石見穿配方顆粒的特征圖譜和含量測(cè)定

陳日榮 歐陽(yáng)麗敏 楊佩雯 吳 弢

上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 201203

石見穿為唇形科植物華鼠尾草Salvia chinensisBenth.的干燥地上部分，始載于《本草綱目》，“主骨痛，大風(fēng)，癰腫”[1]。石見穿曾收錄于《中華人民共和國(guó)藥典》（1977年版），具有清熱解毒、活血利氣、止痛的功效，用于脘脅脹痛、癰腫等，此后歷版《中華人民共和國(guó)藥典》均未收錄。現(xiàn)代藥理研究表明，石見穿具有調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞[2-3]和抗肝癌[4-5]等作用，臨床上多應(yīng)用于婦科疾病、癌癥以及肝炎等的治療。其化學(xué)成分研究表明，石見穿含有迷迭香酸、熊果酸、齊墩果酸等化合物[6-7]。在質(zhì)量控制研究方面，文獻(xiàn)報(bào)道有采用薄層光密度法測(cè)定其齊墩果酸的含量[8]，或用HPLC測(cè)定齊墩果酸和熊果酸的含量[9]，也有以迷迭香酸為指標(biāo)建立石見穿藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[10-11]。大量研究表明迷迭香酸具有抗炎[12-13]、神經(jīng)性保護(hù)[14]和抗神經(jīng)痛等作用[15]，由此推測(cè)迷迭香酸的藥理作用與石見穿清熱解毒和活血止痛功效相關(guān)。中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)提取濃縮制成的、供中醫(yī)臨床配方用的顆粒[16]。本研究以迷迭香酸為指標(biāo)，對(duì)石見穿配方顆粒進(jìn)行含量測(cè)定及其特征圖譜進(jìn)行研究，為石見穿配方顆粒的質(zhì)量控制和臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；AE200S型萬分之一電子分析天平（上海梅特勒一托利多儀器有限公司）；BT25S型十萬分之一電子分析天平（北京塞多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KH-500E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

丹參素（批號(hào)：wkq18061906）、原兒茶醛（批號(hào)：TO1013FB14）、咖啡酸（批號(hào)：B21243）、迷迭香酸（批號(hào)：Y16A9K6740），均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，含量均≥98%；石見穿配方顆粒由某醫(yī)藥公司送樣。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

OSAKA SODA CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.0 μm）；柱溫25℃；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液。梯度洗脫：0～10 min，5→20%A；10～22 min，20→23%A。進(jìn)樣量5 μl；流速1.0 ml/min；特征圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；含量測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取迷迭香酸、丹參素、原兒茶醛及咖啡酸對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加入甲醇制成1 mg/ml的迷迭香酸對(duì)照品溶液，和含丹參素0.20 mg/ml，原兒茶醛、咖啡酸及迷迭香酸均為0.05 mg/ml的參照物混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取石見穿配方顆粒0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入35%乙醇25 ml，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，用35%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.4 石見穿配方顆粒特征峰的標(biāo)定

吸取混合溶液與供試品溶液各5 μl，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，色譜圖見圖1。根據(jù)對(duì)照供試品和參照物色譜圖的保留時(shí)間，可以確認(rèn)峰1（5.926 min）、峰3（8.937 min）、峰4（10.927 min）、峰5（19.335 min）分別為丹參素、原兒茶醛、咖啡酸和迷迭香酸。

圖1 石見穿配方顆粒的HPLC特征圖譜（240 nm）

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)制備陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明輔料對(duì)特征圖譜無影響，方法專屬性良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取石見穿配方顆粒S1，按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，RSD均小于1.83%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取石見穿配方顆粒S1，按“2.3”項(xiàng)制備6份樣品，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，RSD均小于1.69%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別于0、4、8、12、24、36、48和72 h連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，RSD均小于1.61%，表明方法穩(wěn)定性良好。

2.6 石見穿配方顆粒特征圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定13批石見穿配方顆粒，將色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》，采用全譜峰匹配，建立對(duì)照特征圖譜R，見圖2。計(jì)算相似度，10批石見穿配方顆粒S1～S10色譜圖與對(duì)照?qǐng)D譜R的相似度均在0.90以上，表明其生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)量均一性較好；而不同廠家的石見穿配方顆粒樣品G1～G3的特征圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜R的相似度均在0.90以下，表明不同廠家生產(chǎn)的該配方顆粒在特征成分的種類和含量有明顯的區(qū)別。

圖2 13批石見穿配方顆粒的HPLC疊加特征圖譜

2.7 迷迭香酸的含量測(cè)定

分別精密吸取迷迭香酸對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 μl，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，其色譜圖見圖3。結(jié)果顯示，樣品溶液中的峰1即為迷迭香酸。

圖3 迷迭香酸對(duì)照品（A）和石見穿配方顆粒樣品S1（B）的HPLC色譜圖（330 nm）

2.8 迷迭香酸含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.8.1 線性關(guān)系考察 取迷迭香酸對(duì)照品適量，精密稱定，加入35%乙醇，搖勻，配制成迷迭香酸1 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。吸取不同體積的對(duì)照品儲(chǔ)備液，用35%乙醇稀釋制成不同濃度的系列溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以對(duì)照品的濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，建立回歸方程：y=15539x+1.3366，r2=0.9998，線性范圍為0.0035～0.0420 mg/ml。

