豬塞內(nèi)卡病毒病的研究進(jìn)展

吳宣，張永寧，曾憲春，王英，侯巍

（1.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.四川畜牧獸醫(yī)雜志傳媒有限責(zé)任公司，四川 成都 610041）

1 流行病學(xué)特征

1.1 易感動(dòng)物 SVA 主要感染豬，不同性別、年齡階段的豬均易感，但SVA的致病力隨著不同菌株或豬品種、年齡的不同存在巨大的差異。潛伏期一般為4～5 d，發(fā)病率和死亡率因豬群年齡、來源和地理分布等因素影響存在一定的差異，母豬和育肥豬發(fā)病后死亡率極低，而仔豬發(fā)病后死亡率高。本病危害最大的是新生仔豬，發(fā)病率高達(dá)70%以上，死亡率達(dá)到15%～30%。國外有研究報(bào)告，牛、鼠、蒼蠅甚至人的血清中都存在A型塞內(nèi)卡病毒（SVA）抗體，提示這些物種可能是SVA的自然宿主或SVA可感染動(dòng)物［2］。

1.2 傳染源和傳播途徑 攜帶病毒的感染豬是SVA最主要的傳染源，包括患病豬和無臨床癥狀的病毒攜帶豬?；疾∝i和隱性感染豬通過唾液、消化道、水皰等途徑排出SVA，康復(fù)豬組織中也能檢測(cè)到SVA的RNA。患病豬舍、通道、圍欄、屠宰工具上以及食物、水源等環(huán)境樣本中都能檢測(cè)到病毒RNA?；疾∝i場(chǎng)內(nèi)的蒼蠅及老鼠的糞便和小腸樣本中同樣可分離到SVA活病毒，健康豬通過接觸而間接感染。接觸患病豬的飼養(yǎng)人員如果消毒不徹底，也能成為潛在的傳染源，但人不會(huì)感染。Leme 等［3］對(duì)患病母豬分娩的1～5 日齡仔豬進(jìn)行了免疫組化和RT-PCR 檢測(cè)，結(jié)果得出：大腦脈絡(luò)叢、舌潰瘍的退化上皮、腎和膀胱的尿路上皮以及腸表層細(xì)胞具有免疫反應(yīng)性，且在多種組織中均檢測(cè)到SVA 的抗原和RNA，提示SVA存在垂直傳播的可能性。

1.3 流行特征 SVA一年四季均可發(fā)病，但在氣候多變、潮濕的春秋季節(jié)多發(fā)。近年來SVA在巴西、泰國、加拿大、美國和中國等地區(qū)暴發(fā)和流行，造成的危害和損失逐年增加，且局部地區(qū)傳播速度快，對(duì)仔豬的致死率較高。截至2019 年12 月，中國有超過一半的省、自治區(qū)和直轄市受到SVA感染的影響，少數(shù)中國毒株發(fā)生了遺傳重組，在一些地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了無癥狀的SVA感染。

2 臨床癥狀

成年豬感染初期采食量下降，出現(xiàn)厭食、嗜睡和發(fā)熱等癥狀，隨后鼻鏡部、口腔上皮、舌和蹄冠等部位的皮膚、黏膜產(chǎn)生水皰，繼而發(fā)生繼發(fā)性潰瘍和破潰現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)蹄冠部的潰瘍可以蔓延至蹄底部，造成蹄殼松動(dòng)甚至脫落，病豬出現(xiàn)跛行、站立困難以及多數(shù)傳染病常見的體溫升高、厭食和精神萎靡等癥狀。新生仔豬（7日齡以內(nèi)）體態(tài)虛弱，嗜睡，不愿吸乳，并出現(xiàn)急性死亡（死亡率高達(dá)30%～70%），偶爾伴有腹瀉癥狀。

3 SVA的診斷

3.1 病毒分離 SVA 可在人胚胎腎細(xì)胞（PER.C6）、人肺癌細(xì)胞（NCI-H1299）、豬睪丸細(xì)胞（ST）、豬腎細(xì)胞（PK-15、IBRS-2）和幼齡倉鼠腎細(xì)胞（BHK-21）等細(xì)胞系中培養(yǎng)，從患豬血清、水皰液、口腔拭子、尿液、糞便等樣品中分離SVA。其中PK-15最為敏感，可以利用PK-15進(jìn)行病毒擴(kuò)繁［4-5］。分離后再借助電子顯微鏡或?qū)崟r(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等技術(shù)對(duì)病毒進(jìn)行鑒定。病毒分離耗時(shí)長，靈敏度低，一般只應(yīng)用于獲取病毒毒株。

