生艾葉對(duì)人肺炎支原體體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究*

張 俊，柴 琳，趙若蓮，劉榮均，李 萌，鄒昱蕾

(云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，云南 昆明 650011)

肺炎支原體(mycoplasma pneumonia，MP)是介于細(xì)菌和病毒之間能獨(dú)立存活的最小病原微生物，通過呼吸道飛沫以氣溶膠的形式傳播。MP是引起兒童呼吸道感染的主要病原體，在兒童社區(qū)獲得性肺炎中所占的比例逐年升高，MP的感染通常間隔3～7年會(huì)發(fā)生地方性流行和大流行[1-3]。MP感染引起的肺炎支原體肺炎(MPP)除引發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病外，還可伴發(fā)多系統(tǒng)、多器官的損害[4]。隨著抗生素使用引發(fā)的不良反應(yīng)以及耐藥現(xiàn)象的不斷增加，嚴(yán)重影響了對(duì)MP感染的治療。中醫(yī)藥在治療MP感染方面顯示了極大優(yōu)勢(shì)。本研究探討生艾葉提取物對(duì)人肺炎支原體流行株、耐藥株體外抑菌和殺菌的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥原液的制備 中藥原液的制備采用二次煮沸法。稱取生艾葉100 g，加水1200 mL浸泡20 min，煮武火沸騰后文火煎30 min，攪拌過濾，藥渣再加水800 mL后按上法再煎，過濾，兩次藥液合并濃縮成100 mL，用NaOH調(diào)pH值至7.6～7.8，取50 mL置離心管中離心10 min，4000 r/min；121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min 后，作為中藥原液(1 mL藥液相當(dāng)于原藥材1 g)，存放4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)前以MP液體培養(yǎng)基稀釋。

1.1.2 MP工作菌液的制備 將凍干保存的肺炎支原體菌29342(Ⅰ型)、15531(Ⅱ型)和耐藥菌株19號(hào)(昆明醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所保藏)，用液體培養(yǎng)法傳代。耐藥菌株MP19是臨床分離的MP菌株經(jīng)藥敏篩選，對(duì)依托紅霉素、紅霉素、阿奇霉素、克林霉素、克拉霉素、羅紅霉素均耐藥。

具體步驟：取凍干支原體菌種，從密封真空玻璃管中轉(zhuǎn)接到SP-4液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃溫箱中孵育，每日定時(shí)觀察2次，待顏色有變化時(shí)(預(yù)計(jì)孵育時(shí)間為5～7 d)，即培養(yǎng)基顏色由粉紅色變?yōu)榈赛S色澄清液體時(shí)，表明有肺炎支原體菌株生長。再次轉(zhuǎn)接到SP-4液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)5 d，即為MP2(第二代)。用SP-4液體培養(yǎng)法連續(xù)傳代，取第三代，采用顏色變化單位(colour change units，CCU)方法測(cè)定MP濃度，用MP液體培養(yǎng)基稀釋到104～105 CCU/mL，作為工作菌液。

1.1.3 培養(yǎng)皿制作 將培養(yǎng)皿原料混合，加入馬血清、葡萄糖及抗生素(醋酸鉈、青霉素、兩性霉素、多粘菌素)，過濾除菌，在121 ℃下滅菌20 min，取出導(dǎo)入培養(yǎng)皿中約10 mL/個(gè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將生艾葉中藥原液倍比稀釋成3個(gè)濃度，依次為：250 mg/mL、62.50 mg/mL、15.625 mg/mL；吸取生艾葉基礎(chǔ)藥液2 mL，加入2 mL含菌培養(yǎng)基入第一管，之后每次吸取上一管1 mL加3 mL含菌培養(yǎng)基入下一管內(nèi)。完成后，吸取100 μL各濃度兩次，分別注入相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿中，均勻涂在培養(yǎng)皿上，置電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃孵育0～48 h后觀察結(jié)果。在顯微鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)兩個(gè)視野記錄菌落數(shù)，取平均值。

對(duì)照組設(shè)置：29342(Ⅰ型)、15531(Ⅱ型)和耐藥菌株19號(hào)工作菌液，各吸取100 μL，注入培養(yǎng)皿中，均勻涂在培養(yǎng)皿上，置電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃孵育0～96 h后觀察結(jié)果。在顯微鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)兩個(gè)視野記錄菌落數(shù)，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理采用SPSS13.0軟件，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

