溫度對不同發(fā)育階段黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率的影響

林慧，李悅，趙家樂，林植華，樊曉麗

（麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院，浙江 麗水 323000）

在水生動(dòng)物的生長、發(fā)育和繁殖過程中，呼吸代謝是其代謝活動(dòng)的重要組成部分。耗氧率的高低不僅直接反映了水生動(dòng)物的代謝強(qiáng)度和生理狀況，而且直接影響水體溶氧量[1-2]。動(dòng)物個(gè)體耗氧率主要取決于溫度、鹽度、攝食能力、發(fā)育階段和生態(tài)因子等因素[3]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者圍繞枝角類、魚類、貝類等水生動(dòng)物耗氧率的測定及其影響因素展開了較多研究[1-2，4-6]，而關(guān)于無尾兩棲類幼體蝌蚪耗氧率方面的研究報(bào)道較少[7-9]。

黑斑側(cè)褶蛙（Pelophylax nigromaculatus）隸屬于無尾目（Anura），蛙科（Ranidae），側(cè)褶蛙屬（Pelophylax），廣泛分布于我國東部各省，是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)動(dòng)物[10-11]。國內(nèi)關(guān)于黑斑側(cè)褶蛙的研究主要涉及疾病防治、養(yǎng)殖技術(shù)、生長發(fā)育和毒理學(xué)等方面[12-15]，未見其耗氧率方面的研究報(bào)道?，F(xiàn)開展溫度對不同發(fā)育階段黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率的影響試驗(yàn)，以了解無尾兩棲類蝌蚪在不同發(fā)育時(shí)期的代謝特征，也為該物種的適宜養(yǎng)殖條件提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪來自浙江省麗水學(xué)院兩棲爬行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。選用同一天產(chǎn)下的黑斑側(cè)褶蛙卵團(tuán)孵化發(fā)育成的蝌蚪，飼養(yǎng)在室外養(yǎng)殖池中，每天定量投喂專用蝌蚪粉質(zhì)飼料。在體視解剖鏡下，依據(jù)后肢發(fā)育程度，將蝌蚪分為3 個(gè)不同發(fā)育階段：發(fā)育早期（ESD，26～27 期）、發(fā)育中期（MSD，28～32 期）和發(fā)育晚期（LSD，38～40 期）[16]。每次試驗(yàn)前，蝌蚪經(jīng)充分曝氣自來水暫養(yǎng)2 d，試驗(yàn)前12 h禁食，避免攝食代謝對耗氧率產(chǎn)生影響。所有蝌蚪不重復(fù)使用，減少試驗(yàn)誤差。

1.2 靜水法測定溶解氧

試驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮溫度和蝌蚪發(fā)育階段這2 種因素。測試溫度為 20，24，28 和 32 ℃，蝌蚪發(fā)育階段分為早、中和晚，共12 個(gè)試驗(yàn)組合，每個(gè)組合設(shè)置4 個(gè)重復(fù)組。由于處于不同發(fā)育階段的單只黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪體質(zhì)量不同，通過控制蝌蚪數(shù)量，使得不同溫度組的蝌蚪總濕質(zhì)量處于基本相同水平。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，60 只發(fā)育早期、10 只發(fā)育中期和4 只發(fā)育晚期的黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪的總濕質(zhì)量為3.0～3.5 g。

試驗(yàn)開始時(shí)，XMTD-7000 型恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)的水溫設(shè)定后為 20，24，28 或 32 ℃，同時(shí)放入 4 個(gè)裝滿24 h 曝氣后水的1 L 寬口瓶（作為呼吸室）中。待水溫達(dá)到設(shè)定值后，用DO200A 溶氧儀測定每個(gè)呼吸室的初始溶解氧（DO）質(zhì)量濃度，記作DO0。根據(jù)不同發(fā)育階段，將一定數(shù)量的黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪輕輕快速地放入呼吸室中，立即用保鮮膜和橡皮筋進(jìn)行封口，保證外界空氣無法進(jìn)入瓶內(nèi)。在試驗(yàn)進(jìn)行至3 和6 h 時(shí)，依次取下保鮮膜，測定呼吸室內(nèi)的DO質(zhì)量濃度，分別記作DO3h和DO6h。每次測定后重新快速封口。試驗(yàn)過程注意觀察蝌蚪的狀態(tài)。

