外泌體在青光眼診療中的作用研究進(jìn)展

酆欣婷 綜述 張旭 審校

南昌大學(xué)附屬眼科醫(yī)院 南昌大學(xué)眼視光學(xué)院，南昌 330006

外泌體是目前發(fā)現(xiàn)最小的一種細(xì)胞外囊泡，廣泛分布于人體血液、唾液、腦脊液、尿液等各種體液中[1]。由于外泌體在人生理狀態(tài)和疾病中的重要作用，以及在疾病診療中潛在的臨床應(yīng)用價值，近年來對其研究越來越多。青光眼是全球首位不可逆性致盲眼病，其特征是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)及其軸突進(jìn)行性喪失，并伴隨視野缺損[2]。原發(fā)性青光眼早期癥狀隱匿，不易被發(fā)現(xiàn)，在我國一半以上的患者被診斷為青光眼時即有嚴(yán)重視野缺損[3]，錯失了最佳治療時機(jī)，這提示早期診斷對于降低視力損害的風(fēng)險至關(guān)重要。研究表明，外泌體是參與青光眼發(fā)病及進(jìn)展的重要介質(zhì)，同時可能作為青光眼早期診斷的潛在標(biāo)志物及治療載體。此類納米級細(xì)胞外囊泡可以穿過生物屏障，直接靶向目標(biāo)受體細(xì)胞，遞送治療分子，可能為青光眼視神經(jīng)退行性病變的治療提供新思路。本文就外泌體在青光眼發(fā)生和診療中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的基本特征

外泌體是一類直徑為40～160 nm(平均100 nm)的細(xì)胞外囊泡[4]，內(nèi)含DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)等多種細(xì)胞成分。人體絕大多數(shù)細(xì)胞都可產(chǎn)生外泌體，其廣泛存在于各種體液中[1]。外泌體起源于細(xì)胞膜內(nèi)陷形成的早期內(nèi)體，而后成熟為晚期內(nèi)體并轉(zhuǎn)化為多泡小體(multivesicular bodies，MVBs)，后者含有腔內(nèi)囊泡(即未來的外泌體)，最終MVBs與細(xì)胞膜融合并通過胞吐作用釋放外泌體[4]。

外泌體的生物發(fā)生途徑包括轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)體分選復(fù)合物(endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT)依賴途徑和非ESCRT依賴途徑，以實(shí)現(xiàn)外泌體內(nèi)容物的特定分選[5]。外泌體在分泌后，可以通過與靶細(xì)胞膜融合，將其內(nèi)容物整合到靶細(xì)胞中；或通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、巨胞飲作用、吞噬作用等多種形式的內(nèi)吞作用將其攜帶的各種信息傳遞給靶細(xì)胞(受體細(xì)胞)；也可以直接與靶細(xì)胞通過受體-配體相互作用傳遞信號，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間通訊[6](圖1)。此外，外泌體的組成、生物發(fā)生可以反映分泌細(xì)胞的狀態(tài)，亦可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境[7]。

圖1 外泌體的產(chǎn)生和攝取過程

1.2 外泌體的生物學(xué)功能

外泌體具有多種生物學(xué)功能，因細(xì)胞來源不同而功能各異，包括：(1)信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是外泌體最基本且重要的生物學(xué)功能。外泌體作為細(xì)胞通訊的載體，可將其內(nèi)容物運(yùn)輸?shù)洁徑蜻h(yuǎn)處細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)各種生理和病理過程[7]。(2)炎癥調(diào)節(jié) 外泌體可促進(jìn)/抑制炎癥小體活化[8]，干細(xì)胞源性外泌體抑制炎癥小體活化，然而免疫細(xì)胞源性外泌體則引發(fā)炎癥小體的激活，提示外泌體可作為炎癥反應(yīng)相關(guān)疾病的治療工具。(3)免疫調(diào)節(jié) 免疫細(xì)胞源性外泌體可促進(jìn)/減弱免疫反應(yīng)，取決于外泌體組成、誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞環(huán)境，使外泌體在免疫應(yīng)答、免疫赦免等方面發(fā)揮重要作用[9]。(4)修復(fù)再生 外泌體參與神經(jīng)血管再生，促進(jìn)軸突生長[10]，有利于神經(jīng)再生及功能恢復(fù)。(5)自噬調(diào)節(jié) 不同來源的外泌體可促進(jìn)/抑制自噬[11]。Rong等[12]研究表明，在脊髓損傷的大鼠模型中，神經(jīng)干細(xì)胞衍生的外泌體通過促進(jìn)自噬減少神經(jīng)元凋亡，抑制神經(jīng)炎癥。此外，外泌體還可作為疾病的生物標(biāo)志物及治療載體。

