基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接探討補(bǔ)陽還五湯治療冠心病的作用機(jī)制

李苓頊 王 敏 劉建勛 簡 潔 孫桂波▲

1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林 541199；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100094；3.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary atherosclerotic heart disease，CHD）簡稱冠心病，是我國最常見的心血管疾病之一[1]。目前，盡管經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)（percutaneous coronary intervention，PCI）、外科搭橋等治療手段已取得一定進(jìn)展，但仍存在藥物抵抗及術(shù)后胸悶、胸痛等臨床難題。中藥復(fù)方因其副作用小、患者依從性高等優(yōu)勢，受到廣泛關(guān)注[2-4]。

研究表明補(bǔ)陽還五湯通過抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗血小板聚集等作用治療冠心病[5-7]。目前，臨床或動物實驗多是通過比較分散的靶點(diǎn)來探討其治療冠心病的作用機(jī)制，很少從整體的角度闡釋補(bǔ)陽還五湯的作用機(jī)制，且其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制等方面的研究也尚未完全闡明。故本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合多成分、多靶點(diǎn)探究補(bǔ)陽還五湯治療冠心病的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，以期獲得新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 復(fù)方靶點(diǎn)收集

利 用BATMAM-TCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）和TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/）檢索補(bǔ)陽還五湯的活性成分，其中地龍的活性成分通過國內(nèi)外文獻(xiàn)調(diào)研獲得[8]。

1.2 冠心病靶點(diǎn)收集

以“coronary heart disease”為檢索詞在OMIM（https://omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/）、DisGeNET（http://www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫中檢索相應(yīng)的靶點(diǎn)[9]。

1.3 補(bǔ)陽還五湯與冠心病共同靶點(diǎn)交集

利 用Venny 2.1.0平 臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）制作成分靶點(diǎn)與冠心病靶點(diǎn)交集圖并獲得交集靶點(diǎn)[10]。

1.4 交集靶點(diǎn)互作

將交集靶點(diǎn)錄入STRING數(shù)據(jù)庫（http: //stringdb.org/），將作用參數(shù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，利用CytoHubba插件查找樞紐基因，構(gòu)建共同靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）[11]。

1.5 基因本體論（GO）及京都基因與基因組（KEGG）富集分析

將交集靶輸入DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）獲得GO和KEGG數(shù)據(jù)，使用R軟件對GO和KEGG富集分析進(jìn)行可視化。

1.6 中藥-成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將補(bǔ)陽還五湯的成分以及靶點(diǎn)和關(guān)鍵通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化處理。

1.7 分子對接

將“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值排名前三的活性成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。其中，化合物和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分別在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org）獲取。運(yùn)用Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對接，并用Pymol軟件對結(jié)果進(jìn)行展示[12]。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)陽還五湯活性成分靶點(diǎn)收集

通過數(shù)據(jù)庫活性成分并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)檢索共獲取109個成分，得到434個作用靶點(diǎn)（表1）。

表1 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)”信息

2.2 復(fù)方及疾病共靶點(diǎn)交集

將去重后的237個藥物靶點(diǎn)與706個冠心病靶點(diǎn)通過Venny平臺制作靶點(diǎn)交集圖，獲得交集靶點(diǎn)45個（圖1）。

圖1 補(bǔ)陽還五湯活性成分與冠心病共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建PPI靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖2），運(yùn)用CytoHubba插件按Degree值大小篩選前8位關(guān)鍵靶點(diǎn)（表2），獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。

圖2 共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 度值前8位的共同靶點(diǎn)

圖3 核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 靶點(diǎn)GO功能注釋及KEGG通路富集分析

GO分析中得到包括活性氧合成與代謝、脂多糖反應(yīng)（BP）52條；膜筏、膜微區(qū)（CC）12條；核受體活性、甾體激素受體活性（MF）24條，見圖4。

圖4 交集靶點(diǎn)GO富集分析

KEGG通路富集分析（圖5）得到69個條目，結(jié)果表明基因主要富集在流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）等信號通路。截取流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路作補(bǔ)充說明（圖6）。

圖5 交集靶點(diǎn)KEGG富集分析

圖6 流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路

2.5 中藥-活性成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape 3.7.1軟件對獲得的中藥、成分、靶點(diǎn)以及關(guān)鍵通路進(jìn)行可視化處理（圖7），圖中包含7個中藥節(jié)點(diǎn)、57個活性成分節(jié)點(diǎn)、32個關(guān)鍵靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)以及14個關(guān)鍵通路節(jié)點(diǎn)，共110個節(jié)點(diǎn)。

圖7 “中藥-成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對接

將Degree值排名前3位的活性成分木犀草 素（lutcolin）、槲 皮 素（quercetin）和 山 柰 酚（kaempferol）與關(guān)鍵靶標(biāo)PTGS2進(jìn)行分子對接（圖8）。結(jié)果表明三種化合物與PTGS2的結(jié)合能均≤-7.0 kCal/mol（木犀草素=-8.4 kCal/mol；槲皮素=-7.9 kCal/mol；山柰酚=-7.7 kCal/mol），展現(xiàn)出良好的結(jié)合力，其中山柰酚數(shù)值最小，與PTGS2結(jié)合能最好。

圖8 化學(xué)成分與靶點(diǎn)的分子對接圖

3 討論

PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，IL-6、PTGS2和MMP9等為補(bǔ)陽還五湯治療冠心病的潛在作用靶點(diǎn)。IL-6常作為炎癥的生物標(biāo)志物，是冠心病嚴(yán)重程度的重要預(yù)測因子[13]。PTGS2參與調(diào)控脂質(zhì)代謝和炎癥以及抗血栓形成[14]。MMP9可增加心臟自噬通量，從而改善心肌梗死[15]。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)AGE-RAGE、NF-κB、HIF-1等可能是冠心病的治療通路。AGE-RAGE信號通路激活會導(dǎo)致組織纖維化，引發(fā)動脈粥樣硬化的發(fā)展和進(jìn)展[16]。NF-κB信號通路在各種炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用[17]。HIF-1信號通路是心臟代謝和血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，對心肌保護(hù)具有重要作用[18]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對接的方法探究補(bǔ)陽還五湯治療冠心病的作用機(jī)制，進(jìn)一步驗證了中藥復(fù)方通過多靶點(diǎn)、多途徑來治療疾病的過程。由于本研究是基于網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)以及生物信息學(xué)所得出的結(jié)果，后續(xù)還需通過試驗研究進(jìn)行驗證。希望本研究能為補(bǔ)陽還五湯治療冠心病提供新的治療思路。