基于AMPK/eNOS信號通路探討黃芪甲苷改善糖尿病腎病大鼠腎損傷的作用及機制研究

李國玲， 匡彬， 張舒， 李鑫， 董鑫， 章良佑， 陳剛毅

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510405；2.東莞市中醫(yī)院，廣東東莞 523127；3.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）作為糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一，現(xiàn)已成為終末期腎病（endstage renal disease，ESRD）患者的主要死亡原因之一[1]。糖尿病可導致血管內(nèi)皮功能障礙，形成腎小球增大、基底膜增厚、系膜細胞增生及細胞外基質(zhì)增多等腎臟病理結(jié)構(gòu)改變。臨床上表現(xiàn)為腎功能的持續(xù)性減退，大量蛋白尿，水腫，若不加以干預(yù)，則發(fā)展成腎小球硬化，最終導致腎功能衰竭[2-3]。研究表明，腺苷酸蛋白活化激酶（AMPK）激活后能夠上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表達，促進一氧化氮（NO）的形成、釋放，進而改善血管內(nèi)皮功能[4-5]。在糖尿病狀態(tài)下，AMPK、eNOS 表達降低，NO 釋放減少，引起機體腎臟抗氧化能力下降及DKD 的發(fā)生與持續(xù)進展[6]。目前，尚無有效的針對糖尿病誘發(fā)的腎臟血管內(nèi)皮功能障礙的確切診療方案，因此，尋找有效的治療方法改善DKD 中的血管內(nèi)皮功能異常是目前所面臨的重大挑戰(zhàn)。

現(xiàn)代醫(yī)學治療DKD 以控制血壓、血糖、調(diào)控飲食為主，但在控制蛋白尿、改善腎功能方面存在一定的局限性[7-8]，中醫(yī)藥及單體成分治療逐漸成為眾多醫(yī)家的選擇和研究方向。前期實驗研究[9]表明，我院名老中醫(yī)洪欽國教授所研制的升清降濁膠囊可降低鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的DKD大鼠的尿白蛋白、血肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）水平，改善DKD 大鼠腎臟損傷，黃芪為該膠囊的主要組成成分，而黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分。有研究[10]表明，黃芪甲苷對改善糖尿病及其并發(fā)癥有著顯著的效果。還有研究[11]發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷在高糖環(huán)境下可通過調(diào)控eNOS、NO等血管活性物質(zhì)的表達來發(fā)揮保護血管內(nèi)皮的功能；但具體機制尚未明確。因此，本研究構(gòu)建了2型糖尿病腎臟損害模型，探索黃芪甲苷能否通過AMPK/eNOS 通路減輕DKD大鼠的腎臟損傷，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 27只SPF級雄性SD大鼠，5周齡，體質(zhì)量160 ～180 g，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-0034。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物實驗中心，溫度（22±2）℃，濕度（50±10）%，晝夜交替各12 h，自由攝食、飲水。本研究動物實驗已經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，倫理批號：TCM F1-2019009。高脂飼料（按質(zhì)量分數(shù)配比，58.5%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+20%蔗糖+5%酪蛋白+1%膽固醇+0.5%膽酸鈉），購自廣東省動物實驗中心。

1.2 藥物與試劑 黃芪甲苷（純度≥98%；分子式：C41H68O14；分子量：784.98；由南京春秋生物工程有限公司生產(chǎn)，批號：A800922）。1%羧甲基纖維素溶液（伊勢久生物科技有限責任公司，批號：110238）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國APExBIO公司，批號：18883664）；大鼠尿微量白蛋白（MAU/ALB）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；肌酐測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；RNAzol（美國MRC 公司）；Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液、定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）試劑盒（艾科瑞生物公司）；兔抗大鼠磷酸化AMPK（p-AMPK）單克隆抗體、AMPK 單克隆抗體、eNOS多克隆抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司）；兔抗大鼠β-actin 單克隆抗體（碧云天生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 抗體、3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、乙酰胺（BSA）試劑盒（碧云天生物科技有限公司）；Invent MinuteTM蛋白提取試劑盒（美國Invent公司）；2×雙色蛋白上樣緩沖液（2×dual color protein loading buffer，杭州弗德生物科技有限公司）；電化學發(fā)光（ECL）顯影液（凱基生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器 血糖儀（美國強生公司，型號：Sure Step Plus 型）；熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司，型號：CFX96 Touch）；全自動凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司，型號：Gel Doc EZ）；組織勻漿機（瑞士Roche公司，型號：MagNA Lyser）；全自動生化分析儀（瑞士Roche 公司，型號：Cobas8000）；低溫高速離心機（美國Beckman 公司，型號：Allegra X-30R）；離心機（美國Sigma-Aldrich公司，型號：Sigma 3 K15）。

