數(shù)種神經(jīng)科學(xué)常用基因修飾小鼠生育狀況的影響因素分析

黃琦逸，齊宇欣，毛宏暉，武勝昔，王文挺，姜 鳴(延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物學(xué)系，陜西 延安 76000；空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，陜西 西安 7003)

在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中，研究腦萎縮、帕金森綜合征、阿爾茨海默癥、孤獨(dú)癥、脊髓損傷修復(fù)等疾病的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制時(shí)，小鼠是常用的實(shí)驗(yàn)對象[1-2]。小鼠作為多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，其優(yōu)點(diǎn)在于遺傳高度保守、個(gè)體間重復(fù)性和一致性較好、體形小、飼養(yǎng)維護(hù)成本低、生殖周期短，在科學(xué)研究中發(fā)揮了非常重要的作用[3-5]。目前，利用小鼠基因和人類基因高度相似的特點(diǎn)，研究者采用如敲除、敲入和轉(zhuǎn)基因等手段制作了不同種類的基因修飾小鼠。通過對這些小鼠的基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序及代謝組學(xué)測序等可深度探索疾病的病因和遺傳發(fā)育機(jī)制，極大地促進(jìn)了科學(xué)研究[6-7]。而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會要求在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中需要遵從3R原則：替代(replacement)、減少(reduction)和優(yōu)化(refinement)，旨在減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用量，減輕動(dòng)物痛苦[8-9]。因此，在使用實(shí)驗(yàn)小鼠時(shí)應(yīng)盡可能地縮減實(shí)驗(yàn)周期，優(yōu)化小鼠繁育，短時(shí)間內(nèi)獲取足夠數(shù)量的小鼠，從而減少不必要的飼養(yǎng)和安樂死。在評估小鼠生殖繁育狀況時(shí)，目前最常用的是觀察小鼠終生生育力并從生產(chǎn)性交配的總體比例、配種-生產(chǎn)間期、產(chǎn)仔數(shù)、小鼠整個(gè)生殖周期內(nèi)的產(chǎn)仔數(shù)等來衡量其繁殖能力[1,4-5]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，小鼠的繁育狀況受多種因素的綜合影響，如MICHAELIS等[10]報(bào)道通過增加雄性配種小鼠的睪丸內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞可提高生育率；KEMP等[11]報(bào)道基因型對雌性動(dòng)物的產(chǎn)仔數(shù)量會產(chǎn)生重要作用；WALTERS等[12]報(bào)道雄激素受體敲除會影響小鼠的繁殖情況。然而關(guān)于基因修飾小鼠配種影響因素的探討卻很少。因此，本研究追溯了本實(shí)驗(yàn)室2 642籠基因修飾小鼠的配種信息及生育狀況，通過回顧性研究探討季節(jié)、配種雌雄小鼠的基因型及年齡對新生小鼠數(shù)量和配種-生產(chǎn)間期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

追溯繁育于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的2 642籠多種基因型(包括shank3bKO、SSTcre、PVcre、VIPcre、MeCP2Tg1等)、不同年齡段(42～365 d)、體質(zhì)量為(24±6)g健康配種小鼠的原始配種信息并記錄。在整個(gè)配種期間，小鼠飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級或IVC級動(dòng)物房內(nèi)，體質(zhì)量均控制在正常范圍內(nèi)，恒溫(24±1)℃，12 h光/12 h暗循環(huán)，每籠3只，自由獲取食物和水。所有實(shí)驗(yàn)均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)原則及倫理規(guī)范，并符合空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會要求(許可證號：IACUC-20120721)。

本實(shí)驗(yàn)中所追溯的2 642籠小鼠均飼養(yǎng)于嚙齒類動(dòng)物獨(dú)立通氣飼養(yǎng)籠盒系統(tǒng)(LN63FESU，TECNIPLAST S.P.A，意大利)，該系統(tǒng)包含籠盒系統(tǒng)、籠架系統(tǒng)和主機(jī)系統(tǒng)。飼養(yǎng)籠盒皆放置于籠架上。主機(jī)系統(tǒng)控制動(dòng)物房內(nèi)的通風(fēng)循環(huán)且籠架上的進(jìn)排風(fēng)口的氣流設(shè)定在同一水準(zhǔn)，偏差小于0.5%，可為動(dòng)物提供高標(biāo)準(zhǔn)的低NH3、CO2微環(huán)境，提供非常適宜的濕度，有效防止含有有害物質(zhì)或被污染的氣體在動(dòng)物飼養(yǎng)籠間的傳播、擴(kuò)散。該飼養(yǎng)系統(tǒng)可有效防止交叉感染，保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并可解放人工、節(jié)省資源，保障實(shí)驗(yàn)人員的健康與安全。

