類黃酮合成通路介導(dǎo)的木薯對木薯綿粉蚧的防御機(jī)理

耿越 陳青 梁曉 劉迎 伍春玲 陳銀華

摘??要：木薯是世界重要的糧食作物、能源作物和工業(yè)原料。木薯綿粉蚧（Phenacoccus?manihoti?Matile-Ferrero）是一種世界危險性檢疫性害蟲，培育和利用抗蟲木薯品種可以有效阻斷其定殖為害。挖掘具有抗蟲作用的次生代謝物質(zhì)及其調(diào)控基因是開展抗蟲育種的重要策略之一。而類黃酮是植物抵御生物與非生物脅迫的特有次生代謝物質(zhì)，但類黃酮及其合成通路基因在木薯抗木薯綿粉蚧中的功能尚不清楚。據(jù)此，本研究分析了抗蟲木薯品種（C1115、SC9、緬甸）和感蟲木薯品種（KU50、SC205、面包）被木薯綿粉蚧為害不同時間（0、1、4、8?d）后，葉片中類黃酮合成通路相關(guān)基因（CHS、CHI、FLS、LAR、DFR、F3H、CCoAOMT、C4H、C3'H、ANR）表達(dá)量以及類黃酮含量的變化情況。結(jié)果表明：木薯綿粉蚧取食后，葉組織中CCoAOMT、C3'H、ANR、C4H雖然上調(diào)表達(dá)，但與為害前相比并無顯著差異，且抗、感木薯品種間的表達(dá)量也無顯著差異；與之相對，CHS、CHI、FLS、F3H、DFR、LAR基因表達(dá)量均比為害前顯著提高，并且在相同的為害時間內(nèi)，這6個基因在抗蟲木薯品種中的表達(dá)量也顯著高于感蟲木薯品種。進(jìn)一步通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CHS、CHI、FLS、F3H、LAR基因的表達(dá)量與木薯品種的抗蟲性呈顯著正相關(guān)。此外，總黃酮含量測定結(jié)果表明：木薯綿粉蚧為害1?d時總黃酮含量與為害前相比均顯著上升，為害4?d后抗蟲木薯品種總黃酮含量顯著高于感蟲木薯品種。相關(guān)性分析顯示，總黃酮含量也與木薯品種的抗蟲性呈顯著正相關(guān)。因此推測，類黃酮含量的上升及其調(diào)控基因CHS、CHI、FLS、F3H、LAR在抗蟲木薯品種中的顯著上調(diào)表達(dá)與其對木薯綿粉蚧的抗性有關(guān)。本研究為深入解析類黃酮合成基因調(diào)控木薯對木薯綿粉蚧的抗蟲防御反應(yīng)分子機(jī)制，以及木薯抗蟲分子設(shè)計育種提供重要的前期基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：抗、感木薯品種；木薯綿粉蚧；類黃酮合成途徑；基因表達(dá)；抗蟲機(jī)理中圖分類號：S435.33??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Flavonoid?Synthesis?Pathway-mediate?Defense?Mechanism?of?Cassava?Against?Phenacoccus?manihoti

GENG?Yue1，2，3，?CHEN?Qing2，3*，?LIANG?Xiao2，3，?LIU?Ying?2，3，?WU?Chunling2，3，?CHEN?Yinhua1

1.?School?of?Tropical?Agriculture?and?Forestry，?Hainan?University，?Haikou，?Haian?570228，?China;?2.?Environment?and?Plant?Protection?Institute，?China?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences?/?Key?Laboratory?of?Integrated?Pest?Management?on?Tropical?Crops，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs?/?Hainan?Engineering?Research?Center?for?Biological?Control?of?Tropical?Crops?Diseases?and?Insect?Pests，?Haikou，?Hainan?571101，?China;?3.?Sanya?Research?Academy，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agriculture?Science?/?Hainan?Key?Laboratory?for?Biosafety?Monitoring?and?Molecular?Breeding?in?Off-Season?Reproduction?Regions，?Sanya，?Hainan?572000，?China