1.4 動物分組與造模 將27只大鼠隨機分為3組，即正常組、模型組、黃芪甲苷組，每組9只。參考文獻方法[12-14]構(gòu)建糖尿病腎病大鼠模型，方法：模型組、黃芪甲苷組給予高脂飼料喂養(yǎng)，同時一次性腹腔注射1%STZ 40 mg/kg，正常組給予腹腔注射等體積生理鹽水。3 d 后禁食不禁水12 h 尾靜脈采血測定空腹血糖（FBG），若FBG ≥16.7 mol/L，則判斷糖尿病模型制備成功；若FBG＜16.7 mol/L，則給予大鼠追加30 mg/kg STZ腹腔注射1次，3 d后再次尾靜脈采血測定FBG，F(xiàn)BG ≥16.7 mol/L 表明糖尿病模型制備成功。然后，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，4 周后測定尿白蛋白，尿白蛋白≥30 mg/24 h即判斷DKD 模型制備成功。造模期間未有大鼠死亡， 18 只大鼠均造模成功。DKD 模型制備成功后，黃芪甲苷組給予40 mg/kg 黃芪甲苷（黃芪甲苷干粉以1%羧甲基纖維素溶液助溶配制成混懸液，終濃度為0.3 mg/mL）灌胃[15-16]，正常組和模型組給予相同體積生理鹽水灌胃，每日1 次，療程均為12周。

1.5 觀察指標與方法

末次給藥前1 d 將大鼠置于代謝籠中收集24 h尿液，取上清用于尿白蛋白的檢測。末次給藥后，稱定體質(zhì)量；禁食不禁水12 h，測定FBG 水平；隨后采用1%戊巴比妥鈉100 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血，收集血清后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。采血結(jié)束后取出雙腎，統(tǒng)一將右腎置入4%多聚甲醛溶液中固定保存?zhèn)溆?，左腎則置入-80 ℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.1 尿白蛋白/尿肌酐比值（UACR）及血清BUN、SCr水平檢測 取大鼠尿液的上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠尿白蛋白含量，按照ELISA試劑盒說明書步驟操作。采用肌氨酸氧化酶法測定尿肌酐含量，按照肌酐測定試劑盒說明書步驟操作。計算尿白蛋白和肌酐的比值即為UACR水平。采用全自動生化分析儀檢測血清中血尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）水平。

1.5.2 蘇木素-伊紅（HE）、過碘酸雪夫（PAS）、馬松（Masson）染色 從4%多聚甲醛溶液中取出腎臟組織進行脫水、石蠟包埋與切片，切片厚度為4 μm，之后分別進行HE、PAS、Masson 染色。脫水封片后將切片放于顯微鏡下觀察，HE染色觀察腎臟組織病理形態(tài)，PAS、Masson染色觀察腎臟組織纖維化情況，并采集圖像分析。

1.5.3 RT-qPCR法測定腎組織中腺苷酸蛋白活化激酶（AMPK）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）mRNA 的表達 稱取30 mg腎臟組織按試劑盒說明書提取總RNA，測定RNA 濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后按照qPCR 試劑盒說明書擴增目的基因。反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。AMPK和eNOS引物由廣州國自科技有限公司合成，GAPDH 引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1，反應(yīng)體系嚴格按照說明書進行。反應(yīng)后得到的Ct值，采用2-ΔΔCt定量法計算目的基因相對表達量。