1.3 外泌體與眼部組織的免疫調(diào)節(jié)

外泌體可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，而眼部被視為類似胎盤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫赦免組織結(jié)構(gòu)，血-視網(wǎng)膜屏障釋放的外泌體可能在調(diào)節(jié)眼的免疫赦免中發(fā)揮重要作用[13]。廖志雄等[14]研究表明，兔房水中外泌體能夠明顯抑制T淋巴細(xì)胞增生、免疫抑制分子腫瘤壞死因子β(tumor necrosis factor-β，TNF-β)表達(dá)，故推測外泌體很可能參與了眼球免疫耐受的維持。另一項(xiàng)研究中，Knickelbein等[15]證實(shí)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞衍生的外泌體可根據(jù)炎癥環(huán)境調(diào)節(jié)單核細(xì)胞表型，在炎癥因子的刺激下可抑制單核細(xì)胞的免疫活性，從而減少潛在的免疫反應(yīng)損害。免疫炎癥與青光眼發(fā)病有關(guān)，外泌體的免疫作用廣泛，但在眼部組織中多表現(xiàn)為負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用，有利于減少免疫炎癥攻擊對眼部組織造成的損害。但闡明外泌體如何在生理和病理狀態(tài)下調(diào)節(jié)眼的免疫功能仍需進(jìn)一步研究。

2 外泌體與青光眼的發(fā)病機(jī)制

2.1 外泌體與小梁網(wǎng)細(xì)胞調(diào)節(jié)

目前，青光眼確切的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，但病理性眼壓升高是其發(fā)病的主要危險因素[16]。外泌體可通過運(yùn)輸青光眼相關(guān)蛋白、調(diào)節(jié)Wnt信號通路、影響細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)周轉(zhuǎn)等參與調(diào)節(jié)小梁網(wǎng)細(xì)胞功能及房水動力學(xué)，進(jìn)而影響眼壓[17]。(1)運(yùn)輸青光眼相關(guān)蛋白 Myocilin是一種青光眼相關(guān)分泌蛋白，其突變導(dǎo)致眼壓升高[18]。Stamer等[19]在小梁網(wǎng)細(xì)胞衍生的外泌體中檢測到myocilin，且與外泌體結(jié)合排出細(xì)胞。Myocilin通過外泌體釋放途徑調(diào)節(jié)眼壓，參與青光眼發(fā)病機(jī)制，提示外泌體在眼壓控制中的作用。(2)調(diào)節(jié)Wnt信號通路 Tabak等[20]研究發(fā)現(xiàn)，無色素睫狀上皮細(xì)胞(non-pigment ciliary epithelial cells，NPCE)衍生的外泌體在小梁網(wǎng)細(xì)胞中干擾Wnt信號傳導(dǎo)，通過使GSK3β磷酸化減弱和β-catenin的表達(dá)水平降低來影響小梁網(wǎng)鈣黏蛋白，導(dǎo)致房水流出阻力增加和眼壓升高，且只有在低濃度外泌體的刺激下才能產(chǎn)生這種效應(yīng)。此外，Lerner等[17]證明NPCE外泌體中富含Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)劑微小RNA-29b(microRNA-29b，miR-29b)。(3)影響ECM周轉(zhuǎn) 研究表明，小梁網(wǎng)通過侵襲性偽足結(jié)構(gòu)周轉(zhuǎn)ECM并維持房水流動的通道，而外泌體定位于侵襲性偽足結(jié)構(gòu)中[21]，提示外泌體在介導(dǎo)細(xì)胞-ECM相互作用中發(fā)揮重要作用。以上研究表明外泌體可從不同途徑影響小梁網(wǎng)細(xì)胞功能，從而參與青光眼的發(fā)生和發(fā)展，進(jìn)一步探討外泌體信號通路有助于發(fā)現(xiàn)針對房水引流系統(tǒng)的青光眼治療新靶點(diǎn)。

