腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在膽管細(xì)胞癌中的作用

韓品盛， 楊 龍， 崔 濤， 張雅敏

1 天津醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院， 天津 300070； 2 天津市第一中心醫(yī)院 肝膽外科， 天津 300192； 3 天津藥物研究院 釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300000； 4 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物代謝新技術(shù)創(chuàng)新單元， 北京 100730

膽管細(xì)胞癌(cholangiocarcinoma，CCA)是一種侵襲性高、預(yù)后極差的膽道惡性腫瘤，5年存活率<10%[1],可發(fā)生于膽道樹(shù)的任何分支，按解剖位置可分為肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA)、肝門周圍膽管細(xì)胞癌(perihilar cholangiocarcinoma,pCCA)或遠(yuǎn)端膽管細(xì)胞癌(distal cholangiocarcinoma,dCCA)，其中pCCA和dCCA統(tǒng)稱為肝外膽管細(xì)胞癌(extrahepatic cholangiocarcinoma,eCCA)。手術(shù)切除是所有亞型CCA的首選治療方案，但其早期診斷困難，周圍組織解剖關(guān)系復(fù)雜，患者往往喪失手術(shù)機(jī)會(huì)。吉西他濱和順鉑聯(lián)合化療方案常用于不能手術(shù)的CCA患者，然而有報(bào)道稱其中位總生存期不足1年[2]。因此，對(duì)CCA發(fā)生發(fā)展機(jī)制的探索和臨床治療轉(zhuǎn)化具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，從外周血遷移到腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage,TAM) ，在腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等方面發(fā)揮著重要的作用[3]。TAM一般分為兩種，一種是殺傷腫瘤的M1型巨噬細(xì)胞(經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞)，可以通過(guò)細(xì)胞表面抗原識(shí)別出不同于正常組織的腫瘤細(xì)胞，并產(chǎn)生一氧化氮、活性氧簇等腫瘤殺傷因子殺傷腫瘤細(xì)胞，另一種是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的M2型巨噬細(xì)胞(替代活化型巨噬細(xì)胞)，可以分泌白細(xì)胞介素(IL)-10、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等細(xì)胞因子，在腫瘤的血管生成及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[4]。M1和M2型巨噬細(xì)胞受腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)的影響會(huì)不斷發(fā)生動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化，這一過(guò)程稱為“巨噬細(xì)胞極化”。研究[5]表明在大多數(shù)腫瘤中，TAM的特征與M2型巨噬細(xì)胞更為相近。

TAM參與了CCA的免疫逃逸、細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫耐藥等過(guò)程，并且在CCA免疫治療中具有重要意義。因此，本文對(duì)TAM促進(jìn)CCA進(jìn)展的機(jī)制和靶向TAM的免疫治療作一綜述。

1 TAM在CCA腫瘤部位的募集

CCA細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子，包括單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein，MCP)1、集落刺激因子(colony-stimulating factor，CSF)1和VEGF-A[6]，將外周血中的單核細(xì)胞募集到腫瘤組織中，并誘導(dǎo)TAM向M2型巨噬細(xì)胞方向極化，大量的M2型TAM在腫瘤周圍聚集，促進(jìn)腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移。在另一項(xiàng)研究中，Raggi等[7]構(gòu)建了一種CCA干細(xì)胞樣微球體模型，該模型通過(guò)釋放IL-13、IL-34和骨活素等細(xì)胞因子，將血液中的單核細(xì)胞募集到腫瘤組織，也可以促進(jìn)其向M2型TAM方向極化。此外，在缺氧環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子和抑瘤素M將TAM募集到腫瘤部位并促使其向M2型TAM極化[8]。

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblast，CAF)是TME中的一種重要組成成分，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著必不可少的作用，近年來(lái)的研究[9]顯示，CAF也與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸密切相關(guān)。CAF通過(guò)分泌趨化因子 CXCL12、CSF-1、IL-6和CC類趨化因子配體(C-C motif ligand,CCL)2等細(xì)胞因子，促進(jìn)單核細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境募集并分化為TAM[10]，介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸。

綜上所述，CCA細(xì)胞或TME中的其他細(xì)胞可以通過(guò)釋放細(xì)胞因子的方式，將TAM募集到腫瘤組織中，并將其極化為M2型TAM，之后M2型TAM通過(guò)多種方式促進(jìn)膽管癌的進(jìn)展。

2 TAM對(duì)CCA的作用和影響

2.1 TAM介導(dǎo)CCA的免疫逃逸 近年來(lái)，隨著對(duì)CCA免疫治療研究的深入，越來(lái)越多的研究表明CCA免疫治療的臨床效果較差，這主要是由于TME中免疫抑制相關(guān)細(xì)胞的作用，其中M2型TAM對(duì)CCA逃避宿主的免疫監(jiān)視起到了重要作用。M2型TAM分泌大量的精氨酸酶1(Arginase 1，Arg1)，Arg1可以耗盡CCA組織中的精氨酸并產(chǎn)生多胺，多胺具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，促進(jìn)CCA的免疫逃逸[11-12]。

此外，TAM分泌的CCL2可以刺激腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞分化為CD4+/CD25+的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)[13]，Treg通過(guò)分泌IL-10和TGFβ，抑制細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞 (CTL)和自然殺傷細(xì)胞的活化，介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸，Treg還可結(jié)合IL-2，使其在TME中失活，抑制免疫應(yīng)答反應(yīng)[14]。TAM自身還可以吸引免疫抑制細(xì)胞(如Treg)進(jìn)入CCA組織中，抑制機(jī)體免疫應(yīng)答，介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸[15]。

因此，TAM可以通過(guò)產(chǎn)生Arg1、CCL2等細(xì)胞因子的方式介導(dǎo)CCA的免疫逃逸。

2.2 TAM促進(jìn)CCA細(xì)胞的增殖 Wnt/β-catenin通路是參與腫瘤增殖的重要通路，Wnt激活后與細(xì)胞膜上的受體蛋白Frizzled蛋白相結(jié)合，引起細(xì)胞質(zhì)中β-catenin蛋白增多，使得細(xì)胞質(zhì)中游離的β-catenin蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，該通路的過(guò)度激活可引起CCA的發(fā)生[16]。Loilome等[17]使用TAM的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)CCA細(xì)胞，結(jié)果顯示β-catenin表達(dá)水平升高，證實(shí)TAM可以激活了Wnt/β-catenin 通路，進(jìn)而促進(jìn)CCA細(xì)胞增殖。Boulter等[18]發(fā)現(xiàn)Wnt7b和Wnt10a在人CCA組織以及小鼠CCA異種移植模型中高度表達(dá)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TAM高表達(dá)Wnt7b, 并激活Wnt/β-catenin 通路，促進(jìn)CCA細(xì)胞增殖。

此外，另有研究[19]發(fā)現(xiàn)TAM可以分泌內(nèi)含環(huán)狀RNA的外泌體，與CCA細(xì)胞內(nèi)的微小RNA靶點(diǎn)相互作用