反相高效液相色譜法測定發(fā)酵乳中赤蘚紅含量

陳 靜，段國霞，劉麗君，李翠枝*，呂志勇

（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

赤蘚紅，又名櫻桃紅，是一種人工合成著色劑，由熒光素碘化而成，其性質(zhì)穩(wěn)定、色彩鮮艷、成本低廉。目前，赤蘚紅的應(yīng)用很廣泛[1-4]，其作為常見的人工食品添加劑已成為人們?nèi)粘Ｏ钠返囊徊糠諿5]，可單獨(dú)使用或與其他食用色素復(fù)配使用，經(jīng)常添加于食品、藥品、化妝品中，也可以作為反應(yīng)劑[6]等應(yīng)用于各類研究中。GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[7]對其使用量有嚴(yán)格規(guī)定，并建立了相應(yīng)的國標(biāo)方法[8]進(jìn)行檢測，但對于赤蘚紅的檢測方法為液-液萃取法，操作方法復(fù)雜，且方法適用基質(zhì)有限。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道，赤蘚紅應(yīng)用的基質(zhì)很廣，食品類包括：蛋糕[9]、酒類[10]、飲料[11-12]、冷凍飲品[13]、肉制品[14]、罐頭[15]、糯米類[16-17]、蜜餞[18]、辣椒粉[19]等；藥品包括：中藥類[20-21]、西藥類[22]、藥品包裝[23-24]等；其他類包括：煙草類[25-27]等。其檢測方法也有很多，如高效液相色譜法[28]、超高效液相色譜法[29]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[30-31]、共振瑞利散射法等其他方法[32-33]。但對發(fā)酵乳中赤蘚紅的測定還少有報道。發(fā)酵乳中一般不添加赤蘚紅，對于含有果醬、果泥、果粒等的果品發(fā)酵乳會有一定的帶入風(fēng)險，對產(chǎn)品質(zhì)量控制和風(fēng)險控制產(chǎn)生潛在風(fēng)險。

本研究擬建立發(fā)酵乳中赤蘚紅的反相高效液相色譜檢測方法。采用酶法水解蛋白，無水乙醇提取，堿性條件下固相萃取小柱凈化富集，經(jīng)反相C18柱分離，紫外可見檢測器檢測，保留時間定性，外標(biāo)法定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵乳 市售。

甲醇（色譜純）（諾爾施） 成都市科隆化學(xué)品有限公司；無水乙醇（色譜純） 福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；氨水（優(yōu)級純） 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；乙酸銨（優(yōu)級純） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；氫氧化鈉（分析純） 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)品（純度85.7%） 德國Dr.Ehrensorfer公司；木瓜蛋白酶（酶活力2 000 U/mg） 上海泰坦科技股份有限公司；HLB固相萃取小柱（3 cc，60 mg） 美國Waters公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀（配備紫外檢測器） 美國安捷倫公司；AL204分析天平、PE20K pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器 常州市凱航儀器有限公司；KQ-600DB數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；3K30高速離心機(jī) 德國Sigma公司；TurboVap LV氮?dú)鉂饪s裝置 美國Biotage公司；0.45 μm微孔過濾器 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 流動相溶液配制

乙酸銨溶液（20 mmol/L，pH 6.5）：稱取1.542 g乙酸銨于800 mL超純水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至6.5，用超純水定容至1 000 mL。

體積分?jǐn)?shù)5%氨化甲醇溶液：量取甲醇95 mL、氨水5 mL混勻。

氫氧化鈉溶液（20 g/L）：稱取2 g氫氧化鈉，加水至100 mL，溶解混勻。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.00 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取按其純度折算為100%質(zhì)量的赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)品0.100 g，置于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度。

赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 μg/mL）：準(zhǔn)確移取赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。

赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)工作液：上述混合中間液用水分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL的工作液。現(xiàn)用現(xiàn)配。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行色譜測定，記錄各組分的色譜峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取試樣1.0 g（精確至0.000 1 g）于10 mL容量瓶，加入0.04 U木瓜蛋白酶，加水至約3 mL，60 ℃水浴30 min[34]。酶解后的試樣自然冷卻至室溫，使用無水乙醇定容至10 mL，振蕩搖勻，超聲30 min，于4 ℃、8 000 r/min離心5 min。取上清液5 mL，使用20 g/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 7.5～7.7。上述前處理溶液加入活化好的HLB小柱（分別使用5 mL甲醇、5 mL水活化），速率為1 滴/s，待液體全部留出，用水洗滌，然后用6 mL 5%氨化甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，于氮吹濃縮儀上60 ℃吹干，加入1.0 mL水溶解，搖勻后上機(jī)。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：月旭-AQ C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：20 mmol/L乙酸銨緩沖鹽（pH 6.5）-甲醇體系，梯度洗脫程序如表1所示；檢測器波長520 nm；進(jìn)樣量30 μL；柱溫40 ℃；流速1 mL/min。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

1.3.5 結(jié)果計(jì)算

將試樣溶液進(jìn)行色譜測定，記錄各組分的色譜峰面積。按照下式計(jì)算樣品中赤蘚紅的含量。

式中：X為樣品中赤蘚紅含量/（mg/kg）；ρ為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的試樣中赤蘚紅質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為定容體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.6 回收率和精密度測定

回收率測定：在空白發(fā)酵乳中分別添加不同量的赤蘚紅，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別平行測定6 次，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

精密度測定：對發(fā)酵乳加標(biāo)樣品分別進(jìn)行6 次重復(fù)測定，并計(jì)算RSD。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件進(jìn)行處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法優(yōu)化

2.1.1 加酶量的選擇

一般合成著色劑與蛋白質(zhì)的相互作用力通常被認(rèn)為是非共價鍵作用，包括氫鍵、范德華力、疏水及靜電作用等[35]，使用木瓜蛋白酶對蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，生成小分子的肽[36-37]，破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，減少了非共價鍵作用，從而可以使合成著色劑更易使用無水乙醇提取。發(fā)酵乳的pH值一般為4.6～5.2，均為酸性，蛋白質(zhì)處于緊密結(jié)合的狀態(tài)，使用單一有機(jī)溶劑不能完全提取發(fā)酵乳中的赤蘚紅，需要分解蛋白質(zhì)后再進(jìn)行提取。

分解樣品中蛋白質(zhì)所需木瓜蛋白酶量與樣品蛋白質(zhì)含量相關(guān)，即與樣品稱樣量相關(guān)。確定樣品稱樣量為1 g，使用赤蘚紅添加量為1.0 mg/kg的發(fā)酵乳試樣進(jìn)行不同加酶量實(shí)驗(yàn)。由圖1可知，當(dāng)樣品稱樣量為1 g，加酶量大于0.03 U時，赤蘚紅回收率均大于90%，而加酶量為0.04 U時回收率大于95%。使用Minitab軟件對赤蘚紅回收率結(jié)果進(jìn)行單因子方差分析，表明在95%置信度下，不同加酶量的回收率有顯著差異?？悸实矫赋杀竞透呋厥章试瓌t等因素，確定加酶量為0.04 U作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)最佳條件。

圖1 不同加酶量與赤蘚紅回收率結(jié)果箱線圖（nn==33）Fig.1 Effect of papain dosage on the recovery of erythrosine (n = 3)

