高齡與非高齡復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者行胚胎植入前非整倍體檢測的可行性分析

蒲艷，鄭愛燕，廖桂芝，偶建，王馥新，王瑋，丁潔

2017年歐洲生殖年會將胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(preimplantation genetic testing，PGT)的概念引入國際不孕不育與生育保健術(shù)語匯編，取代了以往的胚胎移植前基因診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)、胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(preimplantation genetic screen，PGS)。PGT包括3個方面:胚胎植入前非整倍體檢測(PGT for aneuploidies,PGT-A)、單基因遺傳病的檢測 (PGT for monogenic/single gene defects，PGT-M)、染色體結(jié)構(gòu)重排的檢測 (PGT for chromosomal structural rearrangements，PGT-SR)[1]。在國內(nèi)PGT-A目前主要應(yīng)用于高齡(≥38歲)、不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA),即反復(fù)自然流產(chǎn)兩次及以上、不明原因反復(fù)種植失敗 (recurrent implantation failure，RIF)，即移植≥3次或移植高評分卵裂期胚胎數(shù) 4～6個或高評分囊胚數(shù)≥3個均失?。粐?yán)重畸精癥[2]。這部分患者通過常規(guī)的助孕方法很難得到滿意的結(jié)果，而PGT-A技術(shù)應(yīng)用至今仍存在爭議。本中心PGT-A周期中大多數(shù)為高齡及非高齡RSA患者，本研究擬對這兩組患者進行分析，探討高齡和非高齡RSA患者胚胎染色體的整倍體性以及PGT-A在這兩組患者中的臨床應(yīng)用價值，以為不同適應(yīng)證患者應(yīng)用PGT-A技術(shù)提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

納入2016年1月至2021年1月蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心共195個PGT-A周期，考慮到年齡對胚胎染色體的影響，分為兩組。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 高齡組(排除子宮畸形及夫婦雙方染色體異常因素)，年齡≥38歲,有或無RSA病史(96個活檢周期，259枚囊胚);② 非高齡RSA組，患者反復(fù)自然流產(chǎn)兩次及以上(排除子宮畸形、免疫因素、內(nèi)分泌因素及夫婦雙方染色體異常因素)，年齡<38歲(99個活檢周期，429枚囊胚)。分別分析兩組患者胚胎染色體的整倍性。將胚胎凍融移植周期(frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET)中行PGT-A的高齡RSA患者與同期未行PGT-A的高齡RSA患者進行比較，分析PGT-A在兩組患者中的臨床應(yīng)用價值；將FET中行PGT-A的非高齡RSA患者與同期未行PGT-A的非高齡RSA患者進行比較，分析PGT-A在兩組患者中的臨床應(yīng)用價值。

1.2 研究方法

1.2.1 取卵及受精 根據(jù)本中心常規(guī)方案行促排卵，患者在扳機后34～36 h行陰道B超引導(dǎo)下取卵，2～4 h后卵丘復(fù)合物在透明質(zhì)酸酶中脫顆粒細(xì)胞，成熟卵子采用單精子顯微注射方式受精。

1.2.2 胚胎培養(yǎng)及活檢 胚胎在G-1 PLUS和G-2PLUS(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)液中序貫培養(yǎng)成囊胚，根據(jù)囊胚生長情況于第5日或第6日對囊胚滋養(yǎng)外胚層進行活檢取樣。囊胚評級根據(jù)Gardner評分法[3]，內(nèi)細(xì)胞團和滋養(yǎng)外胚層均在B級以上為優(yōu)質(zhì)囊胚。

1.2.3 二代測序技術(shù) (next generation sequencing，NGS) 對所有活檢樣本進行全基因組擴增后建庫。等溫擴增和富集后，使用PGM測序儀(ABI Ion Torrent PGM，美國)進行測序。使用Ion Reporter software進行測序結(jié)果解讀，通過界面分析數(shù)據(jù)或后臺linux界面分析數(shù)據(jù)進行染色體分析，以此判斷胚胎的染色體是否正常[4]。

1.2.4 囊胚冷凍與復(fù)蘇 囊胚冷凍解凍均采用玻璃化冷凍，所用冷凍解凍液及載桿購自日本 KITAZATO公司。

1.2.5 臨床結(jié)局 移植后第14日測血β-hCG確認(rèn)是否妊娠，陽性者于移植后4～6周B超檢查，見孕囊者為臨床妊娠，孕12周內(nèi)自然流產(chǎn)為早期流產(chǎn)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間均數(shù)比較采用方差分析，率的比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高齡組胚胎PGT-A檢測結(jié)果