3.2 PCR 方法 范慧等［6］對(duì)40 株SVA 的基因序列進(jìn)行同源比較，篩選出最佳擴(kuò)增引物，優(yōu)化出了引物濃度（4 mmol/L）、退火溫度（54 ℃）、延長時(shí)間（15 s）、循環(huán)次數(shù)（35 次），成功建立了SVA 的RT-PCR 檢測(cè)方法。用該方法檢測(cè)SVA、EMCV（腦心肌炎病毒）、FMDV（口蹄疫病毒）、PRV（偽狂犬病毒）、PRRSV（豬繁殖與呼吸綜合征病毒）、CSFV（豬瘟病毒）、PEDV（豬流行性腹瀉病毒）均無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性，其病毒檢測(cè)限可達(dá)1 TCID50，比國外文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法的靈敏度更高。謝守玉等［7］建立了SVA 與O 型、亞洲Ⅰ型、A型口蹄疫病毒的多重RT-PCR檢測(cè)方法，利用該方法同時(shí)檢測(cè)SVA、O型FMDV、亞洲Ⅰ型FMDV、A 型FMDV、PRRSV、PCV2（豬圓環(huán)病毒2型）、CSFV、PEDV、PRV 等主要豬源病毒，結(jié)果顯示僅對(duì)SVA與O型、亞洲Ⅰ型、A型口蹄疫病毒的檢測(cè)呈陽性，其他均為陰性，特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好。

李秀博等［8］建立的TaqMan 熒光定量PCR 方法，郭振華等［9］建立的熒光定量PCR方法，都具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。林彥星等［10］利用重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）技術(shù)建立了快速檢測(cè)SVA的實(shí)時(shí)熒光RT-RPA 方法，該方法特異性強(qiáng)，能準(zhǔn)確檢測(cè)SVA 核酸，與VSV-IND（水泡性口炎印第安納型）和VSV-NJ（水泡性口炎新澤西型）、SVDV（豬水泡病病毒）、FMDV、CSFV、PRRSV等滅活抗原核酸無交叉反應(yīng)，靈敏度高，重復(fù)性好。結(jié)合熒光探針使用的實(shí)時(shí)RPA檢測(cè)技術(shù)，可在便攜式恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀中實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的直接讀取，簡(jiǎn)便快速，反應(yīng)時(shí)間小于20 min。王淑娟等［11］建立了SVA FQ-PCR檢測(cè)方法，該方法僅對(duì)SVA 出現(xiàn)陽性擴(kuò)增信號(hào)，對(duì)BHK-21 正常細(xì)胞對(duì)照和口蹄疫病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬偽狂犬病毒等5種病原均未出現(xiàn)擴(kuò)增，特異性較強(qiáng)；比常規(guī)RT-PCR的敏感性高10倍；批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于4%，重復(fù)性好。

Zhang 等［12］建立了第三代PCR 技術(shù)RTddPCR，以保守的病毒性聚合酶3d 基因?yàn)榘悬c(diǎn)，建立了一種新的逆轉(zhuǎn)錄微滴數(shù)字RT-ddPCR檢測(cè)方法。該方法具有良好的線性、重復(fù)性和再現(xiàn)性，檢測(cè)限為每次反應(yīng)1.53±0.22 拷貝SVA RNA（n＝8），比定量PCR 的靈敏度高10 倍左右；特異性分析表明，SVA 的RT-ddPCR 與其他主要的豬病原體無交叉反應(yīng)。

3.3 血清學(xué)方法 王彩霞等［13］利用VP2 和VP3可能具有SVA早期感染中和抗體的識(shí)別位點(diǎn)，建立了基于結(jié)構(gòu)蛋白VP2/3 的SVA 間接ELISA 方法，用該方法對(duì)FMDV、PRRSV、PCV2、PRV 等陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果均為陰性，表明該方法具有良好的特異性，與其他豬相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。申水瑩等［14］基于SVA VP3 蛋白建立了間接ELISA 方法，趙月龍等［15］基于VP1 建立了間接ELISA 方法，申珊等［16］建立了一種檢測(cè)SVA VP2蛋白的間接ELISA 方法，這三種ELISA 方法對(duì)幾種普通豬病毒的陽性血清均無交叉反應(yīng)，敏感性好，重復(fù)性和穩(wěn)定性好。

