獨(dú)活-牛膝藥對治療膝骨關(guān)節(jié)炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制及實驗驗證

張永奎 ， 李念虎 ， 井成 ， 王象鵬 ， 宋緒鈺 ， 畢榮修 ， 謝文鵬

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，山東濟(jì)南 250000；2.山東福牌制藥有限公司，山東濟(jì)南 250000；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250000；4.山東大學(xué)第二醫(yī)院，山東濟(jì)南 250000）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是以關(guān)節(jié)軟骨破壞和軟骨下骨硬化為最根本病理改變的退變性疾病[1]。最新流行病學(xué)研究資料顯示，KOA的發(fā)病率隨著老齡化的加重呈現(xiàn)出升高的趨勢[2-3]。因此，尋求安全有效的治療方案對于克服此病的危害有著重要的社會意義。

伴隨著臨床治療方案的增多，2018 年版《骨關(guān)節(jié)炎診療指南》[4]首次將中成藥寫進(jìn)了KOA 的治療方案之中，但遺憾的是尚未詳細(xì)介紹其適應(yīng)證和用法。隨后2020 年遵循“循證為主、共識為輔、經(jīng)驗為鑒”的研究原則，制定了《中成藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎臨床應(yīng)用指南（2020 年）》[5]，明確了中成藥的種類、用法及適應(yīng)證，為中成藥在膝骨關(guān)節(jié)炎中的規(guī)范使用奠定了基礎(chǔ)。通過總結(jié)諸多醫(yī)家對KOA 治療的用藥特點(diǎn)及規(guī)律，在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，本課題組創(chuàng)制了院內(nèi)制劑蒼膝通痹膠囊（魯藥制字Z20130043），并進(jìn)行了相關(guān)的療效研究，發(fā)現(xiàn)其治療KOA療效明確、安全性高[6]，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)蒼膝通痹膠囊可以通過靶向阻斷p38MAPK 信號通路來保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨[7]；但是不能明確其具體的作用成分，使其臨床推廣面臨困難。由此，本研究選取其君藥獨(dú)活-牛膝藥對作為研究對象進(jìn)行機(jī)制探討，預(yù)實驗結(jié)果證實獨(dú)活-牛膝藥對可以有效抑制軟骨細(xì)胞凋亡，減輕KOA炎性反應(yīng)，但其機(jī)制尚未明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有數(shù)據(jù)挖掘、靶點(diǎn)預(yù)測和功能分析等多種功能，推動了中藥復(fù)方藥效分子機(jī)制的研究進(jìn)展[8]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選和預(yù)測獨(dú)活-牛膝藥對治療KOA的潛在作用靶點(diǎn)和信號通路，并通過體外實驗進(jìn)行驗證，以期為獨(dú)活-牛膝藥對的臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1 獨(dú)活-牛膝藥對有效成分及作用靶點(diǎn)篩選 應(yīng)用TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）、《中國藥典》 2020 年版（http://db.ouryao.com）、BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm）等數(shù)據(jù)庫得到獨(dú)活、牛膝所有可能的有效成分，根據(jù)口服利用度（OB）大于30%和類藥性（DL）大于0.18篩選得出符合條件的有效成分，不符合上述標(biāo)準(zhǔn)但是《中國藥典》含量測定標(biāo)準(zhǔn)提及到的成分也納入該研究，篩選去重后應(yīng)用TCMSP 數(shù)據(jù)庫確定有效成分作用靶點(diǎn)，并去重。

1.1.2 KOA 靶點(diǎn)的獲取及與獨(dú)活-牛膝藥對靶點(diǎn)的交集分析 運(yùn)用GeneCards（https://www.genecards.org）和OMIM數(shù)據(jù)庫以“knee osteoarthritis”為關(guān)鍵詞獲取KOA 靶點(diǎn)，并去重。應(yīng)用OmicShare（https://www.omicshare.com）將活性成分靶點(diǎn)與KOA 靶點(diǎn)進(jìn)行交集，得到交集靶點(diǎn)和韋恩（Venn）圖。

1.1.3 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）對上述交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析。物種參數(shù)設(shè)置為“Homo sapiens”，“minimum required interaction score”設(shè)置為0.9，并隱藏游離點(diǎn)得到蛋白質(zhì)相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。將該網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0，進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，?gòu)建疾病-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并利用R（x64 4.0.2）軟件篩選連接節(jié)點(diǎn)數(shù)排前30 位的靶點(diǎn)作為獨(dú)活-牛膝藥對治療KOA的核心靶點(diǎn)。

1.1.4 基因本體論（GO）分析富集分析 使用R（x64 4.0.2）軟件將獨(dú)活-牛膝藥對治療KOA 的交集靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)換成ID，利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）以及在R 軟件中調(diào)用生物類的程序包對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析（P＜0.01），通過對基因的富集分析預(yù)測獨(dú)活-牛膝藥對治療KOA的可能機(jī)制。

