益氣排毒方對(duì)慢性腎臟病大鼠腎臟病理的影響*

李玉靖，鄭壁偉，歐陽(yáng)永紅△

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬清遠(yuǎn)市中醫(yī)院，廣東 清遠(yuǎn) 511500)

慢性腎臟病又稱慢性腎衰竭，是指各種因素所致的病程不少于3個(gè)月的腎臟損害和(或)GFR降低。其中，GFR是慢性腎臟病的分期的主要依據(jù)；而腎臟損害包括腎臟結(jié)構(gòu)或功能異常，病理形態(tài)學(xué)改變是腎臟結(jié)構(gòu)異常的重要表現(xiàn)，對(duì)腎臟診斷及治療具有指導(dǎo)意義。益氣排毒方是廣東省名中醫(yī)歐陽(yáng)永紅教授40余年臨證經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，臨床運(yùn)用于慢性腎臟病患者，在緩解患者臨床癥狀、改善腎臟功能的理化指標(biāo)等方面效果顯著。歐陽(yáng)教授師承團(tuán)隊(duì)已對(duì)該方在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中緩解臨床表現(xiàn)和改善理化指標(biāo)方面療效進(jìn)行了總結(jié)和歸納[1]。本論文將通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行解剖及腎臟組織病理觀察，進(jìn)一步證實(shí)益氣排毒方對(duì)慢性腎臟病大鼠的腎臟損害具有改善作用，可延緩和抑制病程進(jìn)展，初步探討益氣排毒方對(duì)慢性腎臟病的作用機(jī)制，研究討論益氣排毒方組方，為臨床推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)研究和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物來(lái)源廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)wistar大鼠24只，雌雄各半，體重(200±20)g。

1.1.2 藥物 (1)造模藥物：維生素B4(即腺嘌呤)，上海延安萬(wàn)象藥業(yè)生產(chǎn)，每片10 mg。(2)益氣排毒方：黃芪20 g，淫羊藿10 g，茯苓15 g，白術(shù)12 g，黃精10 g，枳實(shí)10 g，丹參20 g，大黃10 g(后下)、煅牡蠣20 g，白花蛇舌草10 g，以蒸餾水500 mL浸泡至少半小時(shí)后，慢火濃煎至200 mL(由清遠(yuǎn)市中醫(yī)院藥學(xué)部中藥制劑室統(tǒng)一提供)。

1.2 方法

1.2.1 造模采用“腺嘌呤毒害大鼠腎臟”建立慢性腎臟病模型，即隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)大鼠21只，做好標(biāo)示，用蒸餾水將維生素B4配制成2%的溶液，先以200 mg/kg/d給藥量灌胃，連續(xù)給藥2周；再以100 mg/kg/d的劑量，連續(xù)給藥1周。隨機(jī)抽取造模大鼠1只與正常大鼠1只，心臟取血，標(biāo)本送清遠(yuǎn)市中醫(yī)院檢驗(yàn)中心檢測(cè)腎功能指標(biāo)，將之處死，分別解剖并觀察大鼠腎臟病理，保證造模成功。

1.2.2 分組按重量使用隨機(jī)數(shù)字表法，將慢性腎臟病模型大鼠隨機(jī)分為：干預(yù)組10只(191.26±5.71 g)、對(duì)照組10只(188.76±6.81 g)，2組大鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.8899<2.086，P>0.05)。正常組大鼠給予正常喂養(yǎng)，作為最終參照，證明慢性腎臟病大鼠模型成功。

1.2.3 給藥 干預(yù)組按正常成人體重劑量14倍給藥，經(jīng)換算為23.38 mL/kg，即平均每只大鼠灌入中藥煎劑約4 mL，連續(xù)喂養(yǎng)28 d，1天1次。對(duì)照組大鼠灌入等量(23.38 mL/kg)蒸餾水。

1.2.4 觀察指標(biāo)