2.2 外泌體與視網(wǎng)膜神經(jīng)炎癥

炎癥已被證明在青光眼的發(fā)病中起重要作用[22]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為視網(wǎng)膜的免疫活性細(xì)胞，在青光眼發(fā)病中的作用也進(jìn)行了一些研究。Aires等[23]證明反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的慢性神經(jīng)炎癥在青光眼病理學(xué)中起作用，暴露于高靜水壓的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。將上述過程中產(chǎn)生的外泌體注射到C57BL/6J小鼠的玻璃體腔中，觀察到視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)激活，介導(dǎo)細(xì)胞死亡，從而減少RGCs數(shù)量，但來自對照組小膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體卻無法誘發(fā)視網(wǎng)膜炎癥和細(xì)胞死亡。提示小膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體在眼壓升高的情況下可傳遞炎癥信號，導(dǎo)致青光眼疾病條件下的視網(wǎng)膜變性。這提示通過外泌體阻礙小膠質(zhì)細(xì)胞通訊可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，阻止疾病進(jìn)展的可能性。未來可通過外泌體將抗炎藥物輸送到小膠質(zhì)細(xì)胞中，抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

青光眼與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)退行性疾病的一個共同特征是慢性神經(jīng)炎癥[22]。與在青光眼模型中的發(fā)現(xiàn)類似，大腦受到有害刺激后，小膠質(zhì)細(xì)胞會釋放與其他小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用的外泌體，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥環(huán)境的擴(kuò)大[24]。病理性tau蛋白的沉積是阿爾茨海默病的主要標(biāo)志，該現(xiàn)象也在青光眼患者的視網(wǎng)膜中被發(fā)現(xiàn)[25]。研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞可通過釋放外泌體傳播病理性tau蛋白，而抑制外泌體生成可顯著降低病理性tau蛋白的傳播，從而減少在健康細(xì)胞中的沉積[26]。以上研究提示，由小膠質(zhì)細(xì)胞衍生的外泌體可能通過介導(dǎo)慢性神經(jīng)炎癥參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。

3 外泌體與青光眼的診斷

3.1 淚液中的外泌體

外泌體在淚液、房水、玻璃體、血液中含量豐富[1]。近年來，隨著研究的不斷深入，有研究者認(rèn)為外泌體可作為預(yù)測疾病理想的低侵襲性生物學(xué)診斷標(biāo)志物[27]。淚液是反映眼部健康或疾病相關(guān)的重要體液，其成分變化受青光眼影響，視網(wǎng)膜損傷后3 d即檢測到小鼠淚腺基因表達(dá)的改變[28]，提示淚液可在早期反映青光眼的病理變化。而淚液中外泌體含量豐富并穩(wěn)定存在[7]，淚液外泌體研究可顯著提高淚液生物標(biāo)志物檢測的敏感性[29]。鑒于其簡單且無創(chuàng)的采樣過程，未來可找出淚液外泌體中差異性表達(dá)的物質(zhì)，作為青光眼早期診斷的候選生物標(biāo)志物，從而早期診斷青光眼，有利于改善患者預(yù)后并減輕醫(yī)療負(fù)擔(dān)。

3.2 房水中的外泌體

眼內(nèi)房水處于動態(tài)循環(huán)中，其成分與眼球局部生理病理環(huán)境密切相關(guān)，房水中外泌體主要來自于眼內(nèi)組織[30]，這提高了利用房水診斷眼病的可行性。房水由睫狀體產(chǎn)生，主要經(jīng)過小梁網(wǎng)流出，外泌體在兩者之間的通訊中發(fā)揮作用[31]。Dismuke等[31]首次證明外泌體是房水的重要成分之一，房水中含有特征性外泌體RNA，這為開發(fā)用于疾病診斷的外泌體提供了重要信息。Sacc等[32]對青光眼和非青光眼患者的房水進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)青光眼患者房水中有13種蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著升高，其中熱休克蛋白90可介導(dǎo)外泌體的釋放[33]。以上研究提示，房水中的外泌體及其RNA載荷或蛋白質(zhì)可用作青光眼的診斷生物標(biāo)志物。在此基礎(chǔ)上，Hsu等[30]提供了一種基于微流控芯片的新型診斷技術(shù)，可以簡化從房水中分離外泌體的程序，節(jié)省大量時間，這項(xiàng)技術(shù)的普及應(yīng)用將有助于進(jìn)行更多的房水分析研究，進(jìn)而完善眼科檢查。