2.1.2 提取溶劑的選擇

一般合成著色劑的提取溶劑有氨水-無水乙醇體系等有機(jī)溶劑和水相溶劑。因氨水具有高揮發(fā)性和強(qiáng)刺激性，對人體有一定的危害。分別采用無水乙醇、甲醇、水作為提取溶劑，對赤蘚紅添加量為1.0 mg/kg的發(fā)酵乳試樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，平行測定3 次。由圖2可知，在95%置信度下，不同提取溶劑的回收率結(jié)果有顯著差異。使用水作為提取溶劑，因受發(fā)酵乳溶液pH值的影響，赤蘚紅與蛋白質(zhì)的結(jié)合比較緊密，其提取回收率較低；使用有機(jī)溶劑提取時，同樣條件下無水乙醇的提取回收率比甲醇高。綜上所述，選擇無水乙醇作為提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑與赤蘚紅回收率結(jié)果箱線圖（nn==33）Fig.2 Effect of extraction solvents on the recovery of erythrosine (nn = 3)

2.1.3 提取溶劑添加量的選擇

提取溶劑的提取能力是影響回收率結(jié)果的關(guān)鍵，一般情況下，有機(jī)溶劑與水相的比例會影響目標(biāo)物的提取，即酶解水相與提取溶劑體積比會影響回收率。對赤蘚紅添加量為1.0 mg/kg的發(fā)酵乳試樣，采用酶解水相與無水乙醇體積比分別為2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖3可知，在95%置信度下，不同體積比對回收率結(jié)果有顯著影響。體積比2∶8、3∶7、4∶6的回收率均在90%以上，符合GB/T 27404《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》關(guān)于回收率的要求。實(shí)驗(yàn)使用體積比4∶6提取，樣液離心后，溶液仍不澄清，不利于過柱；體積比2∶8和3∶7條件下回收率較高，均大于95%。在95%置信度下，體積比2∶8和3∶7對回收率結(jié)果無顯著影響，但體積比2∶8條件下操作時，2 mL的水不易完全溶解樣品，尤其是黏稠的發(fā)酵乳樣品，影響樣品酶解及測定值的準(zhǔn)確性，故確定酶解水相與無水乙醇體積比3∶7作為提取溶劑的最佳比例。

圖3 不同酶解水相與無水乙醇體積比與赤蘚紅回收率結(jié)果箱線圖（nn==33）Fig.3 Effect of volume ratio between enzymatic hydrolysate and anhydrous ethanol on the recovery of erythrosine (nn = 3)

2.1.4 超聲時間的選擇

分別使用超聲時間10、20、30、40 min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖4可知，在95%置信度下，不同的超聲時間對回收率結(jié)果有影響。超聲時間10、20、30、40 min條件下的回收率均在90%以上，符合GB/T 27404關(guān)于回收率的要求。而超聲時間30、40 min的回收率均大于95%，考慮到高回收率和時間節(jié)約原則，選擇超聲時間為30 min。

圖4 不同超聲時間與赤蘚紅回收率結(jié)果箱線圖（nn==33）Fig.4 Effect of ultrasonic time on the recovery of erythrosine (nn = 3)

2.2 過柱條件的選擇

目前文獻(xiàn)方法中使用的固相萃取小柱有聚酰胺小柱、HLB小柱等。聚酰胺小柱的一般上柱方式是酸性上柱、淋洗，堿性洗脫，赤蘚紅色素耐酸堿性較差，故本研究選擇HLB固相萃取小柱進(jìn)行凈化富集，并對樣液過柱pH值進(jìn)行研究。分別調(diào)節(jié)樣液pH值為4.6、5.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖5可知，pH值7.5時的回收率大于90%，且回收率穩(wěn)定，在95%置信度下，不同的過柱pH值對回收率結(jié)果有顯著影響。需要進(jìn)一步選擇pH值范圍，細(xì)化pH值為7.4、7.5、7.6、7.7、7.8，由圖6可知，pH值7.4～7.7時的回收率均大于90%且穩(wěn)定，符合GB/T 27404關(guān)于回收率的要求，在95%置信度下，不同的過柱pH值對回收率有顯著影響，pH值為7.4和7.8時的回收率均小于95%，pH值為7.5、7.6、7.7時回收率均大于95%。由圖7可知，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，pH值為7.5～7.7條件下，在95%置信度下，不同的過柱pH值對回收率無顯著影響?？紤]高回收率原則，選擇過柱pH值為7.5～7.7。