Abstract：?Cassava?is?an?important?food?crop，?energy?crop?and?industrial?raw?material.?Cassava?mealybug?（Phenacoccus?manihoti?Matile-Ferrero）?is?a?dangerous?quarantine?pest?in?the?world，?the?cultivation?and?utilization?of?insect-resistant?cassava?cultivars?can?effectively?block?its?colonization.?Mining?insect-resistant?secondary?metabolites?and?the?regulatory?genes?is?one?of?the?important?strategies?for?insect-resistant?breeding.?Flavonoids?are?unique?secondary?metabolites?for?plants?to?resist?biotic?and?abiotic?stresses，?but?the?function?of?flavonoids?and?the?synthesis?pathway?genes?in?cassava?resistance?to?cassava?mealybug?is?still?unclear.?Based?on?this，?this?study?analyzed?the?expression?levels?of?flavonoid?synthesis?pathway-related?genes?（CHS，?CHI，?FLS，?LAR，?DFR，?F3H，?CCoAOMT，?C4H，?C3'H?and?ANR）?and?flavonoid?content?in?the?leaves?of?insect-resistant?（C1115，?SC9，?Myanmar）?and?insect-susceptible?（KU50，?SC205?and?Bread）?cassava?cultivars?after?being?damaged?by?cassava?mealybug?for?different?time?（0，?1，?4，?8?d）.?Although?the?expression?of?CCoAOMT，?C3'H，?ANR?and?C4H?in?the?leaf?was?up-regulated?after?feeding，?there?was?no?significant?difference?compared?with?that?before?damage，?and?there?was?no?significant?difference?in?the?expression?level?between?the?resistant?and?susceptible?cassava?cultivars.?In?contrast，?the?expression?levels?of?CHS，?CHI，?FLS，?F3H，?DFR?and?LAR?genes?were?significantly?higher?than?those?before?damage，?and?in?the?same?damage?time，?the?expression?levels?of?the?six?genes?in?the?insect-resistant?cassava?cultivars?were?also?significantly?higher?than?those?in?the?insect-susceptible?cassava?cultivars.?Further?correlation?analysis?showed?that?the?expression?levels?of?CHS，?CHI，?FLS，?F3H?and?LAR?genes?were?significantly?positively?correlated?with?the?insect?resistance?of?cassava?cultivars.?In?addition，?the?results?of?total?flavonoid?content?determination?showed?that?the?total?flavonoid?content?increased?significantly?after?one?day?of?damage?compared?with?that?before?damage，?and?the?total?flavonoid?content?of?insect-resistant?cassava?cultivars?was?significantly?higher?than?that?of?the?insect-susceptible?cassava?cultivars?after?4?days?of?damage.?Correlation?analysis?showed?that?the?total?flavonoid?content?was?also?significantly?positively?correlated?with?the?insect?resistance?of?cassava?cultivars.?Therefore，?it?is?speculated?that?the?increase?of?flavonoid?content?and?the?significantly?up-regulation?of?CHS，?CHI，?FLS，?F3H?and?LAR?in?the?insect-resistant?cassava?cultivars?may?be?related?to?the?resistance?to?cassava?mealybug.?This?study?would?provide?an?important?preliminary?basis?for?the?in-depth?analysis?of?the?molecular?mechanism?of?flavonoid?synthesis?genes?regulating?the?insect-resistant?defense?response?of?cassava?to?mealybug，?as?well?as?the?molecular?design?and?breeding?of?cassava?insect-resistant.

Keywords：?insect-resistant?and?insect-susceptible?cassava?cultivars;?Phenacoccus?manihoti;?flavonoid?biosynthetic?pathway;?gene?expression;?resistance?mechanism

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.010

木薯（Manihot?esculenta?Crantz）為大戟科木薯屬灌木或亞灌木作物，在全球一百多個國家包括我國的海南、廣西、廣東、福建、湖南、云南等省（區(qū)）大面積種植[1-2]，是重要的糧食作物、能源作物、工業(yè)原料和飼料作物[3-4]，在保障世界糧食安全和能源安全中具有不可替代的地位，并作為“先鋒作物”在“一帶一路”倡議中發(fā)揮重要作用。

木薯綿粉蚧（Phenacoccus?manihoti?Matile-?Ferrero）是半翅目、粉蚧科、綿粉蚧屬的一種世界危險性檢疫性害蟲[5]，最初在南美洲被發(fā)現(xiàn)，2011年該蟲被我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為高風(fēng)險性檢疫有害生物[6]，目前已在世界木薯主產(chǎn)區(qū)普遍嚴(yán)重發(fā)生[7-8]。該蟲主要通過若蟲和成蟲直接刺吸植株組織汁液為害，造成頂芽、葉片卷曲和束頂，節(jié)間減少，發(fā)育遲緩，莖桿和根系變?nèi)?，常?dǎo)致減產(chǎn)50%以上，嚴(yán)重危害時導(dǎo)致整株死亡和絕收[9-10]。此外，該蟲還會誘發(fā)煤煙病加重為害。目前對于該蟲的防治主要以化學(xué)防治和生物防治[11]為主，但目前登記用于防治該蟲的藥劑非常少，而生物防治因木薯產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境多樣性低導(dǎo)致天敵種群數(shù)量不穩(wěn)定，生物防治效果差。因此，尋求新的有效綠色防控木薯綿粉蚧的策略和途徑成為目前國內(nèi)外木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟待解決的重大課題。