3.3 玻璃體中的外泌體

一項(xiàng)對從人類獲得的視網(wǎng)膜和玻璃體液樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的研究發(fā)現(xiàn)，與年齡相當(dāng)?shù)姆乔喙庋蹖φ战M相比，青光眼樣本檢測到差異調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，經(jīng)典的補(bǔ)體途徑相關(guān)蛋白被激活；另有蛋白通路分析表明，線粒體氧化磷酸化機(jī)制存在缺陷，這些蛋白質(zhì)改變與炎癥反應(yīng)和線粒體功能障礙相關(guān)[34]。Zhao等[35]在人類玻璃體中檢測到含有視網(wǎng)膜蛋白的外泌體，且發(fā)現(xiàn)玻璃體中外泌體含量豐富。這些研究支持了玻璃體作為青光眼診斷生物標(biāo)志物的組織來源的可行性。未來，可能從玻璃體中分離出青光眼特異性外泌體，從而有助于疾病的診斷，也為玻璃體腔注射外泌體達(dá)到青光眼臨床治療效果提供了可能。

3.4 血液中的外泌體

血液是一種可到達(dá)全身的體液，相比于其他液體成分更為復(fù)雜。池在龍等[36]對231例原發(fā)性青光眼患者和120例對照者的血漿外泌體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)6種miRNA在原發(fā)性青光眼患者血液分離出的外泌體中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與青光眼的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。與上述miRNA發(fā)現(xiàn)相似的是，池在龍等[37]還在青光眼患者的血漿外泌體中發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA TRAM2的差異表達(dá)。他們認(rèn)為以上標(biāo)志物對青光眼均有一定的診斷價值，且特異性和靈敏度高，適用于大規(guī)模的篩查。但由于血液受到全身各組織結(jié)構(gòu)的影響，而眼是一個很小的器官，若能從血漿中分離純化特定細(xì)胞來源(眼源性)的外泌體，將提高血漿外泌體用于診斷青光眼的說服力。

4 外泌體與青光眼的治療

4.1 外泌體的神經(jīng)保護(hù)作用

多項(xiàng)研究已證明天然干細(xì)胞源性外泌體對青光眼的治療作用，可作為一種有效的神經(jīng)保護(hù)療法。Mead等[38]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體注射到視神經(jīng)擠壓模型大鼠的玻璃體中，發(fā)現(xiàn)外泌體在整個視網(wǎng)膜中迅速擴(kuò)散，促進(jìn)RGCs的存活及軸突再生，并有助于保留RGCs功能。他們還證明，外泌體產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用是通過miRNA依賴機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的。外泌體將miRNA輸送到RGCs中表達(dá)，導(dǎo)致新的蛋白質(zhì)翻譯，在敲除miRNA關(guān)鍵的效應(yīng)分子Argonaute-2后，外泌體的治療效果減弱。Liu等[39]研究表明，在阿爾茨海默病小鼠模型中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化及其相關(guān)的神經(jīng)炎癥、上調(diào)突觸相關(guān)蛋白和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子蛋白表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。除了顯著的神經(jīng)保護(hù)作用外，干細(xì)胞源性外泌體還可選擇性下調(diào)炎性T細(xì)胞的信號通路，而不影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)增和免疫抑制特性；且干細(xì)胞源性外泌體的神經(jīng)保護(hù)作用可被TNF-α強(qiáng)化[40-41]。以上研究表明，干細(xì)胞源性外泌體不僅在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，而且在抑制炎癥損害中起作用。

此外，Mathew等[42]研究表明，玻璃體腔注射干細(xì)胞源性外泌體后可迅速到達(dá)RGCs，為其提供神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，且外泌體在玻璃體內(nèi)保留4周，以劑量依賴性和可飽和的方式與玻璃體結(jié)合。但Mead等[43]研究顯示，外泌體只能防止RGCs功能的早期損害，而在青光眼病程的后期則不能防止RGCs功能損害[43]。以上外泌體神經(jīng)保護(hù)作用的研究為臨床給藥提供了一定的依據(jù)。有趣的是，Mead等[44]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)保護(hù)作用僅在接受骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體注射的動物中被觀察到，而成纖維細(xì)胞衍生的外泌體無治療效應(yīng)，表明干細(xì)胞源性外泌體在RGCs存活和青光眼治療中有特定的潛力。另外，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、人類胚胎干細(xì)胞衍生的外泌體也展現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用[45-46]。以上研究表明，外泌體在視神經(jīng)保護(hù)和再生治療中具有一定的潛力，且為外泌體的臨床應(yīng)用提供了許多有用的信息。