1.2 方法

1.2.1 配種流程 小鼠飼養(yǎng)至成年后，按照一雄配兩雌的方法進(jìn)行配種，觀察并記錄配種籠小鼠自配種后新生小鼠出生所需的時(shí)間(配種-生產(chǎn)間期)及數(shù)量，對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸分析及單因素分析，得出可能影響新生小鼠數(shù)量及配種-生產(chǎn)間期的相關(guān)因素。

1.2.2 基因型因素 為探討配種雌雄小鼠的基因型是否會對新生小鼠的數(shù)量及配種-生產(chǎn)間期產(chǎn)生影響，故將本實(shí)驗(yàn)所追溯的2 642籠各基因型小鼠分為以下6組：單致病基因修飾、雙基因含致病基因修飾、單功能基因修飾、雙功能基因修飾、多基因修飾及野生型。

1.2.3 年齡因素 本實(shí)驗(yàn)所追溯的2 642籠配種雌、雄小鼠的年齡涵蓋42～365 d，跨度較大，為探討年齡因素是否會影響新生小鼠的數(shù)量及配種-生產(chǎn)間期，故將本實(shí)驗(yàn)中所篩選的配種雌、雄小鼠按配種時(shí)的年齡分為青年期(42～120 d)、中年期(121～300 d)、老年期(>300 d)。

1.2.4 季節(jié)因素 由于小鼠配種及繁殖的周期較長，時(shí)間跨度大，季節(jié)變化可能會通過影響動(dòng)物周期性節(jié)律，從而影響新生小鼠數(shù)量及配種-生產(chǎn)間期，因此為探討季節(jié)因素是否會對其產(chǎn)生影響，故將所追溯的配種小鼠分為4組：春季、夏季、秋季和冬季。

表1 自變量賦值情況

2 結(jié)果

2.1 多因素對配種基因修飾小鼠生育狀況的影響

由于季節(jié)因素、配種雌雄小鼠的基因型及年齡并非獨(dú)立地影響新生小鼠的數(shù)量和配種-生產(chǎn)間期，可能是由多種因素綜合作用的結(jié)果，因此我們通過多元線性回歸分析探究何種因素會對配種小鼠的生育狀況產(chǎn)生影響。

多元線性回歸結(jié)果顯示，在學(xué)生化剔除殘差-標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)測值散點(diǎn)圖中縱軸零點(diǎn)對應(yīng)的直線上下基本分布均勻(圖1A)，說明殘差具備方差齊性；在殘差分布直方圖中殘差分布與正態(tài)分布曲線擬合較好(圖1B)，觀測累計(jì)概率P-P圖中散點(diǎn)密切地分布在斜線附近(圖1C)，說明殘差服從正態(tài)分布。殘差同時(shí)滿足方差齊性和正態(tài)性，說明所建立的回歸模型較好。通過強(qiáng)行進(jìn)入法篩選模型的自變量結(jié)果顯示配種雌性小鼠年齡回歸系數(shù)(P<0.001)、配種雄性小鼠年齡回歸系數(shù)(P=0.007)、配種雌性小鼠基因型回歸系數(shù)(P=0.018)及配種雄性小鼠基因型回歸系數(shù)(P=0.002)均拒絕原假設(shè)，說明以上這些自變量和因變量之間的線性關(guān)系是顯著的；季節(jié)回歸系數(shù)(P=0.803)未出現(xiàn)顯著性，因此未納入回歸模型中(表2)。上述結(jié)果表明，配種雌雄小鼠的基因型和年齡對新生小鼠的數(shù)量有顯著性影響，而季節(jié)對新生小鼠的數(shù)量無顯著性影響。

