清抗體等CMTs鑒定出來。mNGS能夠迅速、精準、全面的識別病原體，對抗生素治療方案的選擇及調(diào)整有很大幫助，也對排除感染和減少抗菌藥物濫用具有重要價值。

4 mNGS在艾滋病肺部感染患者診斷中的應(yīng)用

機會性感染是艾滋病患者的主要死因之一，在艾滋病患者中，肺部感染發(fā)生率為70%。XU等［16］使用mNGS檢測了46例艾滋病患者疑似機會性感染的病原體，結(jié)合mNGS、CMTs和臨床表現(xiàn)后確診33例為機會性感染，通過mNGS技術(shù)檢測出JC病毒和惠普萊毛蕨等特殊病原體，但CMTs未能鑒定出這些特殊病毒和非典型病原體。mNGS對真菌、非結(jié)核分枝桿菌和病毒的檢測敏感度分別為90.91%、100%及100%，相應(yīng)特異度也較高（分別為74.29%、86.67%及91.11%），而對于真菌檢測敏感度較其他研究［17］明顯增高，這可能是由于該研究的樣本量較小造成的。mNGS及CMTs兩種診斷方法對其他病原體（細菌、結(jié)核分枝桿菌、病毒等）檢出率沒有顯著差異；混合感染患者的CD4+T淋巴細胞計數(shù)明顯低于單一感染患者，提示CD4+T淋巴細胞減低患者更容易發(fā)生混合感染，所以mNGS可能對CD4+T淋巴細胞計數(shù)低的患者更有診斷價值。在鑒別非感染性病因中，mNGS檢測結(jié)果能夠起到提示性作用，如1例艾滋病患者淋巴結(jié)活檢確診為卡波氏肉瘤，mNGS在淋巴結(jié)組織中也檢出皰疹病毒8型，對最終確診有較好的提示意義［16］。

多項關(guān)于艾滋病患者中罕見病原體感染的病例報告，如利什曼原蟲、巴爾通體、剛地弓形蟲等，均是通過mNGS鑒定確診的［17］。因此，在臨床上對于多次CMTs結(jié)果陰性且多次經(jīng)驗性抗感染治療無效患者推薦使用mNGS檢測方法，對早期鑒定病原體后及時調(diào)整治療方案，進一步改善臨床預(yù)后及降低病死率有幫助。mNGS有望成為艾滋病患者一線診斷方法，但檢測到的病原體可能不是真正的致病病原體，可能是污染或定植菌，因此最好的診斷策略是mNGS和CMTs結(jié)合綜合評估。

綜上所述，肺部感染是各類免疫功能低下患者發(fā)病率與病死率的較高重要原因之一，及時準確的病原學(xué)診斷對這些患者極其重要。mNGS在檢測免疫抑制患者感染性病原體中具有巨大的診斷潛力，在未來可能成為補充常規(guī)診斷方法的寶貴工具，尤其在CMTs不能及時明確病原體種類時。