木薯葉黃酮醇檢測方法優(yōu)化及其含量比較分析

王琴飛 林立銘 薛茂富 張金泉 余厚美 張振文

摘??要：木薯葉富含豐富的黃酮醇類物質(zhì)，高效的提取和分析方法可為獲取木薯葉黃酮醇提供至關(guān)重要的評價技術(shù)。本研究旨在優(yōu)化木薯葉中4種黃酮醇物質(zhì)（楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷）的提取和檢測方法，以及分析不同木薯品種、采收期和成熟度對這些黃酮醇含量的影響。結(jié)果表明：使用50%乙醇水溶液，料液比為1∶50（g/mL），超聲提取溫度50?℃，超聲提取時間60?min可有效提取木薯葉中的4種黃酮醇；不同的C18色譜柱配備HPLC-DAD能有效分離木薯葉中的4種黃酮醇；方法驗(yàn)證結(jié)果顯示，4種黃酮醇在一定濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好，R2分別達(dá)到0.9999、0.9999、0.9999和0.9998；檢出限在6.0～10.0?mg/kg之間；定量限在20.0～32.0?mg/kg之間；檢測方法系統(tǒng)適應(yīng)性較好，保留時間和峰面積變化相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于1%；樣品日內(nèi)、日間和月內(nèi)穩(wěn)定性較好，含量變化RSD在0.44%～3.57%之間，平均加標(biāo)回收率在92.68%～109.14%之間，RSD均小于6.0%。利用建立的提取和分析方法，分析了30個木薯種質(zhì)中4種黃酮醇含量，蘆丁和煙花苷含量占4種黃酮醇總量的93.50%～99.30%，其含量高低由蘆丁和煙花苷決定，但品種間決定黃酮醇總含量高低的相關(guān)性順序?yàn)樘J?。舅绍眨緹熁ㄜ眨緱蠲奋?；木薯種質(zhì)的不同采收期和不同成熟度葉片中黃酮醇分析表明，在多數(shù)木薯種質(zhì)中，第270天采收的蘆丁、煙花苷和水仙苷含量高于第180天，楊梅苷因品種而異；不同木薯種質(zhì)（除SC09外）幼葉期的楊梅苷、蘆丁和煙花苷含量均高于嫩葉期和成熟期；成熟期（除花葉木薯）水仙苷含量均高于幼葉期和嫩葉期。本研究結(jié)果可為木薯葉黃酮醇物質(zhì)的開發(fā)利用（原料的選擇、質(zhì)量控制等方面）提供評價技術(shù)和依據(jù)，也為揭示木薯葉黃酮醇物質(zhì)積累規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：木薯葉；黃酮醇；HPLC；采收時期；成熟度中圖分類號：S533??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Optimization?of?Detection?Methods?for?Flavonols?in?Cassava?Leaves

WANG?Qinfei1，?LIN?Liming1，?XUE?Maofu1，?ZHANG?Jinquan2，?YU?Houmei1，?ZHANG?Zhenwen1*

1.?Tropical?Crops?Genetic?Resources?Institute，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences?/?National?R?&?D?Centre?for?Potato?Processing，?Haikou，?Hainan?571101，?China;?2.?College?of?Horticulture，?Hunan?Agricultural?University，?Changsha，?Hunan?410000，?China

Abstract：?Cassava?leaves?are?rich?in?abundant?flavonols，?and?efficient?extraction?and?analysis?methods?are?crucial?for?the?evaluation?of?flavonol?content?in?the?cassava?leaves.?This?study?aims?to?optimize?the?extraction?and?detection?methods?for?four?flavonols?（myricetin，?rutin，?nicotiflorin，?narcissoside）?in?cassava?leaves?and?to?analyze?the?influence?of?different

cassava?varieties，?harvesting?periods，?and?maturity?on?the?content?of?these?flavonols.?The?results?indicated?that?using?a

50%?ethanol-water?solution，?a?liquid-to-material?ratio?of?1∶50?（g/mL），?an?ultrasonic?extraction?temperature?of?50?℃，

and?an?ultrasonic?extraction?time?of?60?minutes?could?effectively?extract?the?four?flavonols?in?the?cassava?leaves.?The

