基于兩步頂空進(jìn)樣-GC-MS法分析不同類型煙葉的揮發(fā)性成分

周 妍，李俊杰，吳圣超，戚大偉，費(fèi) 婷，吳 達(dá)，劉百戰(zhàn)

上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，上海市浦東新區(qū)秀浦路3733 號(hào) 201315

煙葉中的揮發(fā)性成分是煙草香氣品質(zhì)形成的主要來(lái)源之一，揮發(fā)性成分組成對(duì)煙草制品的風(fēng)格品質(zhì)具有重要影響，是衡量煙葉內(nèi)在質(zhì)量的重要依據(jù)［1］。煙葉類型包括烤煙、香料煙、白肋煙、晾曬煙和雪茄煙等。受煙葉品種和生態(tài)環(huán)境影響，不同類型煙葉的內(nèi)在質(zhì)量和化學(xué)成分存在很大差異。迄今國(guó)內(nèi)針對(duì)煙葉揮發(fā)性成分的研究主要集中在烤煙、白肋煙和香料煙等［2-9］，雪茄煙葉較少涉及，對(duì)不同類型煙葉揮發(fā)性成分的系統(tǒng)研究和比較也相對(duì)較少。因此，系統(tǒng)剖析包括雪茄煙煙葉在內(nèi)的不同類型煙葉揮發(fā)性成分組成和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異，有助于深化不同類型煙葉感官品質(zhì)形成機(jī)理研究，并可為煙葉的品質(zhì)評(píng)價(jià)、風(fēng)格剖析以及煙草制品的工業(yè)配方設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

煙草中揮發(fā)性化合物種類多樣、成分復(fù)雜，某些重要成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)很低，選擇合適的前處理和分析檢測(cè)方法十分重要。GC-MS法廣泛用于復(fù)雜樣品中揮發(fā)性成分的分離、鑒定和定量檢測(cè)，是煙草中揮發(fā)性物質(zhì)的常用分析方法［10-12］。揮發(fā)性成分常見(jiàn)的提取方法有同時(shí)蒸餾萃?。?3-14］、超臨界流體萃?。?5-16］、頂空固相微萃?。?，9］、吹掃捕集［17］和靜態(tài)頂空［11-12］等。其中，同時(shí)蒸餾萃取法比較耗時(shí)，且易造成低沸點(diǎn)揮發(fā)性成分的損失；超臨界流體萃取法需要高壓設(shè)備，成本較高，不易推廣使用。頂空固相微萃取是目前分析煙草揮發(fā)性成分的主要方法，但其萃取效能受萃取頭極性、樣品頂空平衡溫度的影響很大。文獻(xiàn)［18］報(bào)道，較高的平衡溫度有助于提高固相微萃取方法的靈敏度，但會(huì)降低萃取頭對(duì)揮發(fā)性較強(qiáng)成分的吸附能力，如C5～C9的醛酮類化合物。吹掃捕集法靈敏度高，但穩(wěn)定性稍差。相比之下，靜態(tài)頂空法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好，是定量分析揮發(fā)性成分最常見(jiàn)的方法，但傳統(tǒng)靜態(tài)頂空受進(jìn)樣體積限制，方法靈敏度較低。因此，本研究中將傳統(tǒng)靜態(tài)頂空（Headspace，HS）進(jìn)樣器與程序升溫進(jìn)樣口（Programmed temperature vaporizer，PTV）相結(jié)合，采用自制頂空進(jìn)樣環(huán)（約30 mL）增大進(jìn)樣體積，并采用PTV以避免進(jìn)樣體積大導(dǎo)致的色譜峰展寬。靜態(tài)頂空進(jìn)樣時(shí)，PTV處于溶劑排空模式，揮發(fā)性成分吸附于襯管內(nèi)的Tenax-TA材料上；進(jìn)樣完成后，被吸附劑捕集的揮發(fā)性成分在不分流模式下轉(zhuǎn)移至色譜柱，方法的靈敏度高。以烤煙、雪茄煙、白肋煙、香料煙和曬黃煙5種不同類型煙葉為研究對(duì)象，運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法比較了不同類型煙葉中揮發(fā)性化合物組成的差異。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

