葡甘露聚糖凝膠對(duì)大鼠混合感染性陰道炎模型的作用研究

高 喬 張潤(rùn)濤 劉 聰 李 佳 節(jié)笑笑 倪 艷 康 永▲ 楊黎彬 韓文霞李偉澤

1.山西省中醫(yī)藥研究院，山西太原 030012；2.江蘇微納醫(yī)藥科技有限公司，江蘇揚(yáng)中 212218

陰道炎是陰道發(fā)生炎癥后導(dǎo)致外陰出現(xiàn)瘙癢、灼痛、異味、刺激和異常分泌物的一類病癥，其常見(jiàn)的類型有霉菌性陰道炎、細(xì)菌性陰道炎、萎縮性陰道炎（老年性陰道炎）以及滴蟲(chóng)性陰道炎[1]。陰道炎的發(fā)生多為陰道加德納菌（gardnerella vaginalis，GV）為主的厭氧菌增殖狀態(tài)異常，并伴隨陰道微環(huán)境中優(yōu)勢(shì)桿菌如乳桿菌的減少，從而引起陰道菌群構(gòu)成發(fā)生改變[2]。研究調(diào)查資料顯示，陰道炎的發(fā)生率為20%～60%，該病對(duì)女性的日常生活和心理有很大的負(fù)面影響，得病后易表現(xiàn)出焦慮、羞愧以及對(duì)個(gè)人衛(wèi)生等癥狀反復(fù)出現(xiàn)的擔(dān)憂[3]。臨床上治療陰道炎多以口服加外用甲硝唑等抗生素為主，外用抗生素類藥物在治療過(guò)程中容易引起陰道微生態(tài)紊亂的情況[4]。

葡甘露聚糖凝膠[5]（專利號(hào)：ZL202010787982.9）是一種由中藥積雪草、白及、蛇床子提取物制成，為治療婦科炎癥而正在研制的復(fù)方中藥新藥，具有黏附性高且作用持久的優(yōu)點(diǎn)，本研究通過(guò)建立混合感染性陰道炎模型，來(lái)研究該藥物治療陰道炎的效果。

1 材料與方法

1.1 藥物及菌株

葡甘露聚糖凝膠[5]（江蘇微納醫(yī)藥科技有限公司提供，批號(hào)：20201109）；空白凝膠基質(zhì)（江蘇微納醫(yī)藥科技有限公司提供，批號(hào)：20201109）；復(fù)方甲硝唑陰道栓（河北金牛原大藥業(yè)科技有限公司，批號(hào)：09200912）；苯甲酸雌二醇（上海全宇生物科技動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：201203）；氫化可的松（上海上藥信誼藥廠有限公司，批號(hào)：019200301）；金黃色葡萄球菌（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號(hào)：21031627）；大腸桿菌（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號(hào)：20122915）；白色念珠菌（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號(hào)：20120208）。

1.2 動(dòng)物

健 康SD（sqrague dawley）大 鼠，SFP級(jí)，雌性，體重170～190 g，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0005，批號(hào)：No.111251210100065347。

1.3 試劑

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）試 劑 盒（Bio-Swamp，批 號(hào)：No.202104）；白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（Bio-Swamp，批號(hào)：No.202104）；白介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（Bio-Swamp，批號(hào)：No.202104）；白介素-8（interleukin-8，IL-8）ELISA試劑盒（Bio-Swamp，批號(hào)：No.20215）；表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）ELISA試劑盒（Bio-Swamp，批號(hào)：No.202104）。

1.4 儀器

C5微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)伯騰）；LEICA RM2125石蠟切片機(jī)（萊卡上海分公司）；PM.10AD光學(xué)顯微鏡（日本Olympus）；KDC-2046低速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；KP-XW80旋渦混合儀Vortex（凱普生物科技有限公司）；Microfuge 20R離心機(jī)（BECKMAN COULTER）。

1.5 倫理

本研究所用動(dòng)物及相關(guān)處置符合動(dòng)物倫理的要求，實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前已經(jīng)過(guò)本機(jī)構(gòu)動(dòng)物倫理委員會(huì)的倫理審查，倫理審查編號(hào)：CIRP-IACUC-（G）2022072。

1.6 方法

1.6.1 動(dòng)物分組及模型[6]建立 菌株常規(guī)培養(yǎng)、傳代后，進(jìn)行菌液的制備，菌液濃度調(diào)整至2×108CFU/ml，將三種菌液按1∶1∶1比例進(jìn)行混合備用。