1.1.5 京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析 使用R軟件對交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析（P＜0.05），得到KEGG 富集分析具體通路信息。

1.1.6 分子對接驗證 將篩選得到的前5 位核心靶點(diǎn)與相應(yīng)活性成分進(jìn)行分子對接驗證。從PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org）中搜索靶點(diǎn)蛋白的PDB ID，并用PyMol 1.0.0.0 刪除水分子；同時在Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫下載對應(yīng)成分的2D 結(jié)構(gòu)，并應(yīng)用Chem3D 19.0 軟件進(jìn)行優(yōu)化轉(zhuǎn)化， 將受體和配體信息導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.6 軟件，進(jìn)行分子對接，選擇bindingenergy 最低的構(gòu)象保存后應(yīng)用Discovrey Studio進(jìn)行顯示。

1.2 細(xì)胞驗證

1.2.1 細(xì)胞模型構(gòu)建與給藥 4只1周齡SPF級健康雄性、體質(zhì)量10 ～20 g 的SD 大鼠，購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）20190003；實驗單位：山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，使用許可證號：SYXK（魯）2018001；本研究方案已獲得山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實驗動物倫理審查委員會審批，批號：2021-04。取4 只大鼠的關(guān)節(jié)軟骨組織，采用胰酶-Ⅱ型膠原酶2 步酶消化法獲得原代軟骨細(xì)胞，置于含5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。以10 ng·mL-1的IL-1β[9（]美國R&D Systems 公司產(chǎn)品）溶液干預(yù)正常培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞24 h，得到退變軟骨細(xì)胞模型，作為后續(xù)實驗研究對象。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、模型組及槲皮素（MedChemExpress 公司，批號：HY-18085）低、中、高濃度組（25、50、100 μmol/L[10]，槲皮素先用DMSO 溶解，然后用培養(yǎng)基稀釋成對應(yīng)的濃度，最終DMSO 的濃度均小于0.1%），相應(yīng)藥物干預(yù)24 h。

1.2.2 Western Blot 法 檢 測 細(xì) 胞 TP53、MMP9、VEGFA 蛋白表達(dá) 取對數(shù)期各組細(xì)胞，使用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用二喹啉甲酸（BCA）測定試劑盒檢測蛋白濃度，制作上樣液。每樣品孔30 μg蛋白的標(biāo)準(zhǔn)加樣，加樣后依次進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室溫環(huán)境在搖床上使用脫脂奶粉溶液封閉1 h，分別加入按體積比稀釋的一抗（由武漢三鷹公司生產(chǎn)）包括TP53（1∶5 000）、MMP9（1∶1 000）、VEGFA（1∶1 000）、GAPDH（1∶50 000），4 ℃孵育過夜。次日，PBS 洗滌3 次，每次5min，加入辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG（H+L）（由北京中杉金橋公司生產(chǎn)，按體積比1∶10 000稀釋）室溫孵育1 h后，進(jìn)行顯影曝光，分析灰度值。

1.2.3 RT-PCR法檢測細(xì)胞TP53、MMP9、VEGFA mRNA 表達(dá) 取對數(shù)期各組細(xì)胞，TRIzol 法提取RNA，使用Nanodrop 2000 分光光度計檢測各組RNA 濃度。按照Roche 反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書將mRNA 反轉(zhuǎn)錄得cDNA，使用LightCycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。使用25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火 10 s，72 ℃延伸 10 s，共 45 個循環(huán)；溶解曲線：95 ℃5 s，65 ℃1 min；冷卻。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行基因定量計算。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.2.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊采用LSD 檢驗，方差不齊采用Games-Howell 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 獨(dú)活-牛膝藥對活性成分及靶點(diǎn)篩選 以O(shè)B ≥30%、DL ≥0.18 作為篩選條件，不符合上述標(biāo)準(zhǔn)但是《中國藥典》含量測定標(biāo)準(zhǔn)中提及到的獨(dú)活、牛膝成分也納入該研究，篩選去重后共得到14個活性成分（betavulgarin、rubrosterone、betasitosterol、quercetin、ammidin、isoimperatorin、OAcetylcolumbianetin、angelol D、[（1R，2R）-2，3-dihydroxy-1-（7-methoxy-2-oxochromen-6-yl）-3-methylbutyl]（Z）-2-methylbut-2-enoate、angelicone、[（1R，2R）-2，3-dihydroxy-1-（7-methoxy-2-oxochromen- 6- yl）- 3- methylbutyl] （Z） - 2-methylbut-2-enoate、nodakenin、osthole、zosimin），其中牛膝4 個、獨(dú)活10 個。共有對應(yīng)靶點(diǎn)340 個，篩選去重最終得到活性成分靶點(diǎn)171個。