1.2.4.1 腎臟大體觀察 給藥28 d后處死所有大鼠，摘取腎臟，洗凈淤血塊，剔除周圍脂肪和筋膜組織，吸干腎臟表面水分，稱取單腎的重量，算出腎重/體重比值。用生理鹽水重新清洗大鼠腎臟，肉眼觀察臟器外觀(包括大小、色澤、質(zhì)地、包膜、皮質(zhì)、髓質(zhì)、實(shí)質(zhì)等)并做好記錄，其后分別浸泡在裝有福爾馬林的標(biāo)本瓶中待切片。

1.2.4.2 病理觀察 石蠟切片制作方法：腎活檢組織經(jīng)固定(10%甲醛)、脫水(無(wú)水乙醇)、石蠟包埋、切片(厚度1.5 μm)、HE染色。

1.2.5 觀察內(nèi)容 (1)腎小球：病理?yè)p害程度，包括腎小球增生、萎縮、纖維化等。(2)腎小管：病理改變情況，包括腎小球擴(kuò)張、阻塞，上皮細(xì)胞變性、脫落、壞死等。(3)腎間質(zhì)：病理改變情況，包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)纖維化等。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 對(duì)照組共10只，死亡2只(第14 d、第18 d)，存活8只(80%)；干預(yù)組共10只，死亡1只(第20天)，存活9只(90%)；正常大鼠共10只，死亡0只，存活10只(100%)。肉眼觀察，正常大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤、生存情況等明顯好于2組慢性腎臟病大鼠；2組比較，干預(yù)組優(yōu)于對(duì)照組。

2.2 對(duì)腎重體重比的影響 見表1，圖1。

表1 2組大鼠實(shí)驗(yàn)后腎重/體重比×103 比較情況

正常大鼠(HE×200)

對(duì)照組(HE×200)

干預(yù)組(HE×200)圖1 3組大鼠HE染色腎臟病理變化

慢性腎臟病模型大鼠，均出現(xiàn)腎臟腫脹變大，腎重/體重比值高于正常大鼠。根據(jù)2組比較結(jié)果，說(shuō)明益氣排毒方可有效減輕腎組織增生情況，延緩腎臟損害進(jìn)度。

2.3 腎臟大體觀察情況 與模型組對(duì)比，干預(yù)組腎臟表面顏色較深，整體腫脹情況、薄膜增厚程度較輕，說(shuō)明該方具有保護(hù)腎功能的作用。見表2。

表2 腎臟大體觀察情況

2.4 HE染色腎臟病理觀察

2.4.1 HE染色觀察 對(duì)照組腎臟組織損害嚴(yán)重，腎小管擴(kuò)張，部分腎小管堵塞，大量腎小管上皮細(xì)胞脫落，內(nèi)有大量結(jié)晶體沉積。與對(duì)照組相比，干預(yù)組病理?yè)p害較輕，部分腎小管擴(kuò)張，少量腎小管上皮細(xì)胞脫落，管內(nèi)少量結(jié)晶沉積。

2.4.2 對(duì)照組 腎小管明顯擴(kuò)張，大量腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，管腔內(nèi)見大量深黃色結(jié)晶體，甚者完全堵塞；腎小球數(shù)量明顯減少，部分出現(xiàn)萎縮、塌陷，腎小囊腔內(nèi)見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分腎小球球囊擴(kuò)張，囊壁增厚；腎間質(zhì)纖維化，可見炎性細(xì)胞、深黃色結(jié)晶體。

2.4.3 干預(yù)組 腎小管輕-中度擴(kuò)張；腎小球數(shù)量有所減少，少量萎縮或塌陷，球內(nèi)系膜細(xì)胞增生不明顯；腎間質(zhì)纖維化程度較對(duì)照組輕，內(nèi)少量金黃色結(jié)晶。