肺炎支原體流行株ATCC15531計(jì)數(shù)菌落總數(shù)2768個(gè)、ATCC29342計(jì)數(shù)菌落總數(shù)3040個(gè)，耐藥株MP19計(jì)數(shù)菌落總數(shù)4136個(gè)。生艾葉粗提藥液濃度250 mg/mL對(duì)人肺炎支原體(MP)流行株、耐藥株體外在0、12、24 h 3個(gè)時(shí)間段均有殺菌作用，滅菌率在83～100%。生艾葉粗提藥液濃度62.5 mg/mL在24 h對(duì)肺炎支原體流行株ATCC15531滅菌率為92%，對(duì)ATCC29342滅菌率為87%，對(duì)耐藥株MP19滅菌率為94%。生艾葉提取物對(duì)人肺炎支原體MIC90 值在65～30 mg/mL，MIC50值在20～10 mg/mL。

表1 生艾葉在0小時(shí)混合時(shí)間不同濃度體外抗肺炎支原體滅菌率(%)比較

表2 生艾葉在12小時(shí)混合時(shí)間不同濃度體外抗肺炎支原體滅菌率(%)比較

表3 生艾葉在24 h混合時(shí)間不同濃度體外抗肺炎支原體滅菌率(%)比較

3 討論

目前，國內(nèi)外MP耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。2000年Okazaki等[5]首次在兒童患者體內(nèi)分離到對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的MP。隨后國內(nèi)外相繼報(bào)道了在臨床標(biāo)本中尤其兒童患者中分離得到對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的MP。

中醫(yī)認(rèn)為肺炎支原體肺炎(MPP)屬于溫?zé)岵》懂犞械摹胺螣岽取?、“風(fēng)溫犯肺”等癥，屬于祖國醫(yī)學(xué)“肺炎喘嗽”范疇。在中醫(yī)辨證治療中可以分為5個(gè)方向[6]：(1)宣肺止咳化痰，多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為本病病機(jī)為肺氣失宣，肺衛(wèi)郁閉，痰濁壅阻，肺失肅降，以宣肺止咳化痰為主要治療原則。(2)清熱解毒，活血化瘀，肺熱灼津?yàn)樘?，痰熱互結(jié)，阻于氣道，氣機(jī)不利，氣滯而血瘀，故部分醫(yī)家認(rèn)為本病病機(jī)為痰熱閉肺，瘀血阻絡(luò)，從而確立清熱解毒，活血化瘀的治療原則。(3)養(yǎng)陰清熱，小兒乃純陽之體，具有發(fā)病容易，轉(zhuǎn)變迅速的病理特點(diǎn)，感邪之后熱變迅速，極易耗傷陰津，部分醫(yī)家以此病機(jī)確立清熱養(yǎng)陰的治療原則。(4)清肺瀉肝肺之肅降有制約肝火上升之效，外邪犯肺，肺失肅降可致肝火偏旺，木火刑金，故有醫(yī)家采用清肺瀉肝之法治療本病。(5)扶正祛邪，MP感染后期由于久熱久咳，耗傷肺之氣陰，子病及母，傷及脾氣，故以陰虛肺熱、肺脾氣虛型較為多見。此期主要以扶正祛邪為治療原則。

艾葉為菊科(compositae)蒿屬多年生草本植物艾(artemisia argyi Levl.et Vant.)的干燥葉，正式作為藥物最早記載于梁·陶弘景《名醫(yī)別錄》[7]，具有“溫經(jīng)止血、散寒止痛”的作用。研究表明艾葉具有鎮(zhèn)痛、抗菌消炎[8]、止血、抗病毒、平喘、免疫調(diào)節(jié)等活性。艾葉水提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白假絲酵母和黑曲霉均具有明顯的殺菌作用[9-11]。艾葉揮發(fā)油也具有抑菌作用，其體外抑菌作用優(yōu)于或等同于紅霉素[6]。

通過實(shí)驗(yàn)研究，篩選出生艾葉提取物對(duì)本地人肺炎支原體流行株ATCC15531、ATCC29342和耐藥株MP19直接抑菌殺菌最佳藥物濃度在62.5 mg/mL，最佳時(shí)間是與肺炎支原體作用24 h，生艾葉提取物MIC90在65～30 mg/mL，MIC50在20～10 mg/mL。生艾葉對(duì)人肺炎支原體流行株ATCC15531、ATCC29342和耐藥株MP19有直接抑菌殺菌的作用。

雖然MPP的發(fā)病機(jī)制尚未十分清楚，但免疫學(xué)機(jī)制一直是其研究重點(diǎn)，尤其是細(xì)胞因子在MP 感染中的作用越來越受到重視，其在許多疾病發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用，參與了MPP 的發(fā)病過程，艾葉免疫調(diào)節(jié)活性在免疫功能紊亂中也能起到一定的作用。中醫(yī)中藥對(duì)機(jī)體免疫的影響值得更深一步的研究。