2.2 KOA 靶點(diǎn)的獲取及與獨(dú)活-牛膝藥對靶點(diǎn)的交集分析 以“knee osteoarthritis”為關(guān)鍵詞，通過檢索GeneCards、OMIM 等數(shù)據(jù)庫，篩選去重后，共得到2 040個KOA疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將上述活性成分靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)，導(dǎo)入OmicShare，繪制韋恩（Venn）圖，并得到交集靶點(diǎn)99個，如圖1所示。

圖1 獨(dú)活-牛膝藥對活性成分靶點(diǎn)與膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）靶點(diǎn)交集韋恩（Venn）圖Figure 1 Venn diagram of the intersection of the active component targets of the Angelicae Pubescentis Radix and Achyranthis Bidentatae Radix drug pair and the KOA targets

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過STRING 數(shù)據(jù)庫對上述交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，物種參數(shù)設(shè)置為“Homo sapiens”，“minimum required interaction score”設(shè)置為0.9，并隱藏游離點(diǎn)得到蛋白質(zhì)相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（如圖2）。將該網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治觯瑯?gòu)建疾病-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（如圖3），并利用R軟件篩選連接節(jié)點(diǎn)數(shù)排前30 位的靶點(diǎn)作為獨(dú)活-牛膝藥對治療KOA的核心靶點(diǎn)（如圖4）。

圖2 獨(dú)活-牛膝藥對靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 2 PPI network of Angelicae Pubescentis Radix and Achyranthis Bidentatae Radix drug pair targets

圖3 獨(dú)活-牛膝藥對活性成分-膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 Interaction network diagram of Angelicae Pubescentis Radix and Achyranthis Bidentatae Radix drug pair active component-KOA-target

圖4 獨(dú)活-牛膝藥對治療膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）的核心靶點(diǎn)Figure 4 The core targets of Angelicae Pubescentis Radix and Achyranthis Bidentatae Radix drug pair for treating KOA

2.4 GO 富集分析結(jié)果 使用R（x64 4.0.2）軟件將獨(dú)活-牛膝藥對治療KOA 的交集靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)換成ID，利用DAVID 數(shù)據(jù)庫以及R 軟件對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析（P＜0.01），得到GO 富集分析結(jié)果，如圖5（顯示前20個功能），主要有炎癥反應(yīng)、細(xì)胞代謝、調(diào)節(jié)蛋白激酶及磷酸酶活性等。

圖5 獨(dú)活-牛膝藥對活性成分潛在靶點(diǎn)參與的生物學(xué)過程分析Figure 5 Analysis of biological processes involving potential targets of active components of Angelicae Pubescentis Radix and Achyranthis Bidentatae Radix drug pair

2.5 KEGG 富集分析結(jié)果 使用R 軟件對交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 富集分析（P＜0.05），得到KEGG 富集分析具體通路信息，如圖6，主要有腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、白細(xì)胞介素17（IL-17）信號通路、癌癥通路（pathways in cancer）等。

圖6 獨(dú)活-牛膝藥對治療膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）的KEGG通路富集分析Figure 6 KEGG pathway enrichment analysis of Angelicae Pubescentis Radix and Achyranthis Bidentatae Radix drug pair in the treatment of knee osteoarthritis（KOA）

2.6 分子對接結(jié)果 將篩選得到的前5 位核心靶點(diǎn)IL-6、MMP9、VEGFA、AKT1、TP53 與相應(yīng)活性成分槲皮素（quercetin）進(jìn)行分子對接驗證，結(jié)果顯示，獨(dú)活-牛膝藥對中槲皮素與IL-6、MMP9、VEGFA、AKT1、TP53等關(guān)鍵靶點(diǎn)有較好的結(jié)合能力。結(jié)果如表2所示。從分子對接分?jǐn)?shù)可以判斷活性成分與相關(guān)潛在靶點(diǎn)的結(jié)合程度，總分絕對值大于5.0 表明，活性成分與靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性，總分大于7.0表明，分子與靶點(diǎn)具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性（分子對接模式見圖7）。分子對接結(jié)果驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果的可靠性。

圖7 分子對接模式圖Figure 7 Molecular docking model diagram

表2 分子對接結(jié)果Table 2 Molecular docking results

2.7 槲皮素對KOA軟骨細(xì)胞TP53、VEGFA、MMP9 mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響 圖8結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組細(xì)胞中TP53、VEGFA、MMP9 mRNA 及蛋白的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），經(jīng)過不同濃度槲皮素干預(yù)的細(xì)胞中TP53、VEGFA、MMP9 mRNA及蛋白的表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05），均呈濃度依賴性。

圖8 各組軟骨細(xì)胞TP53、VEGFA、MMP9 mRNA及蛋白表達(dá)比較Figure 8 Comparison of mRNA and protein expressions of TP53，VEGFA and MMP9 in chondrocytes among various groups