combination?of?different?C18?chromatographic?columns?in?HPLC-DAD?effectively?separated?the?four?flavonoids?present?in?the?cassava?leaves.?The?results?of?the?method?validation?showed?that?the?four?flavonols?exhibited?good?linear?correlations?within?a?certain?concentration?range，?with?R2?values?of?0.9999，?0.9999，?0.9999?and?0.9998，?respectively.?The?detection?limits?ranged?from?6.0?mg/kg?to?10.0?mg/kg，?and?the?quantification?limits?ranged?from?20.0?mg/kg?to?32.0?mg/kg.?The?detection?method?demonstrates?good?system?adaptability，?with?retention?time?and?peak?area?relative?standard?deviations?（RSD）?being?less?than?1%.?The?samples?showed?good?stability?in?terms?of?intra-day，?inter-day，?and?intra-month?variations，?with?RSD?in?content?variations?ranging?from?0.44%?to?3.57%.?The?average?recovery?rates?of?the?method?ranged?from?92.68%?to?109.14%，?all?with?RSD?values?less?than?6.0%.?Utilizing?the?established?extraction?and?analysis?methods，?the?study?analyzed?the?content?of?the?four?flavonols?in?30?cassava?germplasm?resources.?Rutin?and?nicotiflorin?maked?up?93.50%?to?99.30%?of?the?total?flavonol?content?in?the?cassava?leaves，?with?the?levels?primarily?determining?the?total?flavonol?content.?However，?the?correlation?order?for?the?total?flavonol?content?among?different?varieties?was?rutin>narcissoside>nicotiflorin>myricetin.?Analysis?of?flavonol?content?in?the?cassava?leaves?from?different?harvest?times?and?maturity?levels?of?cassava?germplasm?revealed?that?in?most?cases，?the?levels?of?rutin，?nicotiflorin?and?narcissoside?were?higher?in?the?leaves?harvested?at?270?days?compared?to?those?harvested?at?180?days，?with?myricetin?varying?by?variety.?Except?for?SC09，?the?levels?of?myricetin，?rutin?and?nicotiflorin?were?higher?in?the?young?leaves?compared?to?the?tender?and?mature?leaves?in?different?cassava?germplasms.?The?content?of?narcissoside?in?mature?leaves?（except?for?flower?leaf?cassava）?was?higher?than?that?in?young?leaves?and?tender?leaves.?The?results?would?provide?an?evaluation?basis?for?the?development?and?utilization?of?cassava?flavonols?in?the?selection?of?raw?materials?and?quality?control，?and?lay?a?foundation?for?revealing?the?accumulation?rules?of?cassava?flavonols.

Keywords：?cassava?leaves;?flavonols;?HPLC;?harvest?time;?maturity

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.008

木薯（Manihot?esculenta?Crantz）屬熱帶和亞熱帶的塊根作物，與甘薯、馬鈴薯并稱為世界三大薯類，有“淀粉之王”和“能源作物”之美譽(yù)。木薯葉作為木薯采收后的主要副產(chǎn)物，占整個植株生物量的9%，因其富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素，在撒哈拉以南的非洲國家和一些亞洲國家（印度尼西亞、菲律賓和馬來西亞等）常作為蔬菜以補(bǔ)充營養(yǎng)，或被用于動物飼料[1-5]。全世界木薯產(chǎn)量達(dá)3.15億t（2021年FAO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)），盡管許多國家廣泛種植木薯，也很容易獲得木薯葉，但因其具有高含量的氰化物而被丟棄或留在田間，這不僅浪費(fèi)資源，且對環(huán)境造成嚴(yán)重污染。研究顯示，木薯葉除含有人體必需的主要營養(yǎng)物質(zhì)外，還富含黃酮類化合物[6]。自然界中黃酮類化合物常以不同的黃酮醇苷類化合物穩(wěn)定存在于植物組織中，具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化等作用，可用作營養(yǎng)保健品的膳食類黃酮的替代來源廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、保健品、食品等領(lǐng)域[7-10]。然而，提高植物類黃酮產(chǎn)量、穩(wěn)定或增加食品加工過程中和營養(yǎng)保健品的黃酮含量仍是亟待解決的科學(xué)問題[11]。因此，選擇富含黃酮類化合物的植物，開發(fā)高效、安全的提取方法，最大程度地獲取植物類黃酮，是未來提高木薯葉等植物工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)黃酮類化合物的主要因素[12]。目前，固-液萃取是應(yīng)用最廣泛的黃酮類化合物提取方法，但該方法使用大量溶劑、耗時長、效率低，由于長時間加熱而導(dǎo)致能耗高[13-14]。新的提取技術(shù)，如超聲輔助萃?。║AE）、微波輔助萃取（MAE）、酶輔助萃?。‥AE）、高壓萃?。℉PE）和超臨界流體萃?。⊿FE）提取天然活性物質(zhì)具有提取率高、速度快，且不改變有效成分等優(yōu)點(diǎn)，并在木薯次生代謝產(chǎn)物中得到廣泛應(yīng)用[12，?14-17]。研究者利用HPLC-MS、HPLC-DAD等色譜分析方法從木薯葉中鑒定到蘆丁、煙花苷、槲皮素、山奈酚、楊梅苷、金絲桃苷、剌槐苷、水仙苷8種黃酮醇，其中，蘆丁、煙花苷含量約占黃酮醇總量的99.0%以上[6]，但不同的木薯品種、生育期、采收期和種植環(huán)境均會影響其含量[18-19]，篩選獲得高含量、穩(wěn)定的黃酮醇類物質(zhì)是提高木薯葉片利用價值的重要途徑。本研究在課題組前期建立的分析方法基礎(chǔ)上[19]，優(yōu)化并建立木薯葉中主要的4種黃酮醇提取和定量分析方法，應(yīng)用于不同的木薯品種、采收期、成熟度葉片中黃酮醇的分析評價，以期為木薯葉黃酮醇開發(fā)利用、原料的選擇和質(zhì)量控制等提供檢測依據(jù)，為木薯葉的高值化利用提供技術(shù)支持。

