二至丸中抑制組織蛋白酶K活性的物質(zhì)基礎(chǔ)研究

蔣益萍，金玉娥，張志瑋，夏天爽，徐佳樂，薛黎明 （.海軍軍醫(yī)大學藥學院生藥學教研室, 上海 00433；.上海市疾病預防控制中心化學品毒性檢定所, 上海 00336；3.上海市預防醫(yī)學研究院, 上海 00336）

組織蛋白酶K(CTSK) 屬于半胱氨酸蛋白酶，是細胞內(nèi)重要的溶酶體酶，在很多組織中有表達，如肺、腦、皮膚、骨骼和甲狀腺等。CTSK在體內(nèi)主要發(fā)揮降解骨膠原蛋白、彈性纖維蛋白、甲狀腺球蛋白及細胞外基質(zhì)的作用，與人類多種疾病密切相關(guān)，如腫瘤[1]、骨疾病、心血管疾病和肺纖維化等[2]。CTSK最早發(fā)現(xiàn)在破骨細胞特異性高表達，主要發(fā)揮降解骨基質(zhì)中含量達95%的Ⅰ型膠原[2]?；谏锘瘜W和結(jié)構(gòu)分析研究發(fā)現(xiàn)CTSK與黏多糖（GAGs)可形成一種復合物，如硫酸軟骨素(chondroitin-4-sulfate, C4S或CSA)，且只有這種復合物形成下才能更好發(fā)揮降解膠原作用[3]。

二至丸是治療腎陰虛癥的經(jīng)典名方，由女貞子和墨旱蓮組成，經(jīng)考證出自明代吳曼輯所著的《扶壽精方》，收載于2020版《中國藥典》，具補益肝腎，滋陰止血功效[4]。藥理研究發(fā)現(xiàn)二至丸具有保肝降酶、增強免疫調(diào)節(jié)、改善血液系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、抗衰老、抗氧化、抗變態(tài)反應性炎癥和植物雌激素樣等作用[5]。臨床報道，二至丸常用于治療骨質(zhì)疏松[6-8]，藥理發(fā)現(xiàn)二至丸顯著降低去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清中CTSK水平[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)墨旱蓮的正丁醇提取部位和活性成分墨旱蓮皂苷IX能顯著抑制CTSK的膠原降解活性[9]。因此，二至丸很有可能存在抑制組織蛋白酶K的活性成分，故有可能從中篩選組織蛋白酶K抑制劑。本研究采用熒光偏振法考察CTSK與硫酸軟骨素A(CSA)復合物形成活性，熒光光度法考察CTSK與合成熒光底物benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (Z-FR-MCA)結(jié)合活性，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳法考察CTSK降解生理底物膠原蛋白和明膠的活性，以期從二至丸不同提取部位和活性成分中篩查具有抑制CTSK活性的抑制劑，最終闡明二至丸抑制CTSK酶活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

墨旱蓮、酒女貞子藥材購自上海華宇藥業(yè)有限公司, 經(jīng)海軍軍醫(yī)大學生藥學教研室韓婷教授鑒定墨旱蓮為菊科植物鱧腸EcliptaprostrataL.的干燥地上部分，女貞子為木犀科植物女貞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果實。其活性成分異毛蕊花糖苷、橄欖苦苷、蟛蜞菊內(nèi)酯、熊果酸、齊暾果酸、蒙花苷、槲皮苷、木樨草苷、異去甲基蟛蜞菊內(nèi)酯、松果菊苷、特女貞苷、紅景天苷、女貞苷、女貞苷G13等24種標準品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

Z-FR-MCA購自日本W(wǎng)AKO公司；E-64 (L-3-carboxy-trans-2-3-epoxypropionyl-leucylamido-(4guanidino)-butane)和硫酸軟骨素A (CSA)購自美國Sigma公司；熒光標記硫酸軟骨素A(CSA*)購自日本株式會社Cosmo Bio公司；人I型膠原蛋白(Human collagen I)購自美國Affymetrix公司，牛不溶性I型膠原蛋白(Bovine type I insoluble collagen)購自生工生物工程(上海)公司。