高齡組共96個活檢周期，活檢259枚囊胚，非整倍體率高達76.1%，主要為整條染色體整倍性的異常(83.8%)，詳見下頁表1。根據(jù)囊胚發(fā)育的天數(shù)分組，D6囊胚的非整倍體率高于D5囊胚(P<0.05)，按囊胚的質(zhì)量分組后顯示，D6非優(yōu)質(zhì)囊胚的非整倍體率高于D5優(yōu)質(zhì)囊胚(P<0.05)，由于D7囊胚數(shù)量較少，未納入分組統(tǒng)計范圍，余組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見下頁表2,表3。

2.2 非高齡RSA組胚胎PGT-A檢測結(jié)果

非高齡RSA組共99個活檢周期，429枚囊胚，非整倍體率為45.7%，詳見下頁表4。根據(jù)囊胚發(fā)育的天數(shù)分組(排除D7囊胚數(shù))，D6囊胚的非整倍體率顯著高于D5囊胚(P<0.05)；按囊胚的質(zhì)量分組后顯示，D6非優(yōu)質(zhì)囊胚的非整倍體率顯著高于其余3組(P<0.05)，各組間非整倍體類型差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表5，表6。

2.3 PGT-A高齡組與未行PGT-A高齡組FET周期臨床結(jié)局比較

比較同期FET周期中，PGT-A高齡組與未行PGT-A高齡組(考慮到比較對象的一致性，未行PGT-A高齡組均為新鮮周期全冷凍后的囊胚解凍移植周期)臨床基本資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PGT-A高齡組僅移植1枚胚胎，胚胎移植數(shù)量顯著低于未行PGT-A高齡組，PGT-A高齡組臨床妊娠率、種植率及活產(chǎn)率高于未行PGT-A高齡組患者(P<0.05)，早期流產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見下頁表7。

2.4 非高齡RSA患者行PGT-A組與未行PGT-A組FET周期臨床結(jié)局的比較

本研究還比較了同期FET周期中非高齡RSA行PGT-A組與非高齡組RSA未行PGT-A組的臨床結(jié)局。兩組患者的臨床基本資料中，非高齡RSA行PGT-A組的不孕年限顯著增長(P<0.05)，其余一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本中心非高齡組RSA未行PGT-A組在新鮮周期均行囊胚培養(yǎng)，故FET周期同PGT-A周期均移植1枚囊胚。其臨床妊娠率、種植率及早期流產(chǎn)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見下頁表8。

表1 高齡組胚胎PGT-A檢測結(jié)果

表2 高齡組不同發(fā)育天數(shù)胚胎整倍性比較

表3 高齡組不同發(fā)育天數(shù)及不同質(zhì)量胚胎整倍性比較

表4 非高齡RSA組胚胎PGT-A檢測結(jié)果

表5 非高齡RSA組不同發(fā)育天數(shù)胚胎整倍性比較

表6 非高齡RSA組不同發(fā)育天數(shù)及不同質(zhì)量胚胎整倍性比較

表7 PGT-A高齡組與未行PGT-A高齡組FET周期臨床結(jié)局比較

表8 非高齡RSA患者行PGT-A組與未行PGT-A組FET周期臨床結(jié)局的比較

3 討論

PGT的活檢時機經(jīng)歷了從極體活檢、卵裂球活檢，再到現(xiàn)在普遍采用的囊胚活檢3個階段。囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢能夠得到較多數(shù)目的胚胎細(xì)胞，最大限度地獲得胚胎的遺傳信息，且對胚胎的損傷相對較小[5]。而隨著NGS的廣泛應(yīng)用，PGT檢測結(jié)果的精確性也大大地提高[6]，本研究從囊胚的發(fā)育速度和胚胎質(zhì)量兩方面比較不同PGT適應(yīng)證患者胚胎的整倍性，并分析了PGT技術(shù)對其妊娠結(jié)局的影響。

研究表明隨著女性年齡的增加，其卵子染色體非整倍體率隨之增加，這也是高齡女性妊娠成功率下降的原因之一[7]，本研究對高齡女性患者的259枚囊胚活檢后的PGT-A結(jié)果進行了分析，發(fā)現(xiàn)胚胎染色體非整倍體率高達76.1%，進一步驗證了高齡女性胚胎染色體的高異常率。高齡組胚胎主要為整條染色體的整倍性異常，其中包括多條染色體和單條染色體的整倍性異常。將所有囊胚根據(jù)發(fā)育天數(shù)分組比較發(fā)現(xiàn)，高齡患者D6囊胚的非整倍體率顯著高于D5囊胚。不同發(fā)育天數(shù)的囊胚根據(jù)胚胎質(zhì)量分組，D6非優(yōu)質(zhì)囊胚組胚胎的非整倍體率高于D5優(yōu)質(zhì)囊胚組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，D5非優(yōu)質(zhì)囊胚組與D6優(yōu)質(zhì)囊胚組非整倍體率相近，略高于D5優(yōu)質(zhì)囊胚組，低于D6非優(yōu)質(zhì)囊胚組，組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。由此可見，高齡患者的胚胎非整倍體率較高，特別是生長發(fā)育較慢的囊胚，根據(jù)胚胎學(xué)評分選擇胚胎無法達到較高的篩選作用。此外，從本研究對同期FET周期中，PGT-A高齡組與未行PGT-A高齡組的臨床結(jié)局比較發(fā)現(xiàn)，兩組患者D5、D6胚胎移植周期率及優(yōu)質(zhì)囊移植周期率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，PGT-A高齡組雖然僅移植1枚胚胎，移植數(shù)量顯著低于未行PGT-A高齡組，但臨床妊娠率、種植率及活產(chǎn)率均顯著提高，早期流產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，進一步說明對于高齡患者，根據(jù)胚胎形態(tài)學(xué)評分選擇胚胎移植并無優(yōu)勢，通過PGT-A篩選出整倍體胚胎后移植，能顯著改善高齡患者的臨床結(jié)局，減少患者移植的頻率。