1??材料與方法

1.1??材料

1.1.1??植物材料??木薯葉片采摘于海南儋州國家木薯種質(zhì)資源圃，木薯于2022年3月種植，參試木薯種質(zhì)見表1。

1.1.2??主要試劑??標(biāo)準(zhǔn)樣品楊梅苷（楊梅素-3-O-蕓香糖苷，myricitrin）、蘆?。ㄩ纹に?3-O-蕓香糖苷，rutin）、煙花苷（山奈酚-3-O-蕓香糖苷，nicotiflorin）、水仙苷（異鼠李素-3-O-蕓香糖苷，?narcissoside），純度≥98.0%，購自上海源葉生物發(fā)展有限公司。甲醇、乙腈為色譜純，購自美國Sigma公司。無水乙醇、磷酸等為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚四氟乙烯（PTFE）微孔濾膜（0.22?μm），購自天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.1.3??儀器設(shè)備??Agilent1260型液相色譜系統(tǒng)，配備自動進(jìn)樣器（型號：G1329B）、二極管陣列檢測器（型號：G1315D）和柱溫箱（型號：G1316A）。色譜柱：Agilent?ZORBAX?Eclipse?XDB?C18（250?mm×4.6?mm，?5?μm）購自美國Agilent科技有限公司；超聲波清洗器（型號：SB25-?12DT），購自寧波新芝生物有限公司；Elix3+?Synergy超純水系統(tǒng)，購自美國Millipore公司。

1.2??方法

1.2.1??樣品采集和制備??采摘種植后第180天嫩葉期的木薯葉片，考察不同種質(zhì)木薯葉片黃酮含量的差異；分別在種植后第180天和第270天采摘木薯葉片，考察不同采收時期的黃酮醇含量差異；參考文獻(xiàn)[20-21]的方法在木薯種植后第180天時采集葉片，采摘5～10株不同木薯種質(zhì)的幼葉、嫩葉和成熟葉，考察不同成熟度木薯葉片4種黃酮醇含量的差異，其中，幼葉期為頂部向下1～4片未展開葉片，嫩葉期為頂部向下4～8片展開未木質(zhì)化的葉片，成熟期為頂部向下8～12片展開未黃化的葉片；木薯葉片采集后，迅速用液氮速凍，裝入潔凈的密封袋中，冷凍密封避光保存于-80?℃冰箱，待用。

1.2.2??黃酮醇提取方法的優(yōu)化??參考文獻(xiàn)[14，?19]對黃酮醇提取效率影響較大的因素乙醇濃度（20%、40%、50%、60%、80%、100%）、料液比（1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90）進(jìn)行優(yōu)化，利用不同的提取量（0.2、0.5、1.0?g）和提取次數(shù)（1次、2次）驗(yàn)證其提取效果。對以上提取條件進(jìn)行考察時，超聲提取溫度為50?℃，提取時間為60?min。

1.2.3??木薯葉片中黃酮醇的提取??取適量的木薯葉片，加入液氮研磨后，準(zhǔn)確稱取研磨后的木薯葉粉0.2?g（精確至0.0001?g）于15?mL離心管中，加入50%乙醇水溶液5.0?mL，超聲提取60?min（50?℃，?500?W），混勻，離心10?min（4200?r/min，?25?℃）；上清液轉(zhuǎn)移至10?mL容量瓶中，殘?jiān)偌尤?.0?mL?50%乙醇水溶液，旋渦振蕩混勻，離心5?min（4200?r/min，?25?℃），合并2次離心的上清液，加入50%乙醇溶液定容至10?mL，混勻即為待測液。取1.0?mL待測液，通過0.22?μm?PTFE微孔濾膜，供高效液相色譜儀測定。