作物抗蟲性是使植物通過內(nèi)稟的抗蟲機(jī)制免于受害、利用內(nèi)因治蟲所特有的手段，培育和利用抗蟲品種是目前國內(nèi)外公認(rèn)的最經(jīng)濟(jì)、簡便、有效的一項帶有方向性的蟲害綠色防控途徑[12-13]，挖掘具有抗蟲作用的次生代謝物質(zhì)是目前開展抗蟲育種的重要策略。黃酮類化合物是植物體內(nèi)一類特有的次生代謝物質(zhì)，在酚類化合物中數(shù)量最多，目前已知的黃酮類化合物已超過10?000種[14]。已報道與植物抗蟲相關(guān)的多種黃酮類化合物及其調(diào)控基因。研究發(fā)現(xiàn)無色花青素還原酶（LAR）、花青素還原酶（ANR）基因的過表達(dá)可提高單寧含量，使木薯對二斑葉螨具有抗性[15]；在水稻中添加櫻花素作為激發(fā)子可以有效提高水稻對稻飛虱的抗性[16]；將查爾酮異構(gòu)酶（CHI）基因?qū)肟瓜x棉中可增強(qiáng)其對病害和棉鈴蟲的抗性[17]；松茸毒蛾和松毛蟲在為害馬尾松后，馬尾松的類黃酮合成通路基因類黃酮3-羥化酶（F3H）、肉桂酸4-羥化酶（C4H）和類黃酮-3'5'-羥化酶（F3'5'H）顯著上調(diào)表達(dá)，提高了馬尾松的抗蟲性[18]。然而，迄今為止尚無類黃酮調(diào)控基因作用于木薯抗木薯綿粉蚧中的相關(guān)研究報道。因此，本研究以抗（C1115、SC9、緬甸）、感（KU50、SC205、面包）木薯品種為參試材料，系統(tǒng)開展木薯綿粉蚧取食前后抗、感木薯品種類黃酮含量及其合成途徑基因表達(dá)的差異研究，以期明確類黃酮合成通路在木薯抗木薯綿粉蚧中的重要作用。

1??材料與方法

1.1??材料

1.1.1??供試木薯品種??選用經(jīng)抗蟲性鑒定且表性穩(wěn)定的抗蟲木薯品種C1115、SC9、緬甸和感蟲木薯品種KU50、SC205、面包為參試材料[19-21]，上述品種均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。種植土比例（土壤∶泥炭土∶珍珠巖=1∶1∶1）。

1.1.2??供試木薯綿粉蚧??木薯綿粉蚧為用感蟲木薯品種KU50在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所室內(nèi)長期繼代飼養(yǎng)的實驗種群，飼養(yǎng)溫度設(shè)置為（28±2）℃，相對濕度為75%±5%。

1.1.3??類黃酮合成途徑基因??根據(jù)已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)以及在KEGG（https：//www.kegg.jp/kegg/）網(wǎng)站上發(fā)布的類黃酮合成通路，選取10個研究廣泛、挖掘潛力最大的類黃酮合成基因，用于木薯綿粉蚧取食前后類黃酮合成基因在抗、感蟲木薯品種間表達(dá)差異及其與木薯對木薯綿粉蚧的抗蟲性相關(guān)性分析。10個類黃酮合成通路基因為：查爾酮合酶（CHS）、CHI、F3H、黃酮醇合成酶（FLS）、二氫黃酮醇還原酶（DFR）、LAR、ANR、咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCOAOMT）、C4H、香豆酸-3羥基化酶（C3'H）。

1.2??方法

1.2.1??木薯品種對木薯綿粉蚧的抗蟲性鑒定??選擇前期研究中對二斑葉螨和木瓜秀粉蚧分別表現(xiàn)出抗性的木薯品種C1115、SC9、緬甸和感性的木薯品種KU50、SC205、面包[19-21]，同時通過室內(nèi)鑒定上述品種對木薯綿粉蚧的抗蟲性。根據(jù)《木薯種質(zhì)資源抗蟲性鑒定技術(shù)規(guī)程》（NY/T?2445—2013），木薯綿粉蚧為害高峰期時，每個品種調(diào)查12株木薯，每株木薯選取受蟲害最嚴(yán)重的3片葉，即樣本量N=36，根據(jù)葉片枯黃和卷曲程度將葉片受木薯綿粉蚧為害后分為0、1、2、3、4級，根據(jù)以下公式計算蟲害指數(shù)（I）：