1.3 蝌蚪濕質(zhì)量和體積測定

測定DO 后，撈出蝌蚪，用紗布輕輕吸取其體表水分。利用量筒差量法測定每組蝌蚪的總體積：先在量筒中倒入一定量的水，記作V1；再將每組蝌蚪倒入量筒，水面上升，記作V2；根據(jù)兩者差值（V2-V1）即可求出每個(gè)試驗(yàn)組蝌蚪的總體積V（±0.01 mL）。用Mettler 分析天平稱取每個(gè)試驗(yàn)組蝌蚪的總濕質(zhì)量 M（±0.001 g）。

1.4 耗氧率的計(jì)算

根據(jù)試驗(yàn)前后呼吸室內(nèi)的水中DO 變化，計(jì)算出不同試驗(yàn)組黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪在3 和6 h 的耗氧率，具體公式如下[17]：

式中：OCR——耗氧率，mg/（g·h）；DO0——初始溶解氧，mg/L；DOx——3 和6 h 時(shí)的溶解氧，mg/L；V——呼吸室的有效體積，即呼吸室體積減去蝌蚪體積，mL；M——蝌蚪總質(zhì)量，g；t——試驗(yàn)時(shí)間，h。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Statistica 統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。在進(jìn)行方差分析之前，檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差同質(zhì)性和正態(tài)性。用雙因素方差分析和Tukey’s 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。對不同溫度組的耗氧率進(jìn)行曲線擬合。描述性統(tǒng)計(jì)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示，顯著性水平α設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

不同試驗(yàn)組黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪形態(tài)特征及呼吸室內(nèi)的DO 質(zhì)量濃度測量值見表1。

表1 不同試驗(yàn)組黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪形態(tài)特征和DO 質(zhì)量濃度測定的描述性統(tǒng)計(jì)

溫度對不同發(fā)育階段黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪3 和6 h耗氧率的影響見表 2、圖 1（a）（b）（c）（d）（e）（f）和圖 2（a）（b）（c）（d）（e）（f）。

圖2 溫度對不同發(fā)育階段黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪6 h 耗氧率的影響

由表2 可見，溫度和發(fā)育階段之間的交互作用也對黑斑側(cè)褶蛙3 和6 h 耗氧率產(chǎn)生顯著影響。

由表2、圖1 和2 可見，溫度對黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪 3 和 6 h 耗氧率的影響顯著（P＜0.05）；32 和 28 ℃耗氧率顯著＞24 ℃，24 ℃耗氧率顯著＞20 ℃。發(fā)育階段對黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪3 和6 h 耗氧率的影響也顯著（P＜0.05），發(fā)育晚期的黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率顯著大于早期和中期。當(dāng)溫度為20～32 ℃時(shí)，發(fā)育早、晚期黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪的3 和6 h 耗氧率，均與溫度之間呈三次函數(shù)擬合回歸關(guān)系，中期呈二次函數(shù)擬合回歸關(guān)系。

表2 溫度和發(fā)育階段對黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率影響的雙因素方差分析結(jié)果①

圖1 溫度對不同發(fā)育階段黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪3 h 耗氧率的影響

3 討論

3.1 溫度對黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率的影響

水生動(dòng)物的耗氧率通常受內(nèi)在因素和外部生態(tài)因子的影響，其中溫度是影響水生動(dòng)物呼吸代謝最重要的生態(tài)因子之一[2，5，18]。研究表明，硬殼蛤的耗氧率隨著試驗(yàn)溫度的升高而升高[19]。付監(jiān)貴等[4]研究發(fā)現(xiàn)，梭鱸幼魚的耗氧率也會隨著溫度的升高而呈上升趨勢。但試驗(yàn)溫度為10～25 ℃時(shí)，淡水蝦夷扇貝和花緣牡蠣的耗氧率呈先上升后下降的趨勢[5，20]。羅輝玉等[21]研究發(fā)現(xiàn)，灰海馬的耗氧率和測試溫度之間也呈相同變化趨勢。在最適溫度以下，浮游動(dòng)物西藏?cái)M溞和中華哲水蚤的耗氧率隨溫度升高而增大，超過最適溫度，其耗氧率卻呈下降趨勢[22-23]。

本研究表明，不同發(fā)育階段黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率與溫度之間的變化趨勢與上述2 種研究結(jié)果類似：發(fā)育早、晚期黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪的耗氧率，均隨溫度的升高呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但發(fā)育中期黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪的耗氧率，則隨溫度的上升呈持續(xù)上升的趨勢。這可能是由于黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪屬于變溫動(dòng)物，其體溫接近于飼養(yǎng)水溫，水溫上升加快了新陳代謝，從而提高耗氧率；而溫度過高時(shí)，蝌蚪體內(nèi)酶活性可能受到抑制，導(dǎo)致物質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，最終引起耗氧率的下降。另有研究[24]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水溫高達(dá)31 ℃時(shí)，墨西哥灣扇貝耗氧率明顯下降，這是由于升溫提高了其蛋白質(zhì)代謝，相應(yīng)降低了碳水化合物及脂肪的代謝，這也可能是32 ℃時(shí)發(fā)育早、晚期黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率下降的原因。發(fā)育中期的黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪，其生長發(fā)育較快，新陳代謝相應(yīng)加快，耗氧量也隨之增加，由此推測其對溫度的適應(yīng)范圍更廣，超出了本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的最高溫度，其原因有待于進(jìn)一步探究。