1.2.4??色譜條件優(yōu)化??參考文獻(xiàn)[16，?19]，對檢測波長、流動相組成及洗脫程序、色譜柱等進(jìn)行優(yōu)化比較，確定其最佳的條件。最后，確定穩(wěn)定性較好，價格偏低的Agilent?ZORBAX?Eclipse?XDB?C18（250?mm×4.6?mm，?5?μm）色譜柱1進(jìn)行樣品分析。以甲醇（A）和0.2%磷酸水（B）溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋浩鹗紴?5%?A，75%?B；15?min時A為58%，B為42%；20?min時A為80%，B為20%；25?min時A為100%，B為0；27?min時，A為25%，B為75%，平衡柱子5?min，進(jìn)下一個樣；流速為0.8?mL/min；檢測波長為360?nm；進(jìn)樣量為10?μL；柱溫為40?℃。所有樣品進(jìn)樣前經(jīng)0.22?μm?PTFE微孔濾膜過濾。采用外標(biāo)法定量。

1.2.5??標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作??分別稱取適量的楊梅苷、蘆丁、煙花苷、水仙苷標(biāo)準(zhǔn)樣品，用色譜甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為1.0、6.0、3.0、1.0?mg/mL的單標(biāo)母液，保存于-18?℃冰箱中，再用色譜甲醇依次稀釋，配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22?μm?PTFE微孔濾膜過濾后備用。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，以峰面積（mV）為縱坐標(biāo)（y），標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)（x），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸分析。

1.2.6??方法檢出限和定量限測定??稱取經(jīng)液氮研磨后的木薯葉粉0.2?g（精確至0.0001?g），加入50%乙醇水溶液超聲提取黃酮醇，離心后棄上清液，殘?jiān)磸?fù)洗脫3～5次，直到洗脫液上機(jī)檢測不到4種黃酮醇，再在殘?jiān)屑尤氩煌瑵舛鹊?種黃酮醇混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液200.0?μL，用氮?dú)獯蹈蓸悠?，使其?biāo)準(zhǔn)溶液被樣品吸收后，按1.2.2和1.2.3的提取和檢測方法分析樣品，并按樣品中4種黃酮醇的峰高和儀器噪音的比值計(jì)算信噪比（S/N），分別以S/N>3和S/N>10的樣品濃度確定方法的檢出限和定量限，設(shè)置5個重復(fù)。

1.2.7??方法系統(tǒng)適應(yīng)性評價??隨機(jī)選擇1個樣品，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算樣品色譜圖中楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷的保留時間、峰面積和拖尾因子變化的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察檢測方法的重復(fù)性，以測試方法的系統(tǒng)適應(yīng)性。

1.2.8??樣品的日內(nèi)、日間和月間穩(wěn)定性試驗(yàn)??任意選擇1個加標(biāo)待測樣品置于室溫下，每隔4?h測定其響應(yīng)值，計(jì)算樣品中楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷含量變化的RSD值，考察樣品在24?h的日內(nèi)穩(wěn)定性。任意選擇1個加標(biāo)待測樣品在?18?℃條件下避光放置，分別在提取后第1、10、20、30天對同一份樣品進(jìn)行測定，計(jì)算樣品中楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷含量變化的RSD值，考察樣品溶液冷凍條件下避光放置的月內(nèi)穩(wěn)定性。將木薯葉樣品避光放置于?18?℃條件下，分別在放置后第1、3、6、9、12個月，按1.2.2的方法提取樣品中黃酮醇進(jìn)行上機(jī)分析，計(jì)算樣品中楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷含量變化的RSD值，考察不同保存時間樣品中黃酮醇的穩(wěn)定性。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.9??樣品的加標(biāo)回收試驗(yàn)??準(zhǔn)確稱取木薯葉粉0.2?g（精確至0.0001?g），根據(jù)考察樣品濃度范圍按高、中、低3個濃度水平加標(biāo)，每個水平重復(fù)3次，按1.2.2提取4種黃酮醇類物質(zhì)，進(jìn)行回收率和準(zhǔn)確度試驗(yàn)。以回歸方程計(jì)算樣品濃度，并計(jì)算樣品平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，以此評價方法的準(zhǔn)確度。

1.3??數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft?Excel?2015軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用Origin?2021軟件制圖，采用IBM?SPSS?Statistics?22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性、相關(guān)性和聚類分析；采用最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行數(shù)據(jù)的多重比較。方法學(xué)驗(yàn)證參考《中國藥典》2020版的分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則開展試驗(yàn)。