將70只雌性SD大鼠進(jìn)行為期一周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，采用隨機(jī)數(shù)表法將70只大鼠分為空白組（10只）和給藥組（60只），將給藥組大鼠進(jìn)行混合感染性陰道炎模型的建立。造模大鼠進(jìn)行皮下注射苯甲酸雌二醇注射液2 mg/kg，2 d/次，連續(xù)3次，使大鼠出現(xiàn)假動(dòng)情期。次日開(kāi)始每只大鼠皮下注射氫化可的松注射液60 mg/kg，每日1次，連續(xù)3 d，復(fù)制大鼠免疫功能低下模型。之后將已制備好的金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌菌懸液按照1∶1∶1混合，用1 ml注射器接灌胃針，吸取菌懸液0.2 ml/只注入造模大鼠陰道內(nèi)，隔日一次，共3次，注入后在陰道口塞入棉球防止菌液流出。第3次感染24 h后，用無(wú)菌棉簽沾取陰道分泌物分別涂于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿和沙氏葡萄糖瓊脂平皿表面，常規(guī)培養(yǎng)24 h后平板上肉眼觀察可見(jiàn)大小不等的細(xì)菌菌落，即證明感染成功。造模結(jié)束后，將造模成功的60只大鼠使用隨機(jī)數(shù)表法分為模型組、復(fù)方甲硝唑組、凝膠基質(zhì)組、葡甘露聚糖凝膠高、中、低劑量組，每組各10只雌鼠。

1.6.2 動(dòng)物給藥 造模結(jié)束后開(kāi)始陰道內(nèi)灌注給藥，復(fù)方甲硝唑組給予復(fù)方甲硝唑陰道栓0.4 g/kg，葡甘露聚糖凝膠高、中、低劑量組給予1.2、0.6、0.3 g/kg，凝膠基質(zhì)組給予中劑量同體積量葡甘露聚糖凝膠基質(zhì)，空白組給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥1周。

1.6.3 大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、EGFR含量檢測(cè) 末次給藥結(jié)束后，禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液對(duì)各組大鼠進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血至EP管中，置于室溫放置2 h后，3000 r/min離心20 min，取上清后，制備血清，-20℃保存。ELISA法通過(guò)微孔板檢測(cè)儀測(cè)定大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、EGFR的含量。

1.6.4 大鼠陰道黏膜組織病理學(xué)變化 取宮頸組織，立刻置于10%的福爾馬林中固定，石蠟包埋，進(jìn)行橫切面切片，HE染色，200、40倍光鏡觀察宮頸組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算并分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩分別比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜ 0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量比較

模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8大于空白組大鼠，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）；給藥后，葡甘露聚糖凝膠各劑量組、復(fù)方甲硝唑組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8均小于模型組大鼠，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）；凝膠基質(zhì)組與模型組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；葡甘露聚糖凝膠高劑量組與中劑量組血清中TNF-α、IL-6、IL-8小于復(fù)方甲硝唑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量比較（pg/ml，±s）

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量比較（pg/ml，±s）

注 與空白組比較，aP＜ 0.01；與模型組比較，bP＜ 0.01；與復(fù)方甲硝唑組比較，cP＜ 0.05，dP＜ 0.01；TNF-α：淋巴毒素；IL-1β：白介素-1β；IL-6：白介素-6；IL-8：白介素-8

組別 n 劑量（g/kg） TNF-α IL-1β IL-6 IL-8空白組 10 110.01±6.43 13.89±1.05 33.24±2.99 157.69±16.78模型組 10 169.80±7.50a 65.81±3.70a 84.59±3.64a 256.44±8.59a復(fù)方甲硝唑組 10 0.4 136.80±10.44b 39.68±7.32b 55.42±4.18b 198.04±9.10b葡甘露聚糖凝膠10 1.2 125.25±2.44bc 29.59±2.53b 41.31±2.82bd 171.24±5.32bd 10 0.6 128.88±6.58bc 37.16±3.37b 46.60±4.79bc 180.75±16.66bc 10 0.3 140.28±6.87b 50.77±1.84b 60.22±6.42b 199.29±3.22b凝膠基質(zhì)組 10 161.02±9.83 67.71±2.36 81.31±5.71 246.72±15.78 F值 45.028 166.457 110.654 58.237 P值 0.002 0.003 0.005 0.006

2.2 各組大鼠血清中EGFR含量比較

模型組血清中EGFR含量明顯小于空白組大鼠，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）；給藥后，葡甘露聚糖凝膠各劑量組、復(fù)方甲硝唑組大鼠血清中EGFR含量均大于模型組大鼠，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）；凝膠基質(zhì)組與模型組血清中EGFR含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；葡甘露聚糖凝膠高劑量組及中劑量組血清中EGFR含量大于復(fù)方甲硝唑組大鼠，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中EGFR含量比較（ng/ml，±s）