式中，I為蟲害指數(shù)，S為葉片受害級別，Ns為該受害級別葉片數(shù)，N為調(diào)查葉片總數(shù)。據(jù)此，可將田間木薯的抗蟲性水平分為免疫（I=0）、高抗（0

1.2.2??木薯綿粉蚧接種與取樣??選取生長周期約50?d、長勢相近的健康木薯，用細(xì)毛筆輕輕蘸取大小相近長期繼代飼養(yǎng)生長周期15?d、二齡左右的雌粉蚧接種于木薯中部葉片的背面，以30頭/葉接種于木薯中部3片葉上，并均勻涂抹羊毛脂于葉柄基部以防止粉蚧遷移。隨后在木薯綿粉蚧為害0、1、4、8?d時對葉片取樣，輕掃下葉片上的粉蚧后迅速將葉片用液氮處理，隨后于–80?℃下冷凍保存，備用。每株木薯取樣1次，每個蟲害時間點設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3??RNA提取及合成cDNA第一條鏈??使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，美國）對木薯葉片進(jìn)行RNA提取，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和純度，并用超微量紫外分光光度計（Thermo）檢測其濃度。確定RNA可使用后，進(jìn)一步通過Thermoscript?1st?Strand?cDNA?Synthesis?Kit（Vazyme，中國）進(jìn)行基因組DNA的清除以及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成，其中RNA樣品加入1.0?μg，選擇Oligo?（dT）作為逆轉(zhuǎn)錄引物。

1.2.4??實時熒光定量PCR??以木薯的Meactin基因作為內(nèi)參基因，相關(guān)基因的引物序列信息見表1。通過2×Q3?SYBR?qPCR?Master?Mix試劑盒（TOLOBIO，中國）說明書配置qPCR反應(yīng)體系，qPCR反應(yīng)條件為：首先在95?℃下進(jìn)行60?s預(yù)變性，循環(huán)反應(yīng)為：95?℃變性15?s，58?℃下退火30?s，72?℃延伸20?s，使用LightCycler?96儀器（Roche，瑞士）默認(rèn)程序采集擴(kuò)增曲線和溶解曲線。將未受木薯綿粉蚧取食的類黃酮合成通路基因的表達(dá)量統(tǒng)一設(shè)置為1.0，粉蚧為害后的類黃酮合成通路基因的表達(dá)量變化情況以為害前的相對倍數(shù)表示，以2–ΔΔCt法[22]計算分析，每個處理設(shè)3個生物性重復(fù)，并進(jìn)行3個技術(shù)性重復(fù)。

1.2.5??木薯葉片總黃酮含量的測定??在堿性亞硝酸鹽溶液中的類黃酮和鋁離子在510?nm處可形成有特征吸收峰的紅色絡(luò)合物，據(jù)此采用微量法測定木薯葉片類黃酮含量，參照植物類黃酮試劑盒（Mlbio，中國上海）說明書（https：//www.?mlbio.cn/）進(jìn)行測定。

1.3??數(shù)據(jù)處理

采用Gradphad?Prism?9軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總和整理，采用完全隨機(jī)設(shè)計（completely?randomized?design）進(jìn)行試驗設(shè)計，并采用SPSS?26.0軟件對木薯綿粉蚧取食不同木薯品種后基因表達(dá)量變化倍數(shù)進(jìn)行方差分析和多重比較。首先對原始數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性進(jìn)行檢驗，通過峰度和偏度的計算確認(rèn)數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布；其次若方差齊性則采用Duncans新復(fù)極差法方法進(jìn)行多重比較，若方差不齊時則對數(shù)據(jù)進(jìn)行平方根轉(zhuǎn)換，并采用Dunnetts?T3方法進(jìn)行數(shù)據(jù)間的多

重比較（P=0.05）。通過Spearman相關(guān)性分析計算基因表達(dá)量或類黃酮含量和蟲害指數(shù)之間相關(guān)系數(shù)（ρ）。

2??結(jié)果與分析

2.1??木薯品種對木薯綿粉蚧的抗蟲性鑒定

由表2可知抗蟲木薯品種C1115、SC9、緬甸和感蟲木薯品種KU50、SC205、面包的蟲害指數(shù)（I）分別為7.90%、9.60%、11.50%、93.25%、91.80%、95.20%，因此，C1115、SC9、緬甸對木薯綿粉蚧的抗蟲水平均為高抗，而KU50、SC205、面包對木薯面粉蚧的抗蟲水平均為高感。