2??結(jié)果與分析

2.1??提取方法的優(yōu)化

研究表明，提取溶液和料液比是影響黃酮類物質(zhì)提取效率的最大影響因素[6，?19，?22]。本研究采用超聲波輔助提取法，對提取溶液乙醇比例和料液比進(jìn)行優(yōu)化，并考察樣品量和提取次數(shù)對4種黃酮醇總含量的影響。結(jié)果表明，40%～60%乙醇濃度適合提取木薯葉中4種黃酮醇，在此范圍內(nèi)黃酮醇總含量無顯著差異，在乙醇濃度為50%時黃酮醇提取含量達(dá)到最高（5832.5?mg/kg）；高乙醇濃度（80%～100%）不適合黃酮醇的提取（圖1A）。以50%乙醇濃度，1∶10～1∶90（g/mL）料液比進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)料液比為1∶30、1∶50、1∶70進(jìn)行提取時，4種黃酮醇總含量均未達(dá)到顯著性差異，料液比為1∶50時，總黃酮醇含量達(dá)到6657.3?mg/kg（圖1B）。以1∶50的料液比，對樣品量和提取次數(shù)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)樣品量大小不影響4種黃酮醇的提取效果（圖1C）；2次提取，可以增加4種黃酮醇含量，增加量分別為8.3、326.0、111.2、12.3?mg/kg，但增加量未達(dá)顯著性差異（圖1D）。試驗(yàn)確定了木薯葉中4種黃酮醇的提取方法為：提取溶液為50%乙醇水溶液，料液比為1∶50（g/mL），分2次加入提取溶液，在超聲溫度為50?℃下提取60?min，可獲得較好的提取效果。

2.2??檢測波長的確定

在200～600?nm范圍內(nèi)對楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷的混合標(biāo)樣溶液進(jìn)行紫外掃描，4種黃酮醇物質(zhì)在該波長范圍內(nèi)分別在260、360?nm左右有2個特征吸收高峰（表2），因此，選擇4個黃酮醇最大吸收峰處360?nm為檢測波長。

2.3??流動相的選擇

黃酮醇的檢測流動相主要用乙腈或甲醇和加酸（磷酸、乙酸等）的水溶液進(jìn)行梯度洗脫，參不同大寫字母表示差異極顯著（P<0.01）；不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

考文獻(xiàn)[16-17]的方法，比較了乙腈∶0.25%乙酸溶液（圖2A）和甲醇∶0.2%磷酸溶液（圖2B）2種流動相配比對4種黃酮醇混合標(biāo)準(zhǔn)品分離效果的影響，分析發(fā)現(xiàn)，磷酸水溶液更適合分析4種黃酮醇，乙腈∶0.25%乙酸溶液不能有效地分離煙花苷和水仙苷。

2.4??流動相的梯度洗脫程序優(yōu)化

為了獲得樣品中4種黃酮醇的最佳分離效果，參考文獻(xiàn)[19]的方法，對流動相梯度程序進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)甲醇∶0.2%磷酸溶液的起始流動相比例為25%時洗脫分析樣品，楊梅苷的干擾峰可以完全分離（圖3A），而起始流動相比例為40%洗脫時，雖然可以縮短樣品的洗脫時間，但有干擾峰影響楊梅苷的積分（圖3B），通過比較分離效果，確定木薯葉中4種黃酮醇的洗脫程序（見1.2.3）。

2.5??色譜柱的選擇

在進(jìn)行黃酮類物質(zhì)進(jìn)行分析的過程中，研究者多采用C18色譜柱，但不同品牌和填料修飾其分離效果有差異，利用優(yōu)化后的流動相比例（甲醇∶0.2%磷酸溶液），比較了3個品牌色譜柱的分析效果[色譜柱1：Agilent?ZORBAX?Eclipse?XDB-?C18?（Analytical?4.6?mm×250?mm，?5μm）；色譜柱2：Waters?Atlantis??C18?（150?mm×4.6?mm，?5?μm）；色譜柱3：Merk?Purospher??STAR?RP-18e?（Hibar??150?mm×4.6?mm，?5?μm]，發(fā)現(xiàn)3個品牌的色譜柱均可以有效分離4種黃酮醇類化合物（圖4）。結(jié)果表明，C18柱（250?mm×4.6?mm，?5?μm）或性能相當(dāng)?shù)纳V柱均能有效分離木薯葉中楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷4種黃酮醇類物質(zhì)。

2.6??方法學(xué)考察

2.6.1??線性關(guān)系考察??以不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)品檢測峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，由峰面積（y）對溶液濃度（x）作線性回歸方程，并得出相關(guān)系數(shù)（R2）。如表3所示，楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷在濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，R2均大于0.9998。