表1 PCR引物序列信息表Table 1 PCR primer sequence information table

1.5.4 Western Blot 法檢測腎臟組織p-AMPK、AMPK、eNOS蛋白表達 取約30 mg腎臟組織提取總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后99 ℃金屬浴5 min 使蛋白充分變性。將各組蛋白樣本進行SDS-PAGE 電泳分離蛋白，電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，加入50 g/L 脫脂牛奶封閉1 h，分別加入按體積比 1∶1 000 稀釋的p-AMPK、AMPK、eNOS、β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，洗滌3次后加入二抗（按體積比1∶1 000 稀釋），室溫孵育1 h 后取出洗滌3次，加入ECL顯影液充分反應(yīng)后通過全自動凝膠成像系統(tǒng)曝光，得到蛋白印跡條帶，采用ImageJ 軟件分析各蛋白條帶灰度值并計算其蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計方法 采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料均符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)描述以均數(shù)±標準差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析法（ANOVA）。若方差齊性，組間兩兩比較采用LSD-t法；若方差不齊，組間兩兩比較采用Tamhane T2法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG 水平的比較 表2 結(jié)果顯示：治療前，與正常組比較，模型組和黃芪甲苷組FBG 水平均明顯升高（P＜0.05），且模型組與黃芪甲苷組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療12 周后，與正常組比較，模型組大鼠FBG 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷組大鼠FBG水平均顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠治療前后空腹血糖（FBG）水平比較Table 2 Comparison of fasting blood glucose（FBG）level among various groups of rats before and after treatment （，mmol·L-1）

表2 各組大鼠治療前后空腹血糖（FBG）水平比較Table 2 Comparison of fasting blood glucose（FBG）level among various groups of rats before and after treatment （，mmol·L-1）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

治療后7.18±1.47 24.80±3.38①14.28±1.52②組別正常組模型組黃芪甲苷組鼠數(shù)/只555治療前7.62±1.39 24.62±5.45①28.40±1.93①

2.2 各組大鼠UACR 和血清BUN、SCr 含量比較 表3、表4結(jié)果顯示：治療前，與正常組比較，模型組大鼠UACR 含量顯著升高（P＜0.05），黃芪甲苷組UACR與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療12周后，與正常組比較，模型組大鼠UACR 含量明顯增加（P＜0.05），與模型組比較，黃芪甲苷組大鼠UACR 含量明顯下降（P＜0.05）。與正常組比較，模型組大鼠BUN 含量明顯增加（P＜0.05）；黃芪甲苷組大鼠BUN與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3組間SCr 含量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠治療前后尿白蛋白/尿肌酐比值（UACR）水平比較Table 3 Comparison of urinary albumin/urinary creatinine ratio（UACR）among various groups of rats before and after treatment （，mg·g-1）

表3 各組大鼠治療前后尿白蛋白/尿肌酐比值（UACR）水平比較Table 3 Comparison of urinary albumin/urinary creatinine ratio（UACR）among various groups of rats before and after treatment （，mg·g-1）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

治療后9.05±3.15 392.60±106.10①187.50±31.69②組別正常組模型組黃芪甲苷組鼠數(shù)/只555治療前5.39±1.25 126.91±100.81①213.74±76.98①

表4 各組大鼠尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）含量的比較Table 4 Comparison of BUN and SCr contents among various groups of rats （）

表4 各組大鼠尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）含量的比較Table 4 Comparison of BUN and SCr contents among various groups of rats （）

注：①P＜0.05，與正常組比較

組別正常組模型組黃芪甲苷組SCr/（μmol·L-1）23.20±16.18 29.00±15.30 23.40±10.50鼠數(shù)/只555 BUN/（mmol·L-1）6.00±1.73 11.15±2.67①14.12±3.40①

