生長和烘烤過程中煙葉抗性淀粉含量的變化

段史江，王 佩，曾 宇，彭玉富，賈世偉，張洪映，宋朝鵬，陳小龍*

1.江西省煙草公司吉安市公司，江西省吉安市青原區(qū)青原大道456 號 343009

2.河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，鄭州市金水區(qū)農(nóng)業(yè)路63 號 450002

3.河南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，鄭州市經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)第三大街8 號 450016

淀粉作為煙葉中最主要的碳水化合物，其含量較高［1］。新鮮煙葉淀粉含量為40%左右［2-3］，烤后煙葉中淀粉含量也高達5.5%～8.5%［4-6］。影響煙葉中淀粉含量的因素很多，以往對煙葉中淀粉代謝的研究主要集中在煙草類型、生態(tài)環(huán)境、栽培措施、烘烤調制和貯存陳化等方面［5-7］。通過分析前人的研究結果發(fā)現(xiàn)，調整煙草栽培措施和調制工藝雖然能夠有效提高淀粉降解量，但烤后煙葉淀粉含量仍然偏高。

依據(jù)能否被淀粉酶降解，可將淀粉分為抗性淀粉和非抗性淀粉兩類。能被α-胰腺淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶水解為葡萄糖的淀粉稱為非抗性淀粉，而不能被淀粉酶水解的淀粉被稱為抗性淀粉［8-10］。有研究表明，抗性淀粉主要是淀粉與水通過高溫加熱后經(jīng)冷卻形成，主要成分為分子量較小且分支程度低的直鏈淀粉［11-12］。在抗性淀粉形成過程中，直鏈淀粉分子通過氫鍵結合，形成雙螺旋，再由雙螺旋堆積，形成B 型結晶［13-14］?？剐缘矸酆颗c其他類型淀粉含量密切相關，Englyst 等［15］研究表明，抗性淀粉含量受直鏈淀粉與支鏈淀粉比值的影響，與直鏈淀粉含量關系密切。張文緒等［16］和陳能等［17］研究發(fā)現(xiàn)，直鏈淀粉含量與稻米硬度、黏性和彈性等存在密切關系。目前，有關抗性淀粉含量變化及其與其他類型淀粉含量的相關性研究主要集中在水稻［18］、玉米［19］和香蕉［20］上，在煙草生長發(fā)育和烘烤過程中抗性淀粉含量高低及其與其他類型淀粉含量的相關性研究尚鮮見報道。為此，以云煙87 為試驗材料，研究了生長發(fā)育及烘烤過程中煙葉抗性淀粉含量的變化、淀粉組分與抗性淀粉含量的關系以及淀粉合成相關基因的表達量，旨在為有效降低烤煙淀粉含量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2020—2021年在江西省吉安市永豐縣進行，以烤煙品種云煙87 為試驗材料，3 月15 日移栽，田間管理均按照當?shù)貎?yōu)質煙葉生產(chǎn)技術規(guī)范進行。取上部葉第16～18 葉位（從下往上數(shù)），分別于移栽后20、40、60和80 d時進行取樣（上午9∶00時），所取樣品立即冷凍于液氮中，-80 ℃保存，用于淀粉含量（質量分數(shù)）和基因表達量的測定。采摘煙葉成熟度、部位一致的上部葉，采收煙葉當天烘烤。烘烤過程中，每24 h取樣1次，去除葉脈，于105 ℃下殺青5 min，65 ℃烘干，磨碎，過篩（篩孔0.250 mm），用于淀粉含量（質量分數(shù)）的測定。所有樣品均設置3次生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 抗性淀粉含量的測定

采用K-RSTAR 試劑盒（愛爾蘭Megazyme 公司），按操作說明書測定抗性淀粉含量，每份樣品重復測定3次，取平均值。

1.2.2 直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的測定

采用雙波比色法測定直鏈淀粉和支鏈淀粉含量［21］，其中直鏈淀粉的測定波長為627.5 nm，參比波長為458.0 nm；支鏈淀粉的測定波長為545.5 nm，參比波長為734.6 nm。其中每份樣品重復測定3次，取平均值。

1.2.3 基因表達分析

在NCBI的Gene數(shù)據(jù)庫（NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中檢索煙草淀粉合成相關基因［22-23］，獲得普通煙草AGPS1、AGPS2、AGPS3、ADGPL、GBSS、SS1、SS2、SS3、SBE1、SBE2、SBE3、ISA1、ISA2 和ISA3基因的編碼序列，這些基因在淀粉生物合成途徑中的位置見圖1。利用Primer 5.0軟件在基因保守區(qū)域設計qRT-PCR引物，見表1。