2.6.2??方法檢出限和定量限??通過空白樣品加標(biāo)法，加入低濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)入洗脫的樣品中，考察方法的檢出限和定量限。結(jié)果顯示，木薯葉中楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷4種黃酮醇的檢出限分別為10.0、10.0、6.0、6.0?mg/kg，木薯葉中4種黃酮醇的定量限分別為32.0、27.0、20.0、20.0?mg/kg（表4）。

2.6.3??方法系統(tǒng)適應(yīng)性評價??以楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷4種黃酮醇濃度分別為50、300、150、50?mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，考察方法的重復(fù)性和峰拖尾情況，以此評價方法系統(tǒng)適應(yīng)性。由表5可知，保留時間和峰面積變化的RSD均小于1%，峰的拖尾因子在1.12～1.19之間，證明方法的重復(fù)性較好，色譜峰形較好。

2.6.4??樣品的日內(nèi)、日間和月間穩(wěn)定性試驗(yàn)??在24?h內(nèi)，每隔4?h測定加標(biāo)待測樣品中4種黃酮

醇含量，4種黃酮醇含量變化的RSD在0.44%～?1.04%之間，表明樣品在常溫條件下放置，日內(nèi)（24?h）穩(wěn)定性較好。將待測加標(biāo)樣品溶液避光置于?18?℃條件下，分別在提取后第1、10、20、30天對同一份樣品進(jìn)行測定，4種黃酮醇30?d內(nèi)含量變化的RSD在1.45%～3.57%之間，證明提取樣品在冷凍條件下避光放置30?d內(nèi)，樣品穩(wěn)定性較好。將樣品避光置于?18?℃條件下，分別在保存1、3、6、9、12個月，提取樣品中黃酮醇上機(jī)分析，4種黃酮醇含量變化的RSD在1.37%～3.31%之間，證明樣品在?18?℃冰箱中保存12個月，樣品中的黃酮醇含量穩(wěn)定性較好（表6）。

2.6.5??方法回收率和準(zhǔn)確度??以樣品加標(biāo)法，通過低、中、高3個濃度進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，加標(biāo)回收濃度變化的RSD≤5.31%，楊梅苷平均回收率在94.71%～97.81%之間；蘆丁平均回收率96.78%～102.21%之間；煙花苷平均回收率為92.68%～100.07%；水仙苷平均回收率為93.69%～109.14%；RSD均小于6.00%，加標(biāo)回收結(jié)果證明該方法的準(zhǔn)確度較高，重復(fù)性較好，可用于實(shí)際樣品的測定（表7）。

2.6.6??不同品種、采收期和成熟度對木薯葉中黃酮醇含量的影響??利用建立的提取方法和檢測方法，對不同品種、不同成熟度和不同采收期木薯葉中的4種黃酮醇進(jìn)行考察。對比王定美等[18]的研究結(jié)果，本研究中種植180?d的木薯葉黃酮含量較好，因此，采摘30個木薯種質(zhì)種植180?d時嫩葉期木薯葉片進(jìn)行4種黃酮醇含量分析（圖5）。結(jié)果表明，30個木薯種質(zhì)葉片中的楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷含量分別在0～554.62、1190.26～?8852.21、312.06～3691.51、50.87～283.25?mg/kg之間，品種間黃酮醇含量差異較大，蘆丁和煙花苷含量占4種黃酮醇總量的93.5%～99.3%，這與CHAHYADI等[14]的結(jié)果一致。4種黃酮醇含量較高的品種為SC11、紫葉木薯和KU50。

30個木薯種質(zhì)葉片中4種黃酮醇相關(guān)分析表明（表8），不同種質(zhì)間4種黃酮醇含量的相關(guān)性達(dá)顯著或極顯著，其中，蘆丁、水仙苷與總黃酮含量相關(guān)性較高，相關(guān)系數(shù)分別為0.967、0.915，煙花苷、楊梅苷與總黃酮含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.782、0.693。雖然蘆丁和煙花苷含量占總黃酮醇含量的93.5%～99.3%，但不同種質(zhì)間水仙苷含量也與總黃酮醇含量相關(guān)系數(shù)較高，同樣可作為判定總黃酮含量高低的指標(biāo)。

進(jìn)一步對30份木薯種質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，聚類距離采用歐式距離平方法，聚類方法采用組間聯(lián)接法，根據(jù)不同種質(zhì)類間距離進(jìn)行區(qū)分，得到不同種質(zhì)聚類樹狀圖（圖6）。歐式距離超過5時可分為3類，即第一類為SC11、紫葉木薯、KU50三個蘆丁和煙花苷含量相對較高的種質(zhì)；第二類為花葉木薯、SC09、SC124等蘆丁、水仙苷含量相對較高的種質(zhì)；第三類為SC205、GR911、糖木薯4種黃酮醇含量相對較低的種質(zhì)，大部分種質(zhì)集中在第二類。