2.3 各組大鼠腎臟病變比較 圖1 結(jié)果顯示：正常組大鼠腎小球未見明顯增大，基底膜無明顯增厚，系膜基質(zhì)未見明顯增生，腎小囊腔無明顯狹窄，腎小管未見明顯空泡樣及顆粒樣改變；與正常組比較，模型組大鼠腎小球體積可見明顯增大、基底膜彌漫性增厚，毛細血管腔明顯狹窄，系膜基質(zhì)增生，腎小囊腔明顯縮小；與模型組比較，黃芪甲苷組大鼠腎小球體積明顯減小，基底膜增厚、系膜基質(zhì)增生明顯減輕，毛細血管腔、腎小囊腔狹窄程度明顯改善。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色結(jié)果（×400）Figure 1 HE staining results of renal tissue in each group of rats（×400）

2.4 各組大鼠腎臟纖維化狀況比較 圖2、圖3結(jié)果顯示：正常組大鼠腎間質(zhì)可見少量膠原纖維；與正常組比較，模型組腎小球內(nèi)和腎間質(zhì)膠原纖維沉積明顯增多，腎小管基底膜可見膠原纖維；與模型組比較，黃芪甲苷組腎小球、腎小管及腎間質(zhì)膠原纖維顯著減少。

圖2 各組大鼠腎臟組織PAS染色結(jié)果（×400）Figure 2 PAS staining results of renal tissue in each group of rats（×400）

圖3 各組大鼠腎臟組織Masson染色結(jié)果（×400）Figure 3 Masson staining results of renal tissue in each group of rats（×400）

2.5 各組大鼠腎臟組織AMPK和eNOS mRNA表達比較 表5 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組AMPK 和eNOS mRNA 表達水平均明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷組AMPK和eNOS mRNA表達水平均有顯著上升（P＜0.05）。

表5 各組大鼠腎組織腺苷酸蛋白活化激酶（AMPK）、內(nèi)皮型一氧化氮酶（eNOS）mRNA相對表達量比較Table 5 Comparison of the relative expression levels of AMP-activated protein kinase（AMPK），endothelial nitric oxide synthase（eNOS）in renal tissue among various groups of rats （）

表5 各組大鼠腎組織腺苷酸蛋白活化激酶（AMPK）、內(nèi)皮型一氧化氮酶（eNOS）mRNA相對表達量比較Table 5 Comparison of the relative expression levels of AMP-activated protein kinase（AMPK），endothelial nitric oxide synthase（eNOS）in renal tissue among various groups of rats （）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

eNOS 1.00±0.11 0.27±0.08①0.80±0.15②組別正常組模型組黃芪甲苷組鼠數(shù)/只555 AMPK 1.01±0.17 0.29±0.11①1.00±0.15②

2.6 各組大鼠腎臟組織p-AMPK、eNOS蛋白表達比較 表6、圖4 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組p-AMPK和eNOS蛋白表達水平均明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷組p-AMPK 和eNOS蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠腎臟組織中腺苷酸蛋白活化激酶（AMPK）、磷酸化AMPK（p-AMPK）、內(nèi)皮型一氧化氮酶（eNOS）蛋白電泳條帶圖Figure 4 Electrophoresis bands of AMP-activated protein kinase（AMPK），phosphorylated AMPK（p-AMPK）and endothelial nitric oxide synthase（eNOS）in renal tissue in each group of rats

表6 各組大鼠腎組織腺苷酸蛋白活化激酶（AMPK）、磷酸化AMPK（p-AMPK）、內(nèi)皮型一氧化氮酶（eNOS）蛋白相對表達量比較Table 6 Comparison of the protein relative expression levels of AMP-activated protein kinase（AMPK），phosphorylated AMPK（p-AMPK）and endothelial nitric oxide synthase（eNOS）in renal tissue among various groups of rats （）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

eNOS/β-actin 0.85±0.06 0.30±0.05①0.65±0.06②組別正常組模型組黃芪甲苷組鼠數(shù)/只444 p-AMPK/AMPK 1.01±0.09 0.27±0.06①0.80±0.05②