表1 qRT-PCR擴增引物Tab.1 Amplification primers for qRT-PCR

圖1 植物淀粉生物合成路徑Fig.1 Biosynthesis pathway of plant starch

采用Trizol 法提取煙葉總RNA，用M-MLV Reverse Transcriptase 反轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）合成單鏈cDNA。以cDNA 作為模板，按照SYBR Green試劑盒（美國Invitrogen公司）操作說明配制反應體系，采用ABI PRISM 7000熒光定量PCR儀進行擴增反應。PCR程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循環(huán)；溶解曲線為：95 ℃15 s，60 ℃15 s，20 min內升至95 ℃，95 ℃15 s。內參基因為煙草核糖體蛋白基因L25。采用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量［24］，所有樣品均設置3次生物學重復。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)的方差分析（單因素ANOVA）和相關分析，采用LSD 法進行數(shù)據(jù)間差異的顯著性檢驗；采用Origin 2018軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 不同生育期和烤后煙葉中抗性淀粉含量的比較

對不同生長發(fā)育時期煙葉和烤后煙葉中的抗性淀粉和總淀粉含量進行檢測。結果（圖2）發(fā)現(xiàn)，抗性淀粉在煙苗移栽20 d 后開始積累，隨著生育期的推進抗性淀粉含量逐漸增加，成熟期淀粉含量達到最高。移栽后20～40 d煙葉中抗性淀粉積累量較低，僅為0.38%；隨著葉片的生長發(fā)育，煙葉中抗性淀粉和總淀粉大量積累，移栽后60～80 d是煙葉中抗性淀粉積累的主要時期，移栽后60 d 和移栽后80 d 煙葉中抗性淀粉含量差異達到極顯著水平（P＜0.01），此時抗性淀粉含量達到6.89%，總淀粉含量為27.48%。煙葉經(jīng)過烘烤，抗性淀粉大量降解，烤后煙葉抗性淀粉含量為2.48%，總淀粉含量為7.93%，表明烤后煙葉中存在抗性淀粉，且約占總淀粉含量的1/3。

圖2 不同生育期和烤后煙葉中抗性淀粉含量比較Fig.2 Contents of resistant starch in tobacco leaves at different growth stages and cured tobacco leaves

2.2 煙葉直鏈淀粉和抗性淀粉的關系

不同生長發(fā)育時期煙葉中抗性淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的變化見表2。由表2可見，在煙葉發(fā)育過程中煙葉抗性淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量均呈增加趨勢，其中支鏈淀粉逐漸積累直至煙葉成熟，而抗性淀粉和直鏈淀粉積累時期主要集中在煙葉生長發(fā)育的中后期（移栽后60～80 d）。

表2 煙葉生長發(fā)育過程中抗性淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的比較Tab.2 Contents of resistant starch，amylose and amylopectin in tobacco leaves during growth and development

2.3 淀粉合成基因的表達分析

對不同生長發(fā)育時期煙葉中淀粉合成相關基因的表達量比較（圖3）發(fā)現(xiàn)，AGPS1、SS3和ISA1在煙葉生長發(fā)育的各個時期表達量無明顯變化；AGPS2、AGPS3、AGPL、SS2、SBE1 和ISA3 的表達量在煙葉生長發(fā)育過程中持續(xù)增加，在移栽后80 d 達到峰值；SS1 和ISA2 的表達量在煙葉生長發(fā)育過程中持續(xù)增加，在移栽后60 d 煙葉中基因表達量最高，隨后SS1和ISA2的表達量下降；GBSS和SBE2的表達量在煙葉生長發(fā)育前期基本穩(wěn)定在較低水平，在移栽后60 d煙葉中這兩個基因的表達量突然增加，GBSS和SBE2的表達量在成熟期達到峰值。可見，煙葉生長發(fā)育過程中GBSS和SBE2兩個基因的表達量變化趨勢與直鏈淀粉和抗性淀粉的變化趨勢一致（表2），GBSS1和SBE2可能是調控直鏈淀粉和抗性淀粉含量的關鍵基因。

圖3 不同生育期煙葉中淀粉合成基因的表達量Fig.3 Expression levels of starch synthesis-related genes in tobacco leaves at different growth stages