3 討論

3.1 慢性腎臟病大鼠造模方法主要有3種：化學(xué)法、物理法和生物法。許亞超等[2]對(duì)比研究3種造模方法，顯示采用化學(xué)法造模成功率和存活率最高；在癥狀體征、腎功能指標(biāo)和腎臟病理等方面，其嚴(yán)重程度較其他兩種方法嚴(yán)重。化學(xué)藥物造模法常用藥物包括有腺嘌呤和阿霉素等[3]。本研究采用的是腺嘌呤(即維生素B4)，通過(guò)給實(shí)驗(yàn)大鼠灌入大量腺嘌呤，在氧化酶作用下轉(zhuǎn)化為2，8-二羥基腺嘌呤，由于2，8-二羥基腺嘌呤為極難溶于水的結(jié)晶體，其隨血液輸送至腎臟，沉積于腎皮質(zhì)、髓質(zhì)等部位，并阻塞腎小管，引起腎臟纖維組織增生、免疫炎癥反應(yīng)等，最終導(dǎo)致腎功能損傷[4]。其中，腎間質(zhì)纖維化、炎癥反應(yīng)是腺嘌呤造模的重要病理改變。通過(guò)觀察這些病理改變的相關(guān)逆變化，則可證明治療的有效性。

在2組實(shí)驗(yàn)大鼠的腎臟病理比較中，干預(yù)組在腎組織損害程度、纖維化、晶體沉積等各方面均明顯輕于對(duì)照組，表明益氣排毒方具有減小腺嘌呤的腎毒性，減少結(jié)晶體沉積和腎小管堵塞，延緩腎小管變性，抑制系膜細(xì)胞增生，抗腎臟組織纖維化，減輕炎癥反應(yīng)等作用。本研究從病理學(xué)層面，進(jìn)一步證實(shí)益氣排毒方具有改善實(shí)驗(yàn)大鼠一般狀況，提高生存質(zhì)量；改善微循環(huán)，加快毒素排出，減少其在體內(nèi)蓄積，降低血肌酐、尿素氮等指標(biāo)；調(diào)節(jié)鈣磷代謝，促進(jìn)紅細(xì)胞生成，維持血紅蛋白水平等功能。

3.2 歐陽(yáng)教授研讀大量中醫(yī)古文獻(xiàn)，吸收現(xiàn)代中醫(yī)藥研究，結(jié)合臨床實(shí)踐所得，對(duì)“腎為先天之本，脾為后天之本”非常認(rèn)同，認(rèn)為腎脾兩臟是治療腎系疾病的關(guān)鍵所在。腎為元陰元陽(yáng)之所在，具有溫熙的功能，與腎之腑膀胱相合，主氣化；脾主運(yùn)化，與脾之腑胃相合，共奏升清降濁之功；兩臟可謂是人體生命活動(dòng)的原動(dòng)力。脾腎虧虛，則機(jī)體運(yùn)化、溫煦功能減退，營(yíng)衛(wèi)失調(diào)，衛(wèi)氣不能固護(hù)肌表而易受外邪，營(yíng)陰氣化不力而內(nèi)生水濕痰飲。水濕痰飲為陰邪，愈傷陽(yáng)氣，阻礙氣機(jī)，氣不行則血不暢，瘀血乃生。病久病甚則開合失司，當(dāng)瀉不瀉，污穢難排，毒素內(nèi)積，成為“溺毒”等疾。歐陽(yáng)教授對(duì)“久病必瘀”理論十分推崇，強(qiáng)調(diào)慢性腎臟病病情纏綿，必兼瘀血。他認(rèn)為，慢性腎臟病病機(jī)就為本虛標(biāo)實(shí)，本虛以脾腎虧虛為甚，標(biāo)實(shí)則有水濕、痰飲、毒邪、瘀血等，治宜以“補(bǔ)不足”“損有余”“攻補(bǔ)兼施”為則，確立了“補(bǔ)益脾腎、祛瘀排毒”的治法，強(qiáng)調(diào)活血化瘀應(yīng)貫穿疾病始終，由此創(chuàng)立了益氣排毒方。