2.2??木薯綿粉蚧為害抗、感木薯品種前后葉片CHS基因的表達(dá)差異分析

在木薯綿粉蚧為害后，木薯類黃酮合成通路CHS基因的表達(dá)量在抗、感木薯品種中均有顯著變化，呈先上升后下降的趨勢，其中抗蟲木薯品種中基因表達(dá)量的變化更為顯著。在木薯綿粉蚧為害1?d時，C1115、SC9、緬甸葉片中的CHS基因表達(dá)量分別上升到為害前的1.81倍、2.12倍、1.66倍；粉蚧為害4?d時，C1115、SC9葉片中的CHS基因表達(dá)量進(jìn)一步上升到為害前的4.29倍、2.51倍，而感蟲木薯品種KU50、面包、SC205中無顯著變化；粉蚧為害8?d時，6個品種的CHS基因表達(dá)量均顯著降低（圖1A）。進(jìn)一步橫向?qū)Ρ韧粫r間不同木薯品種的CHS基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)緬甸在粉蚧為害0、1?d時的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他木薯品種，抗蟲木薯品種在粉蚧為害4?d后顯著高于感蟲品種，為害8?d時抗感差異最顯著（圖1B）。相關(guān)性分析表明，粉蚧為害4?d后CHS基因的表達(dá)水平和木薯品種的抗蟲性呈顯著正相關(guān)（ρ=0.8285，?P=0.0415）。

2.3??木薯綿粉蚧為害抗、感木薯品種前后葉片CHI基因的表達(dá)差異分析

在木薯綿粉蚧為害后，CHI基因的表達(dá)量在抗蟲木薯品種C1115、SC9、緬甸以及感蟲木薯品種面包葉片中變化顯著，均呈先增后降的趨勢，而在SC205、KU50中基因表達(dá)量的變化不顯著或稍有所下降。其中在木薯綿粉蚧為害1?d后，CHI基因表達(dá)量在面包、SC9、緬甸中分別上升到為害前的1.74倍、1.98倍、1.61倍；粉蚧為害4?d后，抗蟲品種C1115、緬甸分別上升到為害前的2.22倍、4.41倍；在粉蚧為害8?d時，CHI基因表達(dá)量在各個品種中均下降至較低水平（圖2A）。對比同一時間不同木薯品種CHI基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)抗蟲木薯品種在粉蚧為害4?d后開始顯著高于感蟲木薯品種（圖2B）。相關(guān)性分析表明，粉蚧為害4?d時CHI基因表達(dá)量與木薯品種的抗蟲性呈顯著正相關(guān)（ρ=0.9428，?P=0.0048）。

2.4??木薯綿粉蚧為害抗、感木薯品種前后葉片F(xiàn)LS基因的表達(dá)差異分析

木薯綿粉蚧為害后，F(xiàn)LS基因的表達(dá)量在抗蟲木薯品種C1115、SC9、緬甸以及感蟲品種KU50、SC205中均呈先升后降的趨勢，其中抗蟲品種的表達(dá)量變化較大。在粉蚧為害1?d后，KU50、SC205、SC9葉片中的FLS基因表達(dá)量分別上升到為害前的2.09倍、2.19倍、4.36倍，隨后在為害4?d時基因表達(dá)量下降。粉蚧為害4?d

后，C1115、緬甸分別上升到為害前的2.07倍、3.54倍；面包在第8天上升至為害前的1.66倍（圖3A）。對比同一時間不同木薯品種的FLS基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在木薯綿粉蚧為害4?d后抗蟲木薯品種的FLS基因表達(dá)量顯著高于感蟲木薯品種，其中抗蟲品種C1115的表達(dá)量最高（圖3B）。相關(guān)性分析表明，粉蚧為害4?d后FLS基因的表達(dá)量與木薯品種的抗蟲性呈顯著正相關(guān)（ρ=0.9428，?P=0.0048）。

2.5??木薯綿粉蚧為害抗、感木薯品種前后葉片LAR基因的表達(dá)差異分析

在木薯綿粉蚧為害后，抗、感木薯品種葉片中LAR基因的表達(dá)量變化顯著，表現(xiàn)出先升后降的趨勢，且抗蟲木薯品種升高更為顯著。其中在粉蚧為害1?d時，SC9葉片中的LAR基因表達(dá)量上升到為害前的1.48倍，在面包中上升到1.34倍，而KU50、SC205無顯著變化；粉蚧為害4?d后，C1115、緬甸上升到為害前的1.79倍、1.55倍（圖4A）。對比同一時間不同木薯品種的LAR基因表達(dá)量后發(fā)現(xiàn)，粉蚧為害4?d時抗蟲木薯品種顯著高于感蟲木薯品種，且抗蟲木薯品種SC9在粉蚧為害0?d和1?d時也表現(xiàn)出高表達(dá)量（圖4B）。相關(guān)性分析表明，粉蚧為害4?d后LAR基因的表達(dá)量與木薯品種的抗蟲性呈顯著正相關(guān)（ρ=0.8285，?P=0.0415）。