3.2 發(fā)育階段對黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率的影響

當(dāng)溫度為20～32 ℃時(shí)，發(fā)育晚期黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪的耗氧率顯著大于早、中期，可能與蝌蚪鰓的發(fā)育程度有關(guān)。與魚類等其他水生動(dòng)物相似，鰓是蝌蚪攝取水中溶解氧的重要器官[25]。文獻(xiàn)[2]研究表明，發(fā)育晚期，蝌蚪的呼吸鰓比發(fā)育早、中期更發(fā)達(dá)，攝取水中溶解氧的能力更強(qiáng)，故蝌蚪的載氧率提高。關(guān)于卵形鯧鰹的研究[26]發(fā)現(xiàn)，隨著仔稚魚個(gè)體的不斷長大，鰓小片的表面積變大，鰓的呼吸面積隨之增大，從而提高水流與血液之間的氣體交換，耗氧量不斷增加，故耗氧量隨體質(zhì)量增加而增大。

從發(fā)育角度來看，生活在水中的蝌蚪是無尾類的幼體階段，其耗氧率直接反映了無尾兩棲類水生動(dòng)物幼體階段的新陳代謝狀況與能量需求。蝌蚪的生長發(fā)育過程伴隨著腦、鰓、肝臟等高耗氧器官的逐步完善，從而導(dǎo)致能量需求大大增加，新陳代謝更加旺盛，結(jié)果表現(xiàn)為發(fā)育晚期蝌蚪的耗氧率大幅度上升[27]。這表明了蝌蚪在生長發(fā)育過程中，其代謝特征與發(fā)育過程中的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及生理變化緊密相連。因此，根據(jù)黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪不同發(fā)育階段的耗氧率特點(diǎn)，在蝌蚪飼養(yǎng)后期，一定要提高養(yǎng)殖水體中的溶氧量，否則易造成蝌蚪窒息死亡。耗氧率高低也是代謝水平高低的重要標(biāo)志，在養(yǎng)殖過程中要保證充足的餌料供給，以滿足蝌蚪正常生長發(fā)育的需要。

在一定溫度范圍內(nèi)，耗氧率隨水生動(dòng)物個(gè)體發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)呈逐漸上升趨勢，這一現(xiàn)象也出現(xiàn)在其他水生動(dòng)物養(yǎng)殖過程中。例如，枝角類的發(fā)頭裸腹溞和隆線溞在第一幼齡發(fā)育至第一成齡階段時(shí)，個(gè)體耗氧率相對較小，而由第一成齡發(fā)育至第二成齡階段時(shí)，其生長發(fā)育速度較快，新陳代謝速度相應(yīng)加快，個(gè)體耗氧率顯著增大[1]。河川沙塘鱧在早期發(fā)育過程中耗氧率逐漸上升[28]。已有研究[29]發(fā)現(xiàn)，澳大利亞麥龍蝦的耗氧量與體質(zhì)量成正比。

3.3 試驗(yàn)時(shí)間對黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪耗氧率的影響

目前對水生動(dòng)物耗氧率變化測定的試驗(yàn)時(shí)間不統(tǒng)一，有研究對三角帆蚌[30]、蝦夷扇貝[15]、橄欖蚶[31]、墨西哥灣扇貝測定了 1.5，2，4 和 6 h 耗氧量。本研究顯示，不同溫度和發(fā)育階段下，黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪3 和6 h 耗氧率變化基本保持一致，確定3 h作為后續(xù)研究蝌蚪耗氧率的測定時(shí)間。

綜上所述，當(dāng)飼養(yǎng)水溫為20～28 ℃時(shí)，黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪的耗氧率隨溫度的升高而提高，但當(dāng)水溫達(dá)到32 ℃時(shí)，發(fā)育早、晚期蝌蚪的耗氧率開始下降，而中期蝌蚪的耗氧率繼續(xù)上升。在黑斑蛙養(yǎng)殖過程中，要根據(jù)蝌蚪的發(fā)育階段提供適合的水溫和充足的溶解氧，避免蝌蚪的窒息死亡。