表2 各組大鼠血清中EGFR含量比較（ng/ml，±s）

注 與空白組比較，aP ＜ 0.01；與模型組比較，bP＜ 0.01；與復(fù)方甲硝唑組比較，dP＜ 0.01；EGFR：表皮生長(zhǎng)因子

組別 n 劑量（g/kg） EGFR空白組 10 3.35±0.16模型組 10 1.53±0.08a復(fù)方甲硝唑組 10 0.4 2.50±0.19b葡甘露聚糖凝膠 10 1.2 3.01±0.12bd 10 0.6 2.88±0.05bd 10 0.3 2.57±0.07b凝膠基質(zhì)組 10 1.66±0.15 F值 177.563 P值 0.005

2.3 各組混合感染性陰道炎模型大鼠陰道黏膜組織病理形態(tài)學(xué)

光鏡（40、200倍）下大鼠混合感染性陰道炎模型陰道黏膜組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)檢查：空白組陰道被覆鱗狀上皮，上皮細(xì)胞排列緊密，形態(tài)正常，腸腔可見(jiàn)大量壞死細(xì)胞碎屑，考慮為陰道上皮周期性變化的產(chǎn)物，非病變所致，固有層膠原豐富，排列緊密，見(jiàn)極少量炎性散在浸潤(rùn)。模型組陰道被覆鱗狀上皮，上皮細(xì)胞排列緊密，上皮可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞，為陰道上皮周期性變化中的正?，F(xiàn)象，固有層水腫，結(jié)締組織排列疏松，伴較多炎性細(xì)胞散在浸潤(rùn)，與空白組比較，炎癥反應(yīng)明顯加重。葡甘露聚糖凝膠高、中劑量組陰道被覆鱗狀上皮，上皮細(xì)胞排列緊密，上皮可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞，為陰道上皮周期性變化中的正?，F(xiàn)象，固有層膠原豐富，排列緊密，見(jiàn)極少量炎性散在浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1～2。

圖1 各組混合感染性陰道炎模型大鼠陰道黏膜組織病理形態(tài)學(xué)（HE染色，200×）

圖2 各組大鼠陰道黏膜組織病理形態(tài)學(xué)（HE染色，40×）

3 討論

在健康的育齡女性中，典型的陰道微生物區(qū)系包括需氧菌群、兼性厭氧菌和專性厭氧菌，大多數(shù)女性的陰道微生物群以乳酸菌為主[7]。在很多情況下，陰道感染的局部治療與口服治療相比效果相當(dāng)甚至效果更好，局部給藥后藥物作用更為直接且濃度更高，藥物相互作用更少，副作用更少。此外，微生物對(duì)抗生素藥物耐藥性的出現(xiàn)、控制感染復(fù)發(fā)的困難以及傳統(tǒng)劑型存在陰道滯留率低和不適的問(wèn)題支持了對(duì)更有效的局部治療的需要[8]。陰道炎是一種陰道黏膜和黏膜下結(jié)締組織的炎癥，陰道炎患者的陰道微生物區(qū)系以一些需氧細(xì)菌為主，如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌[9]。陰道炎可能發(fā)展到子宮深部感染，嚴(yán)重者可導(dǎo)致孕婦早產(chǎn)[10]。陰道炎相關(guān)的致病細(xì)菌已被證明通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)免疫激活，并增加促炎細(xì)胞因子的水平，從而導(dǎo)致生殖道黏膜炎癥[11-12]。在EGFR基因缺失的小鼠中，小鼠傷口表現(xiàn)出異常強(qiáng)烈和彌漫性的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，這表明EGFR在慢性炎癥性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。

雖然在臨床上常使用抗菌藥物治療，但目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的治療方法[14]。然而，頻繁和長(zhǎng)時(shí)間使用廣譜抗生素可能會(huì)導(dǎo)致諸多更為嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如陰道菌群失調(diào)、繼發(fā)感染和耐藥性[15]。陰道炎屬于中醫(yī)“帶下病”范疇，《傅青主女科》曰：“夫帶下俱是濕癥”，因此帶下病的病因以濕邪為主，治法宜清熱利濕泄?jié)醄16-20]。葡甘露聚糖凝膠是一種由中藥積雪草、白及、蛇床子提取物制成，為治療婦科炎癥而正在進(jìn)行研制的復(fù)方中藥新藥，其中積雪草清熱利濕、解毒消腫，白及收斂止血、消腫生肌，蛇床子燥濕祛風(fēng)、殺蟲(chóng)止癢，全方共行祛腐生肌，消腫止痛，殺蟲(chóng)止癢的功效[5]。本研究通過(guò)使用大腸桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌建立大鼠混合感染性陰道炎模型，用ELIAS法檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8以及EGFR含量的變化，結(jié)果顯示葡甘露聚糖凝膠可明顯降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的含量、升高EGFR的含量，結(jié)合病理檢測(cè)結(jié)果，表明葡甘露聚糖凝膠在局部治療陰道炎后可明顯減輕炎癥反應(yīng)，具有良好的治療效果和臨床推廣價(jià)值。