2 實驗方法

2.1 二至丸樣品及提取物制備

墨旱蓮500 g，加入10倍量水(W/V)，煎煮2次，每次1 h，合并提取液，煎煮濃縮，冷凍干燥，粉碎得墨旱蓮水提取物。酒女貞子按照2020版藥典二至丸制備方法，粉碎過80目篩。將酒女貞子粉末500 g與墨旱蓮水提取物粉末混勻，用10倍量正丁醇(W/V)回流提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，冷凍干燥得正丁醇部位提取物。濾渣揮干，按照正丁醇方法依次分別用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯溶液對濾渣進行萃取，冷凍干燥得到二至丸的正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯提取物。

研究報道二至丸的活性成分，主要包括墨旱蓮三萜皂苷類和女貞子環(huán)烯醚萜苷類成分，及一些黃酮類、苯乙醇苷類等成分[10-12]。本研究30個成分中墨旱蓮皂苷 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ) 和刺囊酸是由墨旱蓮正丁醇部位經(jīng)凝膠柱層析分離得到[9]，墨旱蓮中蟛蜞菊內(nèi)酯、異去甲基蟛蜞菊內(nèi)酯、木樨草素、槲皮苷、木樨草苷和女貞子中異毛蕊花糖苷、橄欖苦苷、熊果酸、齊暾果酸、木樨草素、槲皮苷、木樨草苷、松果菊苷、特女貞苷、紅景天苷、女貞苷、女貞苷G13、3-O-乙?；R墩果酸、19α-羥基熊果酸、大黃素甲醚、β-谷甾醇、3, 4-二羥基苯乙醇、對羥基苯乙醇等成分為購買標準品。

2.2 不同部位和成分抑制CTSK的Z-FR-MCA活性

二至丸不同提取部位和化合物用DMSO溶解分別配置40 mg/ml和10 mmol/L的儲備溶液，并在分析之前用100 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH5.5，包含2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA) 分別稀釋至濃度為25 μg/ml和 25 μmol/ml (DMSO低于1%)，加入黑色熒光96孔板，最終反應容量為0.2 ml。加入終濃度為5 nmol/L的CTSK孵育5 min，加入Z-FR-MCA底物(終濃度1 mmol/L)，孵育30 s，實時檢測5 min熒光生成斜率(slope)值(發(fā)散光波長460 nm，吸收光波長355 nm)。所有測量均使用熒光儀Tecan spark（美國）在96孔板中進行，單孔體積為200 μl。實驗設陰性對照組(無抑制劑)，陽性對照組(E-64，活性位點抑制劑)。計算公式：抑制率(%)= 100-(1-Vi /V0)。Vi和V0分別表示存在和不存在抑制劑情況下的熒光信號。

2.3 不同部位和成分抑制CTSK/CSA*復合物形成活性

將100 μg/ml不同部位或25 μmol/ml有效成分與200 nmol/L的CTSK在含有2.5 mmol/L DTT和EDTA的100 mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH 5.5）中，混勻放置5 min，然后添加20 nmol/L CSA*，混勻放置15 min，室溫下實時檢測5 min熒光生成斜率(slope)值(發(fā)散光波長485 nm，吸收光波長520 nm)，所有測量均使用熒光儀Tecan spark（美國）在黑色熒光96孔板中進行，總體積為100 μl。設置不使用抑制劑（陰性對照）和300 mmol/L NaCl（陽性對照）。CTSK和FP之間的關(guān)系使用抑制百分比進行分析，計算公式：抑制率(%)=100- [（100×（FPCTSK/抑制劑/CSA*-FPCSA*）/（FPCTSK/CSA*-FPCSA*）]其中，F(xiàn)PCTSK/抑制劑/CSA*和FPCTSK/CSA*分別是在存在和不存在抑制劑的情況下測定熒光信號。

2.4 膠原降解活性

人I型膠原0.6 mg/ml溶解于100 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH5.5，包含2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA)中，依次加入CTSK (最終濃度400 nmol/L)、CSA (最終濃度200 nmol/L) 和400 μg/ml二至丸不同提取部位或不同濃度潛在抑制劑(100、80、60、40、20、10 μmol/L)，加入到含有I型膠原蛋白的緩沖液，單孔體積50 μl，混勻，28 ℃孵育4 h。取出 后 加入1μl的 100 μmol/L E64終止反應。采用10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離，考馬斯亮藍染色20 min，用乙酸-甲醇(4∶1)脫色。I型膠原的α1條帶的灰度用ImageJ 2軟件進行定量分析。