2.6??木薯綿粉蚧為害抗、感木薯品種前后葉片DFR基因的表達(dá)差異分析

在木薯綿粉蚧為害后，除KU50、SC205葉片中DFR基因的表達(dá)量未升高外，C1115、SC9、面包均呈先升后降的趨勢，且抗蟲木薯品種比感蟲品種升高更為顯著。其中SC9、面包在木薯綿粉蚧為害1?d后DFR基因的表達(dá)量上升到為害前

的1.83倍、1.29倍，SC9、C1115在粉蚧為害4?d后上升到為害前的1.92倍、3.73倍（圖5A）。進(jìn)一步對比同一時間不同木薯品種DFR基因的表達(dá)量后發(fā)現(xiàn)，在粉蚧為害8?d后，抗蟲木薯品種顯著大于感蟲木薯品種（圖5B）。相關(guān)性分析表明，粉蚧為害8?d時DFR基因的表達(dá)量與木薯品種的抗蟲性呈不顯著正相關(guān)（ρ=0.7142，?P=0.1107）。

2.7??木薯綿粉蚧為害抗、感木薯品種前后葉片F(xiàn)3H基因的表達(dá)差異分析

木薯綿粉蚧為害后，F(xiàn)3H基因在感蟲木薯品種KU50葉片中的表達(dá)量下降，在SC205、面包、C1115、SC9、緬甸中顯著上升后下降。粉蚧為害1?d后，抗蟲木薯品種C1115、SC9、緬甸葉片中的F3H基因表達(dá)量分別上升到為害前的1.55倍、2.44倍、3.64倍，感蟲品種SC205、面包上升到為害前的1.30倍、1.70倍。粉蚧為害4?d后，C1115

葉片的F3H基因表達(dá)量進(jìn)一步上升到為害前的2.24倍，而其他木薯品種中呈下降趨勢。粉蚧為害8?d時，各木薯品種的F3H基因表達(dá)量進(jìn)一步降低（圖6A）。進(jìn)一步對比相同時間不同木薯品種葉片中F3H基因的表達(dá)量后發(fā)現(xiàn)，抗蟲木薯品種在粉蚧為害4?d后顯著高于感蟲品種（圖6B）。相關(guān)性分析表明，粉蚧為害4?d后F3H基因的表達(dá)量與木薯品種的抗蟲性呈顯著正相關(guān)（ρ=0.8285，?P=0.0415）。

2.8??木薯綿粉蚧為害抗、感木薯品種前后葉片CCoAOMT基因的表達(dá)差異分析

木薯綿粉蚧為害后，KU50、SC205、緬甸葉片中的CCoAOMT基因表達(dá)量逐漸升高，而SC9無顯著變化，其他品種均呈先升后降的趨勢。粉蚧為害1?d后，木薯品種SC205、面包、C1115葉片中的CCoAOMT基因表達(dá)量上升至為害前的2.51倍、1.91倍、1.92倍；粉蚧為害4?d后，感

蟲品種KU50上升至為害前的4.40倍，抗蟲品種C1115、緬甸分別上升至為害前的9.06倍、2.23倍；粉蚧為害8?d后緬甸中的表達(dá)量上升至為害前的3.59倍（圖7A）。進(jìn)一步對比相同時間不同木薯品種葉片中CCoAOMT基因的表達(dá)量后發(fā)現(xiàn)，在粉蚧為害前與為害1?d時，SC9與面包有較高的表達(dá)量，總體上抗蟲品種中的CCoAOMT基因表達(dá)量并不一定高于感蟲木薯品種（圖7B）。