圖5 不同上柱pH值（4.6、5.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）與赤蘚紅回收率結(jié)果箱線圖（nn==33）Fig.5 Effect of sample pH (4.6, 5.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, and 8.5) on the recovery of erythrosine (nn = 3)

圖6 不同上柱pH值（7.4、7.5、7.6、7.7、7.8）與赤蘚紅回收率結(jié)果箱線圖（nn==33）Fig.6 Effect of sample pH (7.4, 7.5, 7.6, 7.7 and 7.8) on the recovery of erythrosine (nn = 3)

圖7 不同上柱pH值（7.5、7.6、7.7）與赤蘚紅回收率結(jié)果箱線圖（nn==33）Fig.7 Effect of sample pH (7.5, 7.6 and 7.7) on the recovery of erythrosine (nn = 3)

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性方程與相關(guān)系數(shù)

將不同質(zhì)量濃度的赤蘚紅系列標(biāo)準(zhǔn)工作液在不同時間、上述洗脫條件下經(jīng)高效液相色譜儀測定，并計(jì)算線性回歸方程。由表2可知，配制3 d的標(biāo)準(zhǔn)工作液得到的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.999，表明目標(biāo)物的線性關(guān)系良好。

表2 赤蘚紅的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear regression equations and correlation coefficients for erythrosine standard solution stored for different time periods

2.3.2 定量限與檢出限

對赤蘚紅添加量為2 mg/kg的發(fā)酵乳試樣進(jìn)行測定，由圖8可知，色譜圖雜質(zhì)峰干擾小，分離度為2.56，符合《中國藥典》中關(guān)于分離度≥1.5的要求。

圖8 發(fā)酵乳加標(biāo)樣品反相高效液相色譜圖Fig.8 Reversed-phase high performance liquid chromatogram of spiked fermented milk

由表3可知，按照信噪比（RS/N）均滿足≥3的要求，赤蘚紅的檢出限為0.1 mg/kg，按照RS/N均滿足≥10的要求，赤蘚紅的定量限為0.2 mg/kg。

表3 赤蘚紅的檢出限與定量限Table 3 LODs and LOQs of erythrosine

2.3.3 方法的回收率與精密度

測定發(fā)酵乳中添加定量限、2 倍定量限和10 倍定量限3 個不同添加量赤蘚紅的加標(biāo)回收率。由表4可知，赤蘚紅的加標(biāo)回收率為93.1%～105.6%，RSD為1.87%～2.21%，說明該方法測定發(fā)酵乳中赤蘚紅具有很好的準(zhǔn)確度和精密度。

表4 赤蘚紅的加標(biāo)回收率及精密度測定結(jié)果（nn==66）Table 4 Recoveries and precision (RSD) of erythrosine in spiked fermented milk (nn = 6)

2.4 實(shí)際樣品測定

根據(jù)本研究方法對市售7 款含果品發(fā)酵乳進(jìn)行測定，由表5可知，目前市售添加果泥、果粒等原料的發(fā)酵乳未檢出赤蘚紅。

表5 樣品中赤蘚紅測定結(jié)果Table 5 Results of erythrosine detection in real samples

3 結(jié) 論

采用反相高效液相色譜法對發(fā)酵乳中赤蘚紅的含量進(jìn)行測定時，樣品采用酶法水解蛋白、無水乙醇提取，堿性過柱凈化，采用C18色譜柱分離，應(yīng)用甲醇-乙酸銨緩沖溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確度滿足定量要求，方法精密度良好，回收率高，操作簡便，適用于發(fā)酵乳中赤蘚紅含量的測定，可為發(fā)酵乳中赤蘚紅的檢測及風(fēng)險監(jiān)控提供技術(shù)支持。