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨損傷是退變性膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）病理進(jìn)程中最核心的病變之一，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨已成為KOA治療的核心靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，獨(dú)活-牛膝藥對中有14個有效活性成分、作用于KOA的潛在靶點(diǎn)有171 個。進(jìn)行成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析則顯示，槲皮素對應(yīng)靶點(diǎn)最多。既往研究表明，槲皮素[11-12]可減少促炎性細(xì)胞因子生成、調(diào)控炎癥相關(guān)信號通路，抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，可有效治療KOA。本課題組前期研究[10，13]也發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以靶向阻斷p38MAPK信號通路來保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。

本研究PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，獨(dú)活-牛膝藥對治療KOA 核心靶點(diǎn)主要有IL-6、MMP9、VEGFA、AKT1、TP53 等。白細(xì)胞介素6（IL-6）是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的核心因子，可激活KOA 軟骨細(xì)胞的炎性反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分解代謝，加速軟骨細(xì)胞退變[14-15]。基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）可以降解軟骨基質(zhì)中大部分成分，其中最主要的是通過降解膠原蛋白和蛋白多糖來加速軟骨基質(zhì)的分解代謝，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞逐漸發(fā)生凋亡壞死，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加速和KOA病理進(jìn)程的加重[16]。RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）通過酶的活性作用在調(diào)控軟骨細(xì)胞各種生物進(jìn)程中起重要作用，在KOA軟骨內(nèi)，AKT1的活性明顯降低，其mRNA 表達(dá)和磷酸化水平同時下調(diào)[17]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）可促進(jìn)血管的新生，加速膝關(guān)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)的交換以及炎性產(chǎn)物的代謝，進(jìn)而加速KOA 的病理進(jìn)程[18-19]。TP53 具有抑制DNA 復(fù)制，阻斷細(xì)胞周期，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，加速軟骨降解的作用[20]。提示獨(dú)活-牛膝藥對可能通過調(diào)節(jié)以上靶點(diǎn)治療KOA，且分子對接結(jié)果表明獨(dú)活-牛膝藥對活性成分與核心靶點(diǎn)均有良好的結(jié)合能力。

本研究KEGG 富集分析顯示，獨(dú)活-牛膝藥對治療KOA 核心靶點(diǎn)主要涉及腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、白細(xì)胞介素17（IL-17）信號通路、癌癥通路等，這些通路均是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要通路，均與KOA 的發(fā)生發(fā)展、炎癥反應(yīng)程度及軟骨細(xì)胞的凋亡等進(jìn)程息息相關(guān)。TNF-α 可激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和MAPK信號通路，進(jìn)而促進(jìn)MMPs的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)IL-6、IL-1β等炎癥因子產(chǎn)生，加劇軟骨的破壞[21-22]。IL-17 可誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的加重和關(guān)節(jié)軟骨的降解，既往研究表明，IL-17在KOA中表達(dá)顯著升高，且其表達(dá)量與KOA 的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[23]。通過KEGG 富集分析結(jié)果可以看出獨(dú)活-牛膝藥對治療KOA 具有多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，但主要是通過下調(diào)細(xì)胞因子表達(dá)、抑制炎癥反應(yīng)、減慢軟骨降解退變來延緩KOA的進(jìn)展。

最后，本研究使用了分子對接技術(shù)，取前5位核心靶點(diǎn)IL-6、MMP9、VEGFA、AKT1、TP53 與相應(yīng)活性成分槲皮素進(jìn)行分子對接驗證，結(jié)果顯示，獨(dú)活-牛膝藥對中槲皮素與IL-6、MMP9、VEGFA、AKT1、TP53等關(guān)鍵靶點(diǎn)均能結(jié)合，其中與MMP9、VEGFA、TP53的結(jié)合分?jǐn)?shù)大于5，提示結(jié)合活性較好。且體外實驗通過Western Blot 及RT-PCR 實驗驗證了有效成分槲皮素能抑制KOA軟骨細(xì)胞中MMP9、VEGFA、TP53 的表達(dá)，證實了獨(dú)活-牛膝藥對治療KOA的靶向作用。

綜上所述，本研究遵循網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價方法指南，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的方法，系統(tǒng)闡述了獨(dú)活-牛膝藥對治療KOA的作用機(jī)制，挖掘出了多個潛在的治療靶點(diǎn)并通過體外實驗進(jìn)行了驗證。在后續(xù)研究中，要進(jìn)一步應(yīng)用中藥復(fù)方的研究方法，鑒別獨(dú)活-牛膝藥對中有效的藥物成分，并且對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的關(guān)鍵通路進(jìn)行驗證，從而為獨(dú)活-牛膝藥對的機(jī)制研究及臨床推廣提供新的思路和依據(jù)。