申珊等［5］建立了A型塞內(nèi)卡病毒VP2蛋白抗體的阻斷ELISA 方法，該法對(duì)幾種普通豬病毒的陽性血清均無交叉反應(yīng)；批間、批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%，具有很好的穩(wěn)定性，可用于塞內(nèi)卡病毒血清抗體檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。Liu Fuxiao 等［17］利用表達(dá)綠色熒光蛋白的重組SVA 開發(fā)了一種快速病毒中和試驗(yàn)（VNT）方法，用于檢測(cè)血清樣本。新型VNT將96孔板的孵化時(shí)間縮短到48 h，比傳統(tǒng)VNT 的孵化時(shí)間短得多。此外，它比傳統(tǒng)的VNT更靈敏、更特異，因?yàn)樽x出的最終結(jié)果取決于綠色熒光，而不是CPE。

此外，成都微瑞生物科技有限公司與國家動(dòng)物疫控中心合作研制的塞內(nèi)卡病毒高敏熒光檢測(cè)試劑盒，適用于現(xiàn)場(chǎng)和實(shí)驗(yàn)室，操作簡(jiǎn)單，可及時(shí)獲得檢測(cè)結(jié)果。其檢測(cè)原理是：當(dāng)檢測(cè)卡加入試樣后，試樣中的塞內(nèi)卡病毒抗體與標(biāo)記熒光微球的抗原反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，該復(fù)合物隨樣液流至檢測(cè)線，被包被特異抗原捕獲形成雙抗原夾心免疫結(jié)合物，該結(jié)合物的量與試樣中塞內(nèi)卡病毒抗體的量呈正相關(guān)，經(jīng)高敏熒光分析儀測(cè)定結(jié)合物中示蹤物的熒光強(qiáng)度，即可快速定量測(cè)定試樣中塞內(nèi)卡病毒的抗體含量。

4 預(yù)防與控制

目前，SVA尚無疫苗或特定的治療方法可用，豬場(chǎng)只能通過加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和生物安全來防范。

4.1 做好綜合防控 做好日常飼養(yǎng)管理，堅(jiān)持全進(jìn)全出，提高消毒防范意識(shí)。發(fā)現(xiàn)水皰性病狀后，應(yīng)立即隔離和監(jiān)控病豬，全場(chǎng)消毒、滅鼠、滅蟲等，禁止一切出入活動(dòng)。發(fā)現(xiàn)蹄冠部潰瘍的疫病，應(yīng)立即向養(yǎng)殖場(chǎng)所在地的獸醫(yī)機(jī)構(gòu)報(bào)告。

4.2 加強(qiáng)檢疫 加強(qiáng)生豬及其產(chǎn)品的出入境管理，必要時(shí)暫停進(jìn)口。落實(shí)春秋兩防對(duì)口蹄疫等疫苗的接種工作，加強(qiáng)抗體水平檢測(cè)和早期診斷，開展流行病學(xué)調(diào)查，及時(shí)掌握感染和流行情況，并采取應(yīng)對(duì)措施。

4.3 加快疫苗研發(fā) SVA 疫苗的發(fā)展面臨兩大挑戰(zhàn)。一是篩選高毒力標(biāo)準(zhǔn)菌株，二是建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。目前已生產(chǎn)出多種基因工程疫苗，最有優(yōu)勢(shì)的是病毒樣顆粒（VLPs）。VLPs 是由具有自我組裝能力的病毒結(jié)構(gòu)蛋白組成的空病毒粒子。這些蛋白質(zhì)自發(fā)形成類似病毒的三維結(jié)構(gòu)，暴露了病毒的多個(gè)抗原位點(diǎn)，可以被樹突狀細(xì)胞吸收，從而引發(fā)有效的免疫反應(yīng)。VLPs比活病毒和基因缺失疫苗更安全，因?yàn)樗鼈儾缓z傳物質(zhì)，不具有傳染性或復(fù)制能力。與肽疫苗不同，VLPs與完整病毒發(fā)揮同樣的免疫原性，并誘導(dǎo)完美的免疫保護(hù)［18］。