本中心PGT-A周期患者主要為高齡患者、RSA患者(排除子宮畸形、免疫因素、內(nèi)分泌因素及夫婦雙方染色體異常因素)，余為反復(fù)種植失敗的患者，后者例數(shù)較少，未進行統(tǒng)計分析。研究發(fā)現(xiàn)大約50%的早期流產(chǎn)是由于染色體異常導(dǎo)致的，在輔助生殖技術(shù)中發(fā)現(xiàn)，有大部分形態(tài)學(xué)評分較高的胚胎是非整倍體[8]，不明原因的RSA，也與胚胎染色體整倍性相關(guān)[9]。本研究非高齡RSA組胚胎的非整倍體率為45.7%，4種類型的非整倍體比例相差較小,主要為單條染色體異常和嵌合體。根據(jù)囊胚發(fā)育天數(shù)分組比較，D5囊胚的非整倍體率低于D6囊胚，與高齡患者結(jié)果一致。按囊胚的質(zhì)量分組后顯示D6非優(yōu)質(zhì)囊胚的非整倍體率顯著高于其余3組。不同組別間不同類型非整倍體率的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。不同于高齡患者，對比同期FET周期中行PGT-A的非高齡RSA組與未行PGT-A的非高齡RSA組，兩組的臨床妊娠率、種植率、活產(chǎn)率和早期流產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。兩組移植的胚胎中D5、D6胚胎移植周期率及優(yōu)質(zhì)胚胎移植周期率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示在移植囊胚形態(tài)學(xué)評分及發(fā)育天數(shù)無差異的前提下，通過PGT-A選擇整倍體胚胎移植，并無明顯優(yōu)勢。

囊胚培養(yǎng)的過程也是胚胎篩選的過程，本研究中高齡組與非高齡RSA組D5囊胚的整倍性都顯著高于D6囊胚，與多數(shù)研究結(jié)果一致[10-12]。線粒體的數(shù)量、紡錘體異常都會導(dǎo)致囊胚發(fā)育緩慢，從而影響胚胎的整倍體率[13-15]。但也有部分研究認(rèn)為囊胚的整倍性與胚胎質(zhì)量有關(guān)，與發(fā)育天數(shù)無關(guān)[16-17]。本研究的結(jié)果還提示，D6非優(yōu)質(zhì)囊胚的非整倍體率最高，但D5囊胚組與D6優(yōu)質(zhì)囊胚組的非整倍體差異不明顯。值得注意的是，本研究未行PGT-A檢測的非高齡RSA組患者，在遵循優(yōu)先選擇D5優(yōu)質(zhì)囊胚的前提下，能夠達到和PGT-A組相近的活產(chǎn)率和流產(chǎn)率。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)PGT-A對RSA患者臨床結(jié)局的改善是有限的，移植PGT-A檢測后的整倍體囊胚并沒有增加活產(chǎn)率，也沒有降低流產(chǎn)率[18-20]。有研究認(rèn)為PGT-A對于流產(chǎn)物基因檢測結(jié)果異常的RSA患者是有效的，而對于流產(chǎn)物為整倍體的患者，應(yīng)積極考慮胚胎以外的因素[21-22]。但Zhou T等[19]的研究發(fā)現(xiàn)對于<38歲有不良妊娠史的患者，PGT-A檢測并沒有改善其活產(chǎn)率和流產(chǎn)率，因此對于PGT-A在RSA患者的應(yīng)用還需要更多隨機對照實驗證明。

綜上，由于高齡患者胚胎的非整倍體率較高，通過PGT-A檢測能夠篩選出整倍體胚胎移植，改善臨床結(jié)局，而對于年輕的RSA患者，由于本中心數(shù)據(jù)提示PGT-A技術(shù)無明顯優(yōu)勢，可選擇囊胚培養(yǎng)，優(yōu)先選擇D5、D6優(yōu)質(zhì)囊胚移植，PGT-A的應(yīng)用還需要更多的證據(jù)。