3.3 益氣排毒方作為歐陽(yáng)教授40余年慢性腎臟病臨證經(jīng)驗(yàn)升華的產(chǎn)物，在臨床中取得良好療效，得到廣泛肯定。該方由黃芪、淫羊藿、黃精、茯苓、白術(shù)、大黃、枳實(shí)、丹參、煅牡蠣、白花蛇舌草組成，標(biāo)本兼治，攻補(bǔ)兼施，予攻于補(bǔ)。方中以黃芪、淫羊藿、黃精、白術(shù)、茯苓等補(bǔ)益脾胃、益氣養(yǎng)陰、滲濕利水；大黃、丹參、枳實(shí)、煅牡蠣、白花蛇舌草攻邪排毒、活血逐瘀。

3.3.1 君藥：黃芪、淫羊藿。

黃芪，性溫味甘，歸脾肺兩經(jīng)，具有益氣升陽(yáng)、利水消腫、托瘡生肌之效，《本草綱目》謂其：“補(bǔ)諸虛不足，益元?dú)?，壯脾胃”。值得注意的是，此方選用黃芪，而非人參。與大補(bǔ)元?dú)庵藚⑾啾?，黃芪較為溫和，慢性腎臟病者久病體虛，難受峻補(bǔ)，且黃芪具有固表利水之功，取“提壺揭蓋”之寓。夏平等[5]通過(guò)對(duì)基于“腎虛濕瘀”理論治療慢性腎臟病的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，有關(guān)黃芪研究文獻(xiàn)高居第一位，說(shuō)明黃芪對(duì)慢性腎臟病具有良好療效已是臨床和科研的共識(shí)?，F(xiàn)代藥理研究中，胡營(yíng)杰等[6]研究說(shuō)明黃芪有效成分可抑制實(shí)驗(yàn)大鼠腎小球系膜細(xì)胞中表達(dá)血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF-BB)mRNA及蛋白的表達(dá)，從而改善或延緩腎小球硬化。陳偉等[7]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能夠均有抗氧化抗炎作用，可減輕腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)；韓鵬勛等[8]研究表明黃芪甲苷可能通過(guò)抑制信號(hào)通路活化起到腎臟保護(hù)作用。傅天嘯等[9]認(rèn)為黃芪注射液可減輕糖尿病腎病大鼠蛋白尿，降低血清脂聯(lián)素、抑制腎組織脂聯(lián)素蛋白及mRNA表達(dá)，降低炎癥因子水平，延緩腎臟病理?yè)p害。

淫羊藿，又名仙靈脾等，性溫味辛甘，歸肝腎兩經(jīng)，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效，是臨床中常用的壯陽(yáng)藥。首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，屬中品無(wú)毒，“主陰萎絕傷”兼有“利小便”之功。李時(shí)珍糾正其性“溫而不寒”，強(qiáng)調(diào)其能“益精氣”，“真陽(yáng)不足者宜之”。淫羊藿對(duì)慢性腎臟病療效明顯，并引起廣泛關(guān)注。在統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析中，有關(guān)淫羊藿研究文獻(xiàn)數(shù)量居補(bǔ)陽(yáng)藥中第二位[5]。趙錦等[10]認(rèn)為淫羊藿苷對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠可降低氧化應(yīng)激水平、減輕炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)增生和腎組織細(xì)胞凋亡。張紅等[11]研究認(rèn)為，淫羊藿苷對(duì)IgA腎病大鼠通過(guò)調(diào)控NF-κBp65、MCP-1因子的表達(dá)以及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等途徑，實(shí)現(xiàn)腎臟保護(hù)作用。人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2)體外實(shí)驗(yàn)顯示，淫羊藿苷可促進(jìn)HK-2細(xì)胞增殖，抑制纖維連接蛋白mRNA及蛋白表達(dá)，發(fā)揮抗TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用[12]。