2.5 潛在抑制劑與CTSK結(jié)合實驗

稱取1 mg不溶性牛I型膠原蛋白置于1.5 ml EP管 中，加 入1 μmol/L CTSK酶 和25 μmol/L潛在抑制劑于40 μl緩沖液中(100 mmol/L醋酸鹽緩沖液，pH值5.5，含有2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA)。采用Z-FR-MCA底物結(jié)合活性方法在T0 min測定CTSK活性，在37 ℃下孵育30 min后，檢測T30 min時的CTSK活性。從中取出40 μl上清液，添加2.0 μl NaCl（最終300 mmol/L），然后再次檢查CTSK活性，記錄為T30saltmin。計算公式：結(jié)合率(%)=[1-(T0 min-T30saltmin)/(T0 min-T30 min)]×100%。

2.6 分子對接libdock

用Discovery studio 2016軟件中的libdock分子對接方法考察活性成分和組織蛋白酶K(1ATK)蛋白進行剛性對接。利用LibDock得分作為表征化合物與活性位點結(jié)合的核心指標。LibDock得分分數(shù)越高，小分子與受體結(jié)合的活性越高。

2.7 統(tǒng)計分析

每組實驗重復3次。采用SPSS軟件經(jīng)ANOVA方差分析檢驗，若有顯著性差異(α=0.05)，再采用Student'st檢驗進行兩組比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 DMSO濃度對CTSK活性篩選方法的影響

本研究考察了DMSO濃度(10%、5%、2%和1%)對CTSK的Z-FR-MCA活性和CTSK/CSA*復合物形成活性高通量篩查方法，及SDS-PAGE膠原降解活性篩選方法的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10%、5%、2%的DMSO顯著抑制CTSK的Z-FR-MCA底物結(jié)合(圖1A)和CTSK/CSA*復合物形成活性(圖1B)。10%的DMSO顯著抑制CTSK的膠原降解，1%和2%的DMSO對膠原降解無明顯抑制作用。因此，本研究篩查二至丸的抑制CTSK活性方法將DMSO濃度控制在1%以下。

圖1 DMSO濃度對CTSK抑制劑篩查方法的影響

3.2 二至丸不同提取部位抑制CTSK活性作用

對二至丸的不同提取部位(正丁醇、石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷) 進行了抑制CTSK活性篩選，其中Z-FR-MCA底物結(jié)合實驗結(jié)果顯示，二至丸的石油醚部位抑制作用明顯，為96.3%，正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷提取部位抑制率分別為26.1%、50.8%和43.5%（見圖2A）。二至丸正丁醇、石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷提取部位提取物對CTSK/CSA*復合物形成的抑制率分別為99.6%、52.0%、94.8%和59.8%（見圖2B），膠原降解活性結(jié)果顯示二至丸的正丁醇部位抑制作用最明顯，達到100%，石油醚提取部位抑制作用為58%，二氯甲烷和乙酸乙酯提取部位作用也不明顯，分別為33.1%和6.7%（見圖2C和2D）。

圖2 二至丸的不同部位提取物抑制CTSK活性作用

3.3 二至丸活性成分對CTSK的活性作用

本研究對30種二至丸中的活性成分進行了體外篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)25 μmol/L的墨旱蓮皂苷Ⅸ、異毛蕊花糖苷、蟛蜞菊內(nèi)酯、木樨草素、槲皮素、松果菊苷、女貞苷、特女貞苷、3,4-二羥基苯乙醇和對羥基苯乙醇抑制CTSK/CSA*復合物形成的抑制率超過50%，表兒茶素沒食子酸酯為51.2%。而在25 μmol/L時，僅有齊墩果酸、3-0-乙酰基齊墩果酸、19α-羥基熊果酸、3,4-二羥基苯乙醇、對羥基苯乙醇對CTSK與Z-FR-MCA結(jié)合活性有超過50%的抑制率，熊果酸為47.1%抑制率。采用libdock技術(shù)發(fā)現(xiàn)僅有3,4-二羥基苯乙醇和對羥基苯乙醇與CTSK活性位點對接有得分。因此，這些超過50%抑制率的二至丸活性成分被認為具有潛在抑制膠原降解活性。 針對以上12種活性成分，進行膠原降解抑制實驗，結(jié)果顯示在100 μmol/L時，墨旱蓮皂苷Ⅸ，對膠原降解抑制率達70.3%，女貞苷53.2%，蟛蜞菊內(nèi)酯達50.1%和表兒茶素沒食子酸酯為60.2%。異毛蕊花糖苷、木樨草素、槲皮素、松果菊苷、特女貞苷、熊果酸、齊墩果酸、3-O-乙?；R墩果酸、19α-羥基熊果酸、3,4-二羥基苯乙醇、對羥基苯乙醇均顯示無抑制膠原降解活性(表1)。