根據(jù)聚類分析結(jié)果，選擇3類7個木薯種質(zhì)在種植后第180天和第270天采摘葉片，分析不同采收時期4種黃酮醇含量的差異（圖7）。結(jié)果表明，第270天采收時多數(shù)種質(zhì)葉片中的蘆丁、煙花苷和水仙苷含量高于第180天，第270天采收的第一類種質(zhì)（紫葉木薯和SC11）中黃酮醇含量均高于第二類和第三類；在第180天采收時，第二類和第三類部分種質(zhì)（如SC9、印尼細(xì)葉、SC205）的楊梅苷含量顯著高于第270天采收的，但蘆丁占黃酮醇總含量的90%，表明不同采收時期種質(zhì)間黃酮醇總含量高低由蘆丁含量決定。因此，可選擇不同種植時間采收木薯葉，以獲得相對含量較高的黃酮醇目標(biāo)物質(zhì)。

通過分析種植180?d不同成熟度木薯葉中4種黃酮醇含量（圖8）結(jié)果表明，不同木薯種質(zhì)中，除SC9種質(zhì)幼葉期的楊梅苷含量略低于嫩葉期和老葉期外，其他6個木薯種質(zhì)幼葉期的楊梅苷、蘆丁和煙花苷含量均高于嫩葉期和成熟葉，而前期研究發(fā)現(xiàn)嫩葉期蘆丁和煙花苷含量較高[19]，這可能與采收時間和考察品種有關(guān)，如SC9嫩葉期和幼葉期的蘆丁和煙花苷含量無顯著差異。除花葉木薯外，其余種質(zhì)成熟葉中的水仙苷含量均高于幼葉期和嫩葉期?？疾斓?類7個種質(zhì)中，楊梅苷、蘆丁和煙花苷含量在幼葉期或嫩葉期較高，水仙苷在成熟葉中含量較高。

3??討論??

黃酮類化合物的提取多采用醇提或水提的方法[13，?23-24]，木薯葉中黃酮類化合物較多，研究顯示，木薯葉中主要的黃酮醇化合物為蘆丁和煙花苷[6]，前期研究者主要根據(jù)化合物組成選擇提取方法，并證明乙醇溶液超聲輔助方法可以有效提取蘆丁[24]。課題組前期試驗(yàn)結(jié)果[19]也表明，乙醇濃度和料液比會影響黃酮醇的提取率，以40%和80%乙醇水溶液分步提取可以有效獲得木薯葉中蘆丁、煙花苷、槲皮素、山柰酚4種黃酮醇，其中槲皮素和山奈酚并不是木薯葉中的主要黃酮醇化合物。本研究通過優(yōu)化乙醇濃度和料液比，明確了利用40%～60%乙醇溶液均可有效提取4種黃酮醇（蘆丁、煙花苷、水仙苷和楊梅苷），但由于關(guān)注的主要黃酮醇化合物不同，料液比與前期結(jié)果[19]存在差異，其超聲溫度和時間對其提取效果并無顯著影響，這與CHAHYADI等[14]的研究結(jié)果一致。因此，選擇4種黃酮醇總含量提取率較高的50%乙醇水溶液，料液比1∶50（g/mL）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。同時，試驗(yàn)也證實(shí)醇提可以提高黃酮醇化合物的提取效率，在適宜料液比的前提下，提取效率不受樣品量和提取次數(shù)的影響。通過對檢測波長進(jìn)行掃描，對流動相比例和系統(tǒng)程序、色譜柱的選擇進(jìn)行了優(yōu)化，建立了木薯葉中黃酮醇的HPLC分析方法。多數(shù)黃酮醇在280?nm和360?nm左右會有2個吸收峰，從吸收波長掃描顯示，360?nm左右是黃酮醇的最大吸收峰。有研究表明，多數(shù)類黃酮物質(zhì)在280?nm有最大吸收峰[25]，為避免部分黃酮類物質(zhì)對黃酮醇檢測的干擾，選擇360?nm波長更有利于黃酮醇的檢測。甲醇-磷酸水溶液和乙腈-乙酸水溶液流動相系統(tǒng)一直是分析類黃酮物質(zhì)的最佳選擇[23]，但在分析過程中發(fā)現(xiàn)，乙腈-乙酸水溶液作為流動相更適合分析黃酮類物質(zhì)；甲醇-磷酸水流動相經(jīng)過優(yōu)化，在進(jìn)行黃酮醇類物質(zhì)分析過程中，能避免其他黃酮化合物的干擾，并完全分離黃酮醇物質(zhì)；另外，C18色譜柱是分析黃酮類化合物常用的色譜柱類型，但不同品牌的C18色譜柱價格不同，通過比較發(fā)現(xiàn)，考察的C18色譜柱均可以有效分離木薯葉中的4種黃酮醇，選擇合適的色譜柱可為后期大量樣品的分離和定量分析節(jié)約成本。