3.3.2 臣藥：黃精、白術(shù)、茯苓。

黃精，又稱老虎姜，性味甘平，有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎等功效。清遠(yuǎn)連州盛產(chǎn)此藥，當(dāng)?shù)厝顺Ｒ耘葜啤包S精酒”，補(bǔ)而不燥，潤(rùn)而不膩。歐陽(yáng)教授在清遠(yuǎn)從醫(yī)數(shù)十年，對(duì)此藥頗有心得，認(rèn)為其擅滋腎陰，將之與淫羊藿相配，寓意“陰中求陽(yáng)”?，F(xiàn)代研究表明，黃精化學(xué)成分復(fù)雜，主要有多糖、皂苷、黃酮等，具有降糖、護(hù)腎、抗老年癡呆等藥理作用。陳宇等[13]整理分析，黃精通過(guò)抗腎間質(zhì)纖維化、抗炎、抗氧化應(yīng)激等多重作用機(jī)制，發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用。彭靜等[14]研究表明黃精皂苷可以抑制腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)程，保護(hù)腎臟。白術(shù)、茯苓是健脾滲濕利水的經(jīng)典藥對(duì)。白術(shù)甘溫苦燥，擅于守中；茯苓甘淡滲濕，長(zhǎng)于下行。兩藥為伍，不溫不燥，一補(bǔ)一滲，守中有通，相須為用，相得益彰。白術(shù)、茯苓與黃芪相配伍，還寓有健脾補(bǔ)氣經(jīng)典方四君子之意。在兩藥相關(guān)研究文獻(xiàn)數(shù)量統(tǒng)計(jì)中，白術(shù)在補(bǔ)氣藥中居第二位，茯苓在利水藥中居首位[5]。鄭曉珂等[15]研究認(rèn)為，白術(shù)注射液通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶抗氧化，白術(shù)多糖能改善腎臟濾過(guò)屏障泌尿功能和腎小管重吸收功能。白術(shù)還能改善陽(yáng)虛型慢性腎臟病大鼠的環(huán)核苷酸水平，降低肌酐、尿素氮等，減輕蛋白尿[16]。李佳丹等[17]研究認(rèn)為，茯苓多糖可抑制實(shí)驗(yàn)小鼠p38MAPK磷酸化，激活PPAR-γ通道，從而改善腎臟損傷。另外，茯苓具有減輕腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)在間質(zhì)區(qū)域過(guò)度沉積的作用[18]。

3.3.3 佐使藥：大黃、枳實(shí)、丹參、白花蛇舌草、煅牡蠣均為方中佐使，則重攻邪排毒，活血祛瘀，滲濕利水等功效。大黃、枳實(shí)，取義于經(jīng)方小承氣湯，攻下排毒降濁，促進(jìn)邪毒從后陰排出。孫蔣研等[19]研究發(fā)現(xiàn)大黃素對(duì)AKI大鼠腸道菌群失衡有一定的調(diào)節(jié)作用，這可能是其治療腎損傷的作用機(jī)制之一。白亞君等[20]研究表明大黃酚能調(diào)節(jié)腎臟免疫反應(yīng)，減輕腎損傷。焦士蓉等[21]研究發(fā)現(xiàn)枳實(shí)提取物能有效清除多種自由基，起抗氧化作用。丹參集活血補(bǔ)血涼血于一身，古有“一味丹參，功同四物”之說(shuō)。曹春芽等[22]認(rèn)為丹參提取物可降低血清尿素氮、肌酐水平，改善腎組織病理狀態(tài)。陳莎莎等[23]認(rèn)為丹參酮ⅡA可通過(guò)降低氧化應(yīng)激水平、抗炎、減少細(xì)胞凋亡、減輕細(xì)胞外基質(zhì)沉積、改善腎間質(zhì)微循環(huán)、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、阻斷細(xì)胞信號(hào)通路、抑制促纖維化因子的釋放等多重作用保護(hù)腎臟。白花蛇舌草，是常用嶺南草藥，具有清熱解毒、滲濕利水之效。鄒寒冰等[24]研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草可抑制人腎癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等。煅牡蠣具有吸附毒素、收斂固澀精微和糾正鈣磷代謝紊亂的作用[25]。

全方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，標(biāo)本兼顧，病證并治，療效確切。此次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，團(tuán)隊(duì)按大鼠體重定量給藥，且限于動(dòng)物辨證的局限性，維持原方，未予加減；但實(shí)際臨證中，應(yīng)三因制宜，辨證論治，隨癥加減，以達(dá)最佳治療效果。