4.2 外泌體的遞送作用

外泌體可跨越生物屏障，天然外泌體及工程化外泌體都可作為藥物遞送囊泡[7]，且與游離藥物相比，載藥外泌體具有更好的療效和更高的生物利用度[47]，為眼部疾病藥物治療提供了新的思路。Mead等[38]研究發(fā)現(xiàn)，天然干細(xì)胞源性外泌體在大鼠玻璃體腔注射后1 h即可成功地將神經(jīng)營養(yǎng)因子輸送到受傷的RGCs，展現(xiàn)出外泌體作為治療分子運(yùn)載體的能力。而工程化外泌體作為極具應(yīng)用前景的新一代藥物遞送囊泡，可以進(jìn)一步提高外泌體的治療效率、特異性及安全性[48]。工程化外泌體的修飾策略主要包括內(nèi)容修飾和外膜修飾[49]。通過工程化外泌體，將外源性治療藥物，如小分子或核酸藥物整合到外泌體中，然后遞送到特定類型的細(xì)胞或組織中，可實(shí)現(xiàn)靶向藥物遞送，從而促進(jìn)靶細(xì)胞的功能。綜上，以上研究提示外泌體可成為治療青光眼更有效的新工具，開辟無細(xì)胞療法治療青光眼的新時代。

5 外泌體在眼科的應(yīng)用難點(diǎn)與優(yōu)勢

目前，外泌體在眼科領(lǐng)域中的臨床研究仍較少，主要集中在基礎(chǔ)研究方面。結(jié)合現(xiàn)有的研究結(jié)果，外泌體應(yīng)用到臨床還需克服以下問題：(1)動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外泌體每周或每月注射才有治療作用，其治療作用是暫時的且依賴于重復(fù)注射[44]。(2)目前缺乏穩(wěn)定的分離純化方法[50]。(3)外泌體具有顯著的異質(zhì)性[4]，質(zhì)量控制是亟需解決的難題。外泌體用于青光眼治療的優(yōu)勢：(1)外泌體對視網(wǎng)膜無毒性作用[51]。(2)外泌體是天然的細(xì)胞外囊泡，生物膜穩(wěn)定性高，免疫原性低[6]，可降低藥物的清除率。(3)外泌體易于穿過生物屏障，給藥方式靈活。將外泌體應(yīng)用到眼科臨床還需更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但外泌體表面蛋白使之具有靶向性，未來或可通過修飾外泌體使其靶向定位于視網(wǎng)膜神經(jīng)元，實(shí)現(xiàn)高濃度沖擊治療，挽救視功能。

6 總結(jié)與展望

外泌體的多種生物學(xué)功能使其在復(fù)雜的青光眼病理變化中發(fā)揮重要作用，可將外泌體作為潛在的風(fēng)險預(yù)測因子以補(bǔ)充現(xiàn)有的青光眼診斷策略及協(xié)助判斷青光眼患者預(yù)后。此外，通過靶向修飾打造的工程化外泌體有望成為一種高效且安全的遞送載體，有助于提高其診斷潛力和治療效率。隨著研究的深入，外泌體在青光眼中的應(yīng)用及靶向治療也將不斷趨于成熟。今后外泌體在青光眼領(lǐng)域的研究也可圍繞以下幾個方面開展：將其作為青光眼早期診斷的標(biāo)志物，助力青光眼的早期診斷、靶向治療及改善預(yù)后；將外泌體作為轉(zhuǎn)染載體，從而精密地調(diào)控目標(biāo)蛋白的表達(dá)；對外泌體進(jìn)行人工修飾，以錨定特定類型的靶細(xì)胞，精確地調(diào)節(jié)其功能。在精準(zhǔn)醫(yī)療的時代，外泌體具有良好的眼科應(yīng)用前景，有望成為青光眼診治的新選擇。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

志謝感謝南昌大學(xué)眼視光學(xué)院彭振對本文的指導(dǎo)