2.9??木薯綿粉蚧為害抗、感木薯品種前后葉片C4H基因的表達(dá)差異分析

木薯綿粉蚧為害后，C4H基因的表達(dá)量在抗蟲木薯品種C1115、SC9葉片中呈先升后降的趨勢，在感蟲木薯品種KU50中表現(xiàn)為先降后升的趨勢，其他木薯品種中無顯著變化或稍有下降。其中粉蚧為害1?d后，抗蟲品種C1115、SC9葉片中C4H基因的表達(dá)量上升到為害前的2.16倍、2.72倍；為害4?d后，所有木薯品種中的表達(dá)量均呈下降趨勢或無顯著變化；為害8?d后，KU50上升至為害前的1.93倍（圖8A）。對比相同時間不同木薯品種葉片中C4H基因的表達(dá)量后發(fā)現(xiàn)，SC9中的表達(dá)量在粉蚧為害前以及為害4?d時遠(yuǎn)大于其他品種，但總體抗、感木薯品種無顯著差異，抗蟲木薯品種并不一定大于感蟲品種（圖8B）。

2.10??木薯綿粉蚧為害抗、感木薯品種前后葉片C3'H基因的表達(dá)差異分析

木薯綿粉蚧為害后，KU50、SC205葉片中的C3'H基因表達(dá)量呈下降趨勢，C1115、SC9、緬甸、面包中均呈先升后降的趨勢。在粉蚧為害1?d后，C3'H基因在抗蟲品種C1115、SC9、緬甸中分別上升到為害前的1.69倍、2.43倍、1.88倍，在感蟲木薯品種面包中上升至1.68倍，而KU50、SC205中無顯著變化。粉蚧為害4?d時，C3'H基因在抗蟲品種C1115、SC9中分別下降到為害前的27.5%、44.9%，在感蟲品種KU50、SC205中下降到為害前的43%、26.7%（圖9A）。對比相同時間不同木薯品種葉片中C3'H基因的表達(dá)量后發(fā)現(xiàn)，在粉蚧為害前，抗蟲木薯品種葉片中的C3'H基因表達(dá)量大于感蟲木薯品種，粉蚧為害1?d時C1115、SC9的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他品種，而在粉蚧為害4?d和8?d時，抗、感木薯品種之間的表達(dá)差異不大或無顯著差異（圖9B）。

2.11??木薯綿粉蚧為害抗、感木薯品種前后葉片ANR基因的表達(dá)差異分析

木薯綿粉蚧為害后，抗蟲木薯品種SC9葉片

中的ANR基因表達(dá)量呈先升后降再升的趨勢，緬甸中的表達(dá)量隨粉蚧為害時間的延長逐漸上升，C1115中無顯著變化；感蟲木薯品種KU50、SC205、面包中均無顯著變化或稍有下降。其中SC9葉片中的ANR基因表達(dá)量在粉蚧為害1?d時上升到為害前的1.87倍，4?d時下降到為害前的水平，8?d后升高到為害前的2.12倍；緬甸在為害1?d時上升至為害前的1.53倍，為害8?d后上升至為害前的1.86倍（圖10A）。橫向?qū)Ρ认嗤瑫r間不同木薯品種葉片中ANR基因的表達(dá)量后發(fā)現(xiàn)，抗蟲木薯品種SC9在粉蚧為害1、8?d時的表達(dá)量高于其他品種，而其他品種葉片中的表達(dá)量在各個時間均無顯著差異（圖10B）。

2.12??木薯綿粉蚧為害抗、感木薯品種前后葉片總黃酮含量的差異分析

與木薯綿粉蚧為害前相比，為害后抗、感木薯品種葉片的總黃酮含量變化顯著，為害1?d后，抗、感木薯品種總黃酮含量均顯著上升；而在為害4?d后，抗蟲木薯品種C1115、SC9、緬甸的總黃酮含量仍然維持在較高水平，而感蟲品種KU50、面包、SC205中則呈下降趨勢；粉蚧為害8?d后，6個品種的總黃酮含量無顯著變化或稍有下降，但抗蟲木薯品種中的含量顯著高于感蟲品種（表3）。相關(guān)性分析顯示，粉蚧為害4?d時，總黃酮含量與木薯品種的抗蟲性呈顯著正相關(guān)（ρ=0.9428，?P=0.0048）。