參考《中國藥典》（2020版）分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明，建立的檢測方法線性相關(guān)性較好，R2均在0.9998以上；檢測限和定量限分別在6.0～10.0?mg/kg和20.0～?32.0?mg/kg之間；檢測方法系統(tǒng)適應(yīng)性也較好，回收率較高，完全可用于實(shí)際樣品的測定，并發(fā)現(xiàn)樣品中黃酮醇在不同的樣品狀態(tài)下日內(nèi)、日間和月間穩(wěn)定性較好，這為后期樣品的保存提供了參考。利用建立的提取和檢測方法，分析了30個木薯種質(zhì)中4種黃酮醇含量，種質(zhì)間黃酮醇總含量差異較大，蘆丁和煙花苷含量占4種黃酮醇總量的93.5%～99.3%，這與TAO等[6]的研究結(jié)果一致；而王定美等[18]、詹春蓮等[25]的研究認(rèn)為，木薯葉中主要的黃酮物質(zhì)是蘆丁、二氫黃酮醇和穗花杉雙黃酮，在質(zhì)譜定性檢測過程中也發(fā)現(xiàn)了2種含量較高的雙黃酮化合物，通過光譜和色譜圖比較發(fā)現(xiàn)，王定美等[18]在檢測中并未對煙花苷進(jìn)行定量分析，詹春蓮等[25]在進(jìn)行木薯葉類黃酮指紋圖譜建立過程中，僅考察了270?nm波長下的色譜峰，而本研究中煙花苷的紫外最大吸收峰在350?nm處，由此導(dǎo)致了結(jié)果差異。雖然黃酮醇總含量由蘆丁和煙花苷決定，但相關(guān)性分析表明，種質(zhì)間黃酮醇總含量高低的相關(guān)性順序?yàn)樘J丁>水仙苷>煙花苷>楊梅苷；選擇聚類分析對3類7個木薯種質(zhì)不同采收期和不同成熟度葉片進(jìn)行分析表明，在多數(shù)木薯種質(zhì)中第270天時采收的葉片中蘆丁、煙花苷和水仙苷含量高于第180天采收的，少部分種質(zhì)的葉片第270天時采收楊梅苷含量高于第180天；但不同木薯種質(zhì)（除SC09外）幼葉期的楊梅苷、蘆丁和煙花苷含量均高于嫩葉期和成熟期；成熟期水仙苷含量（除花葉木薯外）均高于幼葉期和嫩葉期。研究表明，黃酮醇作為次生代謝產(chǎn)物可通過與生長素、細(xì)胞分裂素和活性氧共同調(diào)控植物向光性生長及發(fā)育，槲皮素和山奈酚（或其衍生物）等黃酮醇很可能通過限制分生區(qū)細(xì)胞分化，加速細(xì)胞伸長進(jìn)而調(diào)控植物組織的生長，幼葉和嫩葉期細(xì)胞分裂旺盛，并且不同的黃酮醇合酶基因調(diào)控著不同的黃酮醇積累[26-28]，蘆丁和煙花苷分別是槲皮素和山奈酚糖苷類代謝物，因此，在幼葉期或嫩葉期積累較多。各種黃酮醇物質(zhì)在植物不同組織、不同發(fā)育階段以及不同環(huán)境條件下扮演的精細(xì)角色，激素和環(huán)境因子均影響其合成[29]。但木薯葉中黃酮醇是否受植物激素等協(xié)同調(diào)控、黃酮醇合酶基因的調(diào)控，各種黃酮醇合成的機(jī)制揭示等問題仍有待于進(jìn)一步深入探討。

總之，建立高效的提取和分析方法是了解木薯葉片中黃酮醇化合物組成和含量的基礎(chǔ)，木薯葉中黃酮醇含量受品種、采收期和成熟度的共同影響，為獲得高含量黃酮醇植物源，開發(fā)利用好木薯葉中黃酮醇物質(zhì)，進(jìn)一步研究木薯葉中黃酮醇合酶基因的調(diào)控機(jī)制，有助于更深入地了解4種黃酮醇積累與木薯品種、采收期和成熟度的關(guān)系，為揭示木薯葉中黃酮醇物質(zhì)積累規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

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