3 討論

糖尿病的糖代謝紊亂狀態(tài)可以刺激機體形成氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，進而分泌細胞因子及炎癥介質(zhì)，造成血管內(nèi)皮功能的紊亂，從而導致糖尿病腎病、動脈粥樣硬化等微血管病變并發(fā)癥的發(fā)生[17]。糖尿病腎病的高發(fā)病率、高死亡率、發(fā)病機制的復(fù)雜性與不確定性等現(xiàn)狀都阻礙了糖尿病腎病的治療進展[18-19]。糖尿病腎病作為糖尿病并發(fā)癥，根據(jù)其臨床表現(xiàn)特點可歸屬于中醫(yī)“水腫”“虛勞”“關(guān)格”等范疇，本病病機以脾腎虛衰、濕濁瘀毒阻滯為主，治療上多以補益脾腎、通腑泄?jié)釣榉╗20-21]。黃芪具有補脾益肺、升舉陽氣之功，以黃芪為主要藥物體現(xiàn)的升清降濁法，可通過提升脾氣運化及重塑小腸分清泌濁功能以排出體內(nèi)濕濁瘀毒邪氣，進而改善DKD、慢性腎衰竭、慢性腎臟病3 ～5 期非透析患者的臨床癥狀及腎功能，延緩病情進展[22]。黃芪甲苷是黃芪的重要活性成分之一，研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可改善糖尿病腎病大鼠的血糖、尿蛋白、尿肌酐清除率及腎皮質(zhì)纖維化等，進而發(fā)揮其腎臟保護作用[23]。

現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，腎臟內(nèi)皮細胞功能異常是導致糖尿病腎病的重要原因之一。eNOS 在腎臟中主要在腎小球毛細血管的內(nèi)皮細胞中表達，eNOS 表達減少或活性下降易導致糖尿病大鼠腎臟結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變，如腎小球增大、毛細血管內(nèi)皮細胞、系膜細胞、系膜基質(zhì)異常增殖、基底膜增厚等，最終導致腎小球硬化，加速腎衰竭的進程，而提高eNOS 活性，可改善上述癥狀[24-26]。AMPK 作為能量代謝過程中的一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)酶，可通過對eNOS上的S1177磷酸化位點調(diào)控eNOS的活性，AMPK 對該位點的磷酸化可增強eNOS 的活性，上調(diào)eNOS 的表達，促進NO 釋放增多，延緩DKD引起的腎功能衰竭進程[27]。但黃芪甲苷能否通過AMPK/eNOS這一途徑保護DKD的腎臟功能尚不清楚。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能顯著下調(diào)DKD 大鼠 FBG、UACR 水平，改善 DKD 大鼠腎小球、基底膜、系膜基質(zhì)損害，減輕腎臟膠原纖維沉積。進一步的實驗結(jié)果提示，黃芪甲苷能有效上調(diào)DKD 大鼠腎臟組織中AMPK、eNOS 的基因表達，促進AMPK的磷酸化及eNOS的蛋白表達。

有研究[28]提出，若糖尿病狀態(tài)持續(xù)時間不足3 ～8 個月，出現(xiàn)腎病范圍的蛋白尿、相應(yīng)的組織病理學特征而無明顯的腎功能損害分別是處于此階段的DN動物模型的主要特征及可能出現(xiàn)的主要缺陷；而實驗觀察時間過長又易導致大鼠出現(xiàn)酮癥酸中毒等并發(fā)癥，進而出現(xiàn)死亡。本實驗未觀察到黃芪甲苷對BUN、SCr 等腎功能指標的影響，提示黃芪甲苷在發(fā)揮腎臟保護作用的同時對大鼠的腎功能無明顯損害，安全有效。

綜上所述，黃芪甲苷能明顯改善DKD 大鼠腎功能，其作用機理可能與通過激活A(yù)MPK/eNOS 信號通路相關(guān)。