表2 新生小鼠數(shù)量回歸模型系數(shù)表

A：學(xué)生化剔除殘差-標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)測值散點(diǎn)圖，自變量為新生數(shù)量；B：殘差分布直方圖，自變量為新生數(shù)量；C：觀測量累計(jì)概率P-P圖，自變量為新生數(shù)量；D：學(xué)生化剔除殘差-標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)測值散點(diǎn)圖，自變量為配種-生產(chǎn)間期；E：殘差分布直方圖，自變量為配種-生產(chǎn)間期；F：觀測量累計(jì)概率P-P圖，自變量為配種-生產(chǎn)間期。圖1 多元線性回歸的模型評估

另一方面，新生小鼠的配種-生產(chǎn)間期的多元線性回歸結(jié)果[學(xué)生化剔除殘差-標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)測值散點(diǎn)圖(圖1D)、殘差分布直方圖(圖1E)及觀測累計(jì)概率P-P圖(圖1F)]也顯示出良好的正態(tài)分布性和方差齊性，說明所建立的回歸模型較好；通過強(qiáng)行進(jìn)入法篩選模型自變量，結(jié)果顯示季節(jié)回歸系數(shù)(P=0.006)、配種雌性小鼠年齡回歸系數(shù)(P<0.001)和配種雄性小鼠年齡回歸系數(shù)(P<0.001)均拒絕原假設(shè)，說明以上這些自變量和因變量之間線性關(guān)系是顯著的；配種雌性小鼠基因型回歸系數(shù)(P=1.000)和配種雄性小鼠基因型回歸系數(shù)(P=0.293)均未出現(xiàn)顯著性，因此未納入回歸模型中(表3)。上述結(jié)果表明，季節(jié)和配種雌雄小鼠年齡對新生小鼠的配種-生產(chǎn)間期有顯著性影響，而配種雌雄小鼠的基因型對新生小鼠的配種-生產(chǎn)間期無顯著性影響。

表3 新生小鼠配種-生產(chǎn)間期回歸模型系數(shù)表

2.2 各因素不同水平對配種基因修飾小鼠生育狀況的影響

多元線性回歸分析篩選出對小鼠生育狀況有顯著性影響的危險(xiǎn)因素后，通過對各自變量進(jìn)行單因素方差分析來比較各變量內(nèi)不同水平間小鼠生育狀況的差異。研究結(jié)果顯示，配種雌鼠的年齡(F=33.660，P<0.001，圖2A)、配種雌鼠的基因型(F=10.720，P<0.001，圖2B)、配種雄鼠的年齡(F=23.430，P<0.001，圖2C)、配種雄鼠的基因型(F=3.519，P=0.004，圖2D)均存在顯著性差異。事后多重比較結(jié)果顯示當(dāng)配種雌鼠年齡為青年期[新生小鼠為(7.677±3.883)只]及基因型為野生型[新生小鼠為(8.290±4.031)只]、且配種雄鼠的年齡為青年期[新生小鼠為(7.912±3.919)只]及基因型為多基因[新生小鼠為(9.333±4.387)只]時(shí)，新生小鼠的數(shù)量可最大化。

A：比較配種雌性小鼠年齡對產(chǎn)仔數(shù)的影響；B：比較配種雌性小鼠基因型對產(chǎn)仔數(shù)的影響；C：比較配種雄性小鼠年齡對產(chǎn)仔數(shù)的影響；D：比較配種雄性小鼠基因型對產(chǎn)仔數(shù)的影響。SPGM：單致病基因修飾；DGCPGM：雙基因含致病基因修飾；SFGM：單功能基因修飾；DFGM：雙功能基因修飾；PGM：多基因修飾；WT：野生型。小提琴圖中的上下虛線表示四分位間距，中間線表示中值。 aP<0.05， bP<0.01。圖2 各種因素對產(chǎn)仔數(shù)的影響