2.4 烘烤過程中抗性淀粉和非抗性淀粉的降解規(guī)律

隨著烘烤時間的推進，煙葉中抗性淀粉和非抗性淀粉含量均持續(xù)下降，不同烘烤階段淀粉降解速率依次為變黃期＞定色期＞干筋期（圖4）。在變黃期（0 ～72 h），抗性淀粉和非抗性淀粉快速降解，其中，變黃前期（0 ～24 h）淀粉降解最快。從定色中期（96 h）開始，抗性淀粉和非抗性淀粉含量無顯著變化。烘烤前煙葉中總淀粉、抗性淀粉和非抗性淀粉含量分別為23.68%、6.30%和17.38%，烘烤結束后煙葉中總淀粉、抗性淀粉以及非抗性淀粉含量分別為7.93%、2.48%和5.45%。經(jīng)過烘烤的煙葉總淀粉、抗性淀粉以及非抗性淀粉降解率分別為66.51%、60.63%和68.64%?？梢?，烘烤過程中變黃期是抗性淀粉和非抗性淀粉降解的主要時期，其中非抗性淀粉的降解量較高，抗性淀粉的降解量相對較低，說明抗性淀粉在烘烤過程中不容易降解。

圖4 烘烤過程中抗性淀粉和非抗性淀粉的含量變化Fig.4 Variations of resistant starch and non-resistant starch contents during curing

2.5 抗性淀粉與直鏈淀粉的相關性

煙葉生長發(fā)育及烘烤過程中的抗性淀粉含量和直鏈淀粉含量的相關性分析結果見表3。表3顯示，在生長發(fā)育過程中煙葉抗性淀粉含量與直鏈淀粉含量呈極顯著正相關（r=0.992**，P＜0.01），抗性淀粉含量和直鏈淀粉與支鏈淀粉的比值間相關性不顯著；烘烤過程中煙葉抗性淀粉含量與直鏈淀粉含量呈顯著正相關（r=0.918*，P＜0.05），抗性淀粉含量和直鏈淀粉與支鏈淀粉的比值間相關性不顯著。

表3 煙葉抗性淀粉與直鏈淀粉含量間的相關性①Tab.3 Correlation between resistant starch and amylose contents in tobacco leaves

3 討論

本研究中發(fā)現(xiàn)，隨煙葉生長發(fā)育過程的推進淀粉含量持續(xù)積累，在煙葉成熟期達到峰值。抗性淀粉和直鏈淀粉的積累時期主要集中在煙葉生長發(fā)育的中后期，這與水稻在發(fā)育后期抗性淀粉含量達到峰值的研究結果基本一致［25-26］，可能原因是隨著作物的生長發(fā)育，光合能力增強，碳代謝也隨之增強，從而在作物生育后期合成大量的淀粉類物質，這與孫建國［27］的研究結果一致。

本研究中還發(fā)現(xiàn)，煙葉在生長發(fā)育過程中可產(chǎn)生并不斷積累抗性淀粉，煙苗移栽后60 d 內是抗性淀粉積累的主要時期，該時期煙葉中的直鏈淀粉含量也迅速增加。通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，煙葉生長發(fā)育期間抗性淀粉含量與直鏈淀粉含量呈極顯著正相關，這與劉素君等［28］的研究結果一致。

作物中淀粉合成涉及一系列酶的催化作用。參與淀粉合成的主要酶類有ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉合成酶（SS）、顆粒結合型淀粉合酶（GBSS）、溶性淀粉合酶（SSS）和淀粉分支酶（SBE）等。其中GBSS 酶通常參與直鏈淀粉合成，SS 酶催化支鏈淀粉合成。同時支鏈淀粉的形成還需要SBE和異淀粉酶（ISA）等酶類對分支結構進一步修飾［29］。本研究中對不同發(fā)育時期煙葉淀粉合成相關基因的表達量分析發(fā)現(xiàn)，GBSS 和SBE2 兩個基因在煙葉生長發(fā)育過程中表達量變化趨勢與直鏈淀粉和抗性淀粉含量的變化趨勢相同。因此，可以通過生物技術手段調控直鏈淀粉合成關鍵基因GBSS 和支鏈淀粉合成關鍵基因SBE2的表達量，從而降低煙葉中直鏈淀粉和抗性淀粉含量。

4 結論

煙葉生長發(fā)育的中后期是抗性淀粉積累的主要時期?？竞鬅熑~中抗性淀粉含量占總淀粉含量的1/3左右。在烘烤過程中，煙葉變黃期是抗性淀粉和非抗性淀粉降解的主要時期，其中非抗性淀粉的降解量較高，抗性淀粉的降解量較低，說明抗性淀粉在烘烤過程中不易降解。煙葉中抗性淀粉含量與直鏈淀粉含量呈極顯著正相關。GBSS1 和SBE2 可能是調控直鏈淀粉和抗性淀粉含量的關鍵基因。