2.8.2 精密度試驗(yàn) 吸取對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定迷迭香酸的峰面積，RSD為0.51%，表明儀器精密度良好。

2.8.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取石見穿配方顆粒樣品S1，按“2.3”項(xiàng)平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果表明RSD為0.71%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別于0、4、8、12、24、36、48和72 h分別進(jìn)樣3次，結(jié)果表明RSD為0.89%，供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的石見穿配方顆粒樣品S1 0.25 g，共9份，其中每三份分別按照已知含量的50%、100%、150%加入對(duì)應(yīng)迷迭香酸（0.992 mg/ml）對(duì)照品溶液，平行制備9份樣品，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積，計(jì)算回收率（表1），結(jié)果表明平均加樣回收率為100.87%，RSD為0.58%。

表1 迷迭香酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.9 13批石見穿配方顆粒的含量測(cè)定

按照上面所建立的HPLC方法，對(duì)13批石見穿配方顆粒中迷迭香酸的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表2。其中10批石見穿配方顆粒樣品S1～S10中迷迭香酸的含量范圍為0.67～0.81 mg/g，均值為0.77 mg/g，按照含量均數(shù)±30%計(jì)算其含量波動(dòng)范圍。因此，擬定每1克石見穿配方顆粒中迷迭香酸的含量范圍為0.54～1.00 mg。而三批不同廠家的樣品G1～G3中迷迭香酸的含量差異較大，這與前面特征圖譜相似度研究的結(jié)果一致，其范圍為0.33～2.46 mg/g。

表2 石見穿配方顆粒中迷迭香酸的含量測(cè)定結(jié)果（n=3，mg/g，±s）

表2 石見穿配方顆粒中迷迭香酸的含量測(cè)定結(jié)果（n=3，mg/g，±s）

編號(hào) 迷迭香酸含量 編號(hào) 迷迭香酸含量S1 0.81±0.01 S8 0.78±0.01 S2 0.67±0.01 S9 0.77±0.02 S3 0.81±0.02 S10 0.78±0.01 S4 0.79±0.01 G1 1.80±0.01 S5 0.78±0.02 G2 0.33±0.03 S6 0.73±0.03 G3 2.46±0.03 S7 0.78±0.01

3 討論

在制備供試品溶液時(shí)，對(duì)提取溶劑和提取時(shí)間進(jìn)行了考察，比較了不同體積甲醇和乙醇及不同超聲時(shí)間對(duì)特征圖譜的影響，結(jié)果表明以35%乙醇超聲30 min提取的樣品，峰容量較大，各峰對(duì)稱性較好，分離度較合適。

在建立特征圖譜時(shí)，首先根據(jù)流動(dòng)相的組成進(jìn)行了優(yōu)化。石見穿的主要成分為迷迭香酸、丹參素、原兒茶醛等[17]，因此嘗試流動(dòng)相組成中含有0.1%三氟乙酸、0.1%甲酸溶液、0.1%醋酸水等改善峰對(duì)稱性[18-21]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用乙腈-0.1%甲酸溶液的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，分離效果好，且峰分布均勻。

由于迷迭香酸的藥理作用與石見穿清熱解毒和活血止痛功效相關(guān)，故選其作為含量測(cè)定的指標(biāo)。迷迭香酸的檢測(cè)波長(zhǎng)[22-23]有320、325 nm等，本研究比較280、320、330、360 nm多個(gè)波長(zhǎng)，結(jié)合峰形和分離度結(jié)果，選擇330 nm為含量測(cè)定的最終檢測(cè)波長(zhǎng)。

丹參素的最大吸收波長(zhǎng)為280 nm，300 nm之后無紫外吸收。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm時(shí)，丹參素?zé)o法檢測(cè)；保留時(shí)間9.351 min（最大吸收波長(zhǎng)為326 nm）的峰干擾峰3原兒茶醛（Rt=9.104 min）。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm時(shí)，雜質(zhì)峰在240 nm只有微弱的紫外吸收，峰3原兒茶醛（最大吸收波長(zhǎng)為230 nm）有較好吸收，干擾峰的吸收減弱；丹參素（峰1）能夠被檢測(cè)；同時(shí)特征圖譜的五個(gè)峰分離效果好，且峰分布均勻，故選擇240 nm為特征圖譜的最終檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究建立了含丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸的特征圖譜，揭示石見穿更多的共有峰成分，為進(jìn)一步研究石見穿的成分提供了科學(xué)依據(jù)。由于經(jīng)過提取濃縮等工藝，配方顆粒已無原有藥材飲片的性狀特征，加上中藥產(chǎn)地和生產(chǎn)工藝等原因，使得中藥配方顆粒的質(zhì)量控制成為難點(diǎn)。所以質(zhì)控指標(biāo)仍選擇迷迭香酸，多個(gè)成分的含量測(cè)定需要進(jìn)一步的研究。