烤煙煙葉樣品8個(gè)、雪茄煙煙葉樣品11個(gè)、白肋煙煙葉樣品6 個(gè)、香料煙煙葉樣品6 個(gè)、曬黃煙煙葉樣品4 個(gè)（上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司提供），樣品產(chǎn)地、等級(jí)信息詳見(jiàn)表1。

表1 煙葉樣品信息Tab.1 Information of the tobacco samples

氘代苯乙烯（≥98%，加拿大TRC 公司）；C7～C30正構(gòu)烷烴系列標(biāo)品（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）。

7890B/5975 GC-MS聯(lián)用儀，G7697自動(dòng)頂空進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent 公司）；CIS-4 PTV 進(jìn)樣口（德國(guó)Gerstel公司）；XPR204電子分析天平（感量0.000 1 g，美國(guó)Metler Toledo公司）；A11研磨機(jī)（德國(guó)Ika公司）；篩網(wǎng)（孔徑0.178 mm，紹興上虞圣超儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

煙葉樣品在40 ℃下烘10 h，磨粉后過(guò)孔徑0.178 mm 篩網(wǎng)。稱取0.5 g 煙末于20 mL 頂空瓶中，加入100 μL 內(nèi)標(biāo)溶液（5 μg/mL 氘代苯乙烯甲醇溶液），加蓋后進(jìn)行兩步頂空進(jìn)樣-GC-MS分析。每個(gè)樣品同時(shí)平行檢測(cè)3次。分析條件：

（1）靜態(tài)頂空條件

頂空爐箱溫度：90 ℃；進(jìn)樣環(huán)溫度：120 ℃；進(jìn)樣環(huán)體積：30 mL；傳輸線溫度：200 ℃；頂空瓶平衡時(shí)間：30 min；頂空瓶加壓壓力：206.84 kPa；頂空瓶加壓時(shí)間：0.2 min；頂空進(jìn)樣環(huán)放空壓力：34.47 kPa；頂空進(jìn)樣環(huán)填充時(shí)間：0.1 min；進(jìn)樣環(huán)平衡時(shí)間：0.1 min；進(jìn)樣時(shí)間：5 min。

（2）氣相色譜條件

程序升溫進(jìn)樣口：填有Tenxa-TA填料的PTV襯管；進(jìn)樣口升溫程序溶劑排空模式：排空流速40 mL/min，排空壓力320.68 kPa，保持至5.1 min；7.2 min 打開(kāi)排空，流速100 mL/min；16 min時(shí)排空流速降至20 mL/min。

色譜柱：DB-WAX 毛細(xì)管柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）；載氣：氦氣（≥99.999%）；恒流模式流速：2.0 mL/min；升溫程序（15 min）。

（3）質(zhì)譜條件

離子源：EI；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：240 ℃；質(zhì)量全掃描范圍：35～450 amu。

1.2.2 揮發(fā)性化合物的鑒定

利用質(zhì)譜庫(kù)匹配對(duì)揮發(fā)性化合物進(jìn)行鑒定，對(duì)于NIST質(zhì)譜庫(kù)匹配度大于85%的化合物，計(jì)算其實(shí)驗(yàn)保留指數(shù)，并與NIST質(zhì)譜庫(kù)提供的參考保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)。使用C7～C30系列正構(gòu)烷烴根據(jù)公式（1）計(jì)算實(shí)驗(yàn)保留指數(shù)：

式中，tx為目標(biāo)化合物x的保留時(shí)間，min；tn和tn+1分別是在化合物x 之前和之后洗脫的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，min。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