表1 二至丸中化學成分抑制組織蛋白酶K活性篩選

3.4 二至丸潛在抑制劑與CTSK的結(jié)合作用

不溶性膠原、抑制劑和CTSK共培養(yǎng)15 min，通過檢測培養(yǎng)液中剩余CTSK的Z-FR-MCA活性，來驗證潛在CTSK抑制劑在體外抑制與CTSK的結(jié)合實驗，結(jié)果顯示100 μmol/L的墨旱蓮皂苷IX（ES-IX）、表兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、女貞苷(NZG)和蟛蜞菊內(nèi)酯(WED)抑制率分別為54.8%、64.1%、36.4%和51.4% (圖3)。

圖3 4種潛在活性化合物抑制CTSK和膠原結(jié)合作用

4 討論

CTSK抑制劑的高通量篩選方法，多采用合成底物Z-FR-MCA結(jié)合活性來篩選，其原理是CTSK可裂解底物端FR-MCA基團, 釋放游離的MCA 發(fā)色熒光基團, 通過抑制劑引起熒光信號變化差異來檢測評價抑制劑活性?；诠悄z原降解需要CTSK與CSA結(jié)合發(fā)揮作用，采用熒光標記CSA*，形成CTSK/CSA*復合物，其原理為抑制劑與CTSK酶結(jié)合形成CTSK/抑制劑/CSA*復合物，導致熒光偏振信號差異，評價抑制劑與CTSK結(jié)合活性，可快速、靈敏和準確的判斷化合物是否與CTSK存在相互作用。SDS-PAGE凝膠電泳法是常用蛋白質(zhì)分類技術(shù)，將膠原蛋白及其降解產(chǎn)物按照分子量大小遷移，考馬斯染色溶液染色，對α1膠原蛋白條帶定量，計算膠原蛋白降解率。

二至丸的正丁醇提取部位抑制CTSK/CSA*復合物形成和膠原降解活性最強，超過95%，但對CTSK的Z-FR-MCA抑制率只有26%。Z-FR-MCA作為CTSK活性位點的合成底物，活性成分對ZFR-MCA抑制率越高，證明對CTSK的活性位點抑制效率越高?；贐romme教授提出的非活性位點抑制劑的概念[13]，活性成分具有顯著的抑制膠原降解活性，但對活性位點Z-FR-MCA底物無抑制活性，可稱為非活性位點 (exosite) 抑制劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二至丸的正丁醇提取部位可顯著抑制膠原降解，而對Z-FR-MCA無顯著影響，證明正丁醇提取部位可能存在抑制 CTSK膠原降解活性的活性成分, 而不影響CTSK 活性位點的生理活性。二至丸的正丁醇提取部位的化學成分主要為墨旱蓮皂苷類成分和女貞子三萜酸類成分，其中墨旱蓮皂苷Ⅸ（ES-Ⅸ）、表兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、女貞苷(NZS)和蟛蜞菊內(nèi)酯(WED)可能是潛在的CTSK非活性位點抑制劑。熊果酸和齊墩果酸具有較強的Z-FR-MCA活性，表明可作用CTSK活性位點，而女貞子乙醇提取物、熊果酸、齊墩果酸和墨旱蓮的蟛蜞菊內(nèi)脂均報道顯著抑制破骨細胞的骨吸收活性和CTSK的mRNA表達[14-15]，可能通過在細胞內(nèi)直接作用CTSK酶，使其失去活性。

CTSK是抗骨質(zhì)疏松藥物研發(fā)的關(guān)鍵靶標，有報道，中草藥尤其是補腎中藥含有豐富的治療骨質(zhì)疏松的活性物質(zhì)，但不清楚這些化合物是否能夠抑制CTSK活性，或者特異性抑制膠原酶的活性。除了膠原降解活性，CTSK在甲狀腺細胞中發(fā)揮降解甲狀腺球蛋白，釋放甲狀腺激素[16]，在成纖維細胞中發(fā)揮降解纖維蛋白的功能[17]。二至丸中有抑制CTSK活性的化合物，可進一步考察其對甲狀腺球蛋白降解和纖維蛋白降解的作用活性，為中醫(yī)藥開發(fā)CTSK抑制劑提供新的思路。