3??討論

類黃酮通路合成基因在植物應(yīng)對生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，類黃酮通路糖苷轉(zhuǎn)移酶基因（UGT79B2/B3）的過量表達(dá)可以顯著增強(qiáng)擬南芥對低溫、干旱和鹽脅迫的耐受性[23]；大豆中突變黃烷酮-3-羥化酶（F3H）和黃酮合酶（FNS）基因，防止其與異黃酮合酶（IFS）基因競爭底物，從而提高異黃酮的含量以及對大豆花葉病毒（SMV）的抗性[24]；異黃酮合成酶基因的表達(dá)量在大豆受高濃度鎘處理時顯著提高，表明其與耐受鎘脅迫密切相關(guān)[25]，MURATA等[26]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素7-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（NOMT）基因在抗真菌品種日本晴和敏感品種秈稻中的表達(dá)量存在顯著差異，從而導(dǎo)致抗真菌毒素物質(zhì)累積及抗菌水平的顯著差異。有研究發(fā)現(xiàn)，在大豆胞囊線蟲的脅迫下，抗病品種灰皮支黑豆和感病品種Williams?82的CHS基因表達(dá)量存在顯著差異，抗病品種顯著上調(diào)表達(dá)，初步認(rèn)為CHS基因在抗大豆胞囊線蟲的抗性機(jī)制中發(fā)揮重要作用[27]。本研究表明，木薯綿粉蚧為害4?d后，抗蟲木薯品種類黃酮通路合成基因（CHS、CHI、FLS、DFR、LAR、F3H）的表達(dá)量顯著高于感蟲木薯品種，其中CHS、CHI、FLS、F3H、LAR與品種抗蟲性呈顯著正相關(guān)，可以推測上述類黃酮通路合成基因可能在木薯抗木薯綿粉蚧中發(fā)揮作用，這與上述研究結(jié)果具有相似性。研究發(fā)現(xiàn)類黃酮合成通路基因的表達(dá)水平會影響類黃酮含量累積進(jìn)而影響植物的抗蟲性。如LAR和ANR是調(diào)控黃酮醇與

花青素合成的關(guān)鍵基因[28]，過表達(dá)LAR、ANR基因提高了原花青素類物質(zhì)縮合單寧的含量，從而提高了木薯對二斑葉螨的抗性[15]。類黃酮通路基因的表達(dá)還存在級聯(lián)效應(yīng)，如JAN等[29]通過干預(yù)F3H基因可以影響下游基因FLS、DFR等的表達(dá)，進(jìn)而影響花青素、山奈酚、槲皮素等多種類黃酮物質(zhì)含量，并改變了水稻的抗蟲性。此外，對轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，同樣可以影響合成通路上基因的表達(dá)及類黃酮水平。如在擬南芥中過表達(dá)MYB75轉(zhuǎn)錄因子，將同時上調(diào)CHS、DFR、FLS等基因的表達(dá)，提高花青素和黃酮醇的水平，最終提高了植物對歐洲粉蝶幼蟲的抗性[30]。研究表明，植物類黃酮含量與其抗蟲性密切相關(guān)。在番茄防御煙粉虱的研究中發(fā)現(xiàn)，類黃酮高含量品系比低含量品系更能降低煙粉虱對其韌皮部的攝食效率和番茄黃葉卷曲病毒（TYLCV）的傳播[31]，此外，黃酮類化合物還對害蟲具有體外活性，如異黃酮類物質(zhì)高麗槐素、牛蒿素等在濃度為100?mmol/L時可以有效阻止棉鈴蟲幼蟲對鷹嘴豆的取食，而加入綠原酸又可進(jìn)一步增強(qiáng)其拒食活性[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，與木薯綿粉蚧為害前相比，抗蟲木薯品種中類黃酮含量以及類黃酮合成通路基因CHS、CHI、FLS、LAR、DFR和F3H的表達(dá)量均顯著升高，并顯著高于感蟲木薯品種的含量和表達(dá)水平，推測抗蟲木薯品種被粉蚧為害后，誘導(dǎo)了上述黃酮合成基因的上調(diào)表達(dá)，從而使具有抗蟲功能的黃酮類物質(zhì)含量相較于感蟲品種顯著提高，進(jìn)而增強(qiáng)木薯抗蟲水平。

抗蟲木薯品種受木薯綿粉蚧為害后，葉片中總黃酮含量顯著提高，類黃酮合成通路基因CHS、CHI、FLS、LAR、DFR、F3H顯著上調(diào)表達(dá)，其中CHS、CHI、FLS、F3H、LAR基因的表達(dá)量與木薯品種抗蟲性呈顯著正相關(guān)，表明上述5個基因可能參與類黃酮合成途徑介導(dǎo)的木薯抗木薯綿粉蚧的分子機(jī)制。本研究分析了木薯綿粉蚧為害后抗、感木薯品種葉片中類黃酮合成通路基因表達(dá)量以及總黃酮含量的差異，后續(xù)研究需開展相應(yīng)合成酶活性的測定，明確基因-蛋白-代謝物的變化趨勢是否具有一致性，并進(jìn)一步通過體外抗蟲活性試驗明確具體發(fā)揮抗蟲作用的類黃酮物質(zhì)，從而進(jìn)一步揭示特定的類黃酮合成基因介導(dǎo)的木薯抗蟲功能。

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