揮發(fā)性成分峰面積積分所采用的定量離子如表2 所示。揮發(fā)性成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積比經(jīng)對(duì)數(shù)變換和單位方差（Unit variance，UV）標(biāo)度化處理后，采用ChemPattern 軟件（北京科邁恩公司）進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis，PCA）和聚類分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）。

表2 （續(xù)）

表2 （續(xù)）

表2 （續(xù)）

表2 35個(gè)煙葉樣品中鑒定出的揮發(fā)性化合物Tab.2 Volatile compounds identified in 35 tobacco samples

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法優(yōu)化

比較了新的大體積進(jìn)樣方法（進(jìn)樣體積30 mL）與傳統(tǒng)頂空進(jìn)樣方法（進(jìn)樣體積1 mL）靈敏度的差異，結(jié)果如圖1所示。可見(jiàn)，新方法的靈敏度較傳統(tǒng)方法顯著提高，且色譜峰形良好。

圖1 不同進(jìn)樣體積對(duì)應(yīng)的色譜圖Fig.1 Chromatograms from different injection volumes

以5 種不同類型的煙葉粉末樣品充分混合后得到的質(zhì)控樣品（Quality controlling，QC）作為考察對(duì)象，對(duì)方法參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。研究考察了不同樣品質(zhì)量（0.05、0.10、0.25、0.50 g）對(duì)揮發(fā)性化合物檢出數(shù)量及檢測(cè)穩(wěn)定性的影響，分別平行檢測(cè)5次，統(tǒng)計(jì)準(zhǔn)確定性的化合物數(shù)量及峰面積RSD值≤25%的化合物數(shù)量，結(jié)果如圖2所示?？梢?jiàn)，隨著樣品質(zhì)量增加，檢出化合物數(shù)量及穩(wěn)定檢出的化合物數(shù)量均逐步增加，當(dāng)樣品質(zhì)量分別為0.25 和0.50 g 時(shí)，檢出化合物數(shù)量已基本相當(dāng)。當(dāng)樣品質(zhì)量為0.50 g 時(shí)，約97%的檢出化合物的穩(wěn)定性均滿足差異分析要求?？紤]到進(jìn)一步增加樣品質(zhì)量會(huì)導(dǎo)致煙堿嚴(yán)重殘留，最終確定選擇樣品質(zhì)量0.50 g。

圖2 樣品質(zhì)量對(duì)檢出化合物數(shù)量和檢測(cè)穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of sample mass on the numbers of detected volatile compounds and the analysis stability

此外，對(duì)樣品平衡溫度、平衡時(shí)間及PTV 排空流速等影響方法靈敏度及穩(wěn)定性的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示?？梢?jiàn)，升高平衡溫度有助于提升化合物響應(yīng)強(qiáng)度；平衡時(shí)間達(dá)到30 min 后化合物的響應(yīng)強(qiáng)度不再明顯提高；增大PTV 排空流速對(duì)化合物峰面積的影響呈先升高后降低的趨勢(shì)，過(guò)大的排空流速會(huì)造成揮發(fā)性成分損失。因此，最終確定方法參數(shù)為平衡溫度90 ℃、平衡時(shí)間30 min、排空流速40 mL/min。

圖3 樣品平衡溫度（a）、平衡時(shí)間（b）、PTV排空流速（c）對(duì)化合物峰面積的影響Fig.3 Effects of incubation temperature（a），incubation time（b）and PTV vent flow rate（c）on the peak areas of compounds

2.2 揮發(fā)性成分的鑒定及方法穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

共從QC 樣品中鑒定出除烴類化合物外的115種揮發(fā)性成分，還從烤煙中檢出（E，E）-3,5-辛二烯-2-酮、反-2-己烯醛，從雪茄煙中檢出異辛酸、1,2,3-三甲氧基苯，從香料煙中檢出二氫-γ-紫羅蘭酮，及在烤煙、白肋煙和香料煙中檢出巴豆酸，共計(jì)121 種揮發(fā)性化合物。按照化合物的代謝途徑及化學(xué)性質(zhì)可分為脂肪酸降解產(chǎn)物16 種、酯類14 種、有機(jī)酸類11 種、焦糖化反應(yīng)產(chǎn)物14 種、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物15 種、苯丙氨酸降解產(chǎn)物8 種、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物21 種、萜烯類化合物8 種、煙堿相關(guān)化合物6 種，及其他化合物8 種，詳細(xì)信息見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，除9-羥基-4,7-巨豆二烯-3-酮、異瑟模環(huán)烯醇及麥司明外，其他化合物檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于25%，說(shuō)明兩步頂空進(jìn)樣-GC-MS 法穩(wěn)定性良好。

2.3 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

不同類型煙葉中揮發(fā)性化合物的類別相似，但其質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異很大，很難直接明確不同類型煙葉與其揮發(fā)性成分之間的關(guān)系。因此，將峰面積RSD值≤25%的112 種揮發(fā)性化合物的相對(duì)峰面積值作為變量，數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)行PCA 分析和HCA 分析，考察煙葉類型與揮發(fā)性成分間的關(guān)系。

不同類型煙葉樣品，經(jīng)過(guò)主成分分析的系統(tǒng)降維后，選擇第一主成分、第二主成分和第三主成分做PCA 投影（圖4a）。第一主成分、第二主成分和第三主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為22.30%、16.42%和12.90%，3個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為51.62%，說(shuō)明PCA 分析結(jié)果比較理想。雪茄煙、白肋煙、烤煙、香料煙和曬黃煙區(qū)分清晰，表明不同類型煙葉的揮發(fā)性成分存在規(guī)律性差異。

采用平均距離法，以歐氏距離為測(cè)度，對(duì)不同類型煙葉樣品進(jìn)行HCA分析（圖4b）?？梢?jiàn)，36種煙葉樣品可以分成兩大類：第一大類包括香料煙、曬黃煙、白肋煙及烤煙，這4種類型煙葉的揮發(fā)性成分組成更為相似。在第一大類中，香料煙、曬黃煙與白肋煙又可聚為一小類，說(shuō)明香料煙、曬黃煙及白肋煙的揮發(fā)性成分組成與烤煙差異稍大；香料煙與曬黃煙可聚為更小的一類，說(shuō)明香料煙與曬黃煙的揮發(fā)性成分組成相似度最高。第二大類為雪茄煙，雪茄煙單獨(dú)良好聚類，表明雪茄煙的揮發(fā)性成分組成與其他4種類型煙葉有較大的差異。HCA分析結(jié)果說(shuō)明通過(guò)揮發(fā)性成分分析可較好地區(qū)分不同類型煙葉。值得注意的是，HCA 分析中所有平行檢測(cè)樣品均良好聚類，再次說(shuō)明兩步頂空進(jìn)樣-GC-MS法的穩(wěn)定性良好。

圖4 多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Fig.4 Results from multivariate statistical analysis

此外，對(duì)3 個(gè)不同產(chǎn)地的雪茄煙煙葉揮發(fā)性成分組成也進(jìn)行了簡(jiǎn)單分析，主成分分析的投影圖如圖4c 所示。可見(jiàn)，能較好區(qū)分不同產(chǎn)地的雪茄煙煙葉，說(shuō)明不同產(chǎn)地雪茄煙煙葉的揮發(fā)成分組成具有規(guī)律性的差異。