另一方面，本研究對影響新生小鼠配種-生產(chǎn)間期的各因素分別進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示季節(jié)(F=4.118，P=0.006，圖3A)，配種雌鼠的年齡(F=1 258.000，P<0.001，圖3B),配種雄鼠的年齡(F=1 161.000，P<0.001，圖3C)均存在顯著性差異。事后多重比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)在春季[配種-生產(chǎn)間期為(103.843±74.536)d]、配種雌鼠年齡為青年期[配種-生產(chǎn)間期為(40.552±20.406)d]且配種雄鼠的年齡為青年期[配種-生產(chǎn)間期為(39.674±21.349)d]時(shí)，新生小鼠的配種-生產(chǎn)間期可最短。上述結(jié)果表明，在春季選擇較為年輕的配種雌雄小鼠可優(yōu)化小鼠的生育狀況。

A：季節(jié)因素對于配種-生產(chǎn)間期的影響；B：配種雌性小鼠年齡對于配種-生產(chǎn)間期的影響；C：配種雄性小鼠年齡對于配種-生產(chǎn)間期的影響。小提琴圖中的上下虛線表示四分位間距，中間線表示中值。 bP<0.01。圖3 各種因素對配種-生產(chǎn)間期的影響

3 討論

在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等諸多領(lǐng)域尤其是神經(jīng)科學(xué)研究中，小鼠模型至關(guān)重要[13-14]。由于其生殖周期短、遺傳高度保守等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于各領(lǐng)域的科學(xué)研究中，實(shí)驗(yàn)小鼠尤其是基因修飾小鼠的使用數(shù)量也與日俱增，因此小鼠生育狀況與科研工作的推進(jìn)密切相關(guān)[15-17]。目前小鼠生育狀況相關(guān)的研究多集中于改良新生小鼠的生殖表型[18]、某種理化因子如細(xì)胞因子或蛋白分子對小鼠繁殖情況的影響[19-20]和小鼠體外受精人工繁育[21]等，但關(guān)于季節(jié)、配種小鼠年齡和基因型對新生小鼠數(shù)量及配種-生產(chǎn)間期是否產(chǎn)生影響的探討卻很少。

本研究通過追溯10年內(nèi)2 642籠健康基因修飾雌雄小鼠的配種及生育數(shù)據(jù)，探究季節(jié)、配種雌雄小鼠的年齡及基因型對新生小鼠數(shù)量及配種-生產(chǎn)間期的影響。與人相比，動(dòng)物對于季節(jié)變化的感知更為敏感，尤其在進(jìn)行配種時(shí)受季節(jié)因素影響較大；此外，動(dòng)物在進(jìn)行配種時(shí)的年齡也是影響配種的關(guān)鍵因素之一。多元線性回歸分析結(jié)果顯示配種雌雄小鼠的年齡和基因型均會顯著地影響新生小鼠的數(shù)量，季節(jié)和配種雌雄小鼠的年齡會顯著地影響配種-生產(chǎn)間期。配種時(shí)雌雄小鼠的年齡處于青年期時(shí)生育率相對較高且配種-生產(chǎn)間期相對更短。另一方面，致病基因與功能基因在小鼠進(jìn)行配種時(shí)顯著影響新生小鼠的數(shù)量，雙致病基因修飾[新生小鼠為(6.906±3.579)只]和單致病基因修飾小鼠[新生小鼠為(7.594±3.648)只]在進(jìn)行配種后比雙功能基因修飾[新生小鼠為(6.216±3.137)只]和單功能基因修飾小鼠[新生小鼠為(6.762±3.428)只]的新生數(shù)量更多。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的單因素方差分析結(jié)果顯示配種雌雄小鼠年齡均為青年期且配種雌鼠為野生型及配種雄鼠為多基因型時(shí)，新生小鼠的數(shù)量可最大化；另一方面，選擇春季和青年期的配種雌雄小鼠可有效地縮短配種-生產(chǎn)間期。綜上所述，在春季選擇較為年輕的雌雄小鼠配種可快速地獲取最大數(shù)量的新生小鼠；在其他季節(jié)里，建議選擇青年期小鼠進(jìn)行配種雌雄小鼠，并按照一雄配兩雌的方法適當(dāng)多增加幾籠配種；若繁育的小鼠為基因修飾小鼠，則盡量將多基因修飾雄性小鼠和野生型或多基因修飾雌性小鼠進(jìn)行配種，可有效地提高新生基因修飾小鼠的數(shù)量。但這些因素影響新生小鼠的數(shù)量及配種-生產(chǎn)間期的機(jī)制仍不清楚，尚需更進(jìn)一步的研究。