2.4 不同類型煙葉揮發(fā)性成分分析

不同類型煙葉（35個(gè)煙葉樣品）中的112種揮發(fā)性化合物的熱圖如圖5 所示。結(jié)果表明，揮發(fā)性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在不同類型煙葉中的差別很大，但分布有一定規(guī)律：①脂肪酸降解產(chǎn)物?？緹煛顸S煙、香料煙中質(zhì)量分?jǐn)?shù)整體較高，白肋煙和雪茄煙中較低。②酯類化合物。曬黃煙和香料煙中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，白肋煙中次之，烤煙和雪茄煙中整體較低。③有機(jī)酸類化合物。香料煙和白肋煙中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，曬黃煙和烤煙次之，雪茄煙中最少。④焦糖化反應(yīng)產(chǎn)物?？緹?、香料煙和曬黃煙中質(zhì)量分?jǐn)?shù)整體較高，白肋煙與雪茄煙中最低。⑤美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。白肋煙、雪茄煙、香料煙和曬黃煙中質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較高，但不同雪茄煙間差異較大，而烤煙中較低。⑥苯丙氨酸降解產(chǎn)物。白肋煙和香料煙中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，曬黃煙次之，雪茄煙和烤煙中相近。⑦類胡蘿卜素降解產(chǎn)物。香料煙質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高、曬黃煙和白肋煙中次之，不同產(chǎn)地雪茄煙間差異較大。⑧萜烯類化合物。白肋煙和香料煙中較高，曬黃煙、烤煙和雪茄煙中較低。⑨煙堿類化合物。白肋煙和雪茄煙中最高，曬黃煙次之，烤煙和香料煙中較低。

圖5 35個(gè)煙葉樣品揮發(fā)性成分的熱圖Fig.5 Heatmap of the volatile components from 35 tobacco samples

從煙葉類型看，烤煙中脂肪酸降解產(chǎn)物、焦糖化反應(yīng)產(chǎn)物相較其他類型煙葉較高；曬黃煙和香料煙的揮發(fā)性成分組成高度相似，兩類煙葉中各類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較高，但二者中煙堿相關(guān)化合物的差異顯著，香料煙中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低；白肋煙和雪茄煙的揮發(fā)性成分組成中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物及煙堿相關(guān)化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，但白肋煙中有機(jī)酸類及苯丙氨酸降解產(chǎn)物也較高；雪茄煙中大部分類別揮發(fā)性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較低，如脂肪酸降解產(chǎn)物、焦糖化反應(yīng)產(chǎn)物以及酯類和有機(jī)酸類化合物等，但美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和煙堿相關(guān)化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均處于較高水平，這是雪茄煙揮發(fā)性成分組成的顯著特點(diǎn)，可能與雪茄煙煙葉中含氮量非常高有關(guān)。其他類成分中的1,2,3-三甲氧基苯（已被確認(rèn)為普洱茶霉味來(lái)源的關(guān)鍵成分，是普洱茶發(fā)酵過(guò)程中的微生物代謝產(chǎn)物［19］）在雪茄煙中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，其來(lái)源可能與雪茄煙的發(fā)酵工藝有關(guān)。

3 結(jié)論

①相較傳統(tǒng)方法，兩步頂空進(jìn)樣-GC-MS 法具有較高靈敏度，方法穩(wěn)定性也可滿足煙葉揮發(fā)性成分組成分析需求，共檢出121種揮發(fā)性成分；②煙葉揮發(fā)性成分組成與煙葉類型關(guān)系密切，曬黃煙與香料煙揮發(fā)性成分組成最為相似，雪茄煙的組成區(qū)別于其他類型煙葉，具有顯著自身特點(diǎn)；③雪茄煙中大部分揮發(fā)性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較低，但美拉德反應(yīng)產(chǎn)物及煙堿相關(guān)化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)處于較高水平，這是雪茄煙揮發(fā)性成分組成的顯著特點(diǎn)，可能與雪茄煙煙葉中含氮量非常高有關(guān)；④雪茄煙煙葉揮發(fā)性成分組成與其產(chǎn)地有明顯關(guān)系。綜上所述，兩步頂空進(jìn)樣-GC-MS 法簡(jiǎn)便、可靠、靈敏度高，可作為今后煙葉質(zhì)量評(píng)價(jià)、品質(zhì)控制和風(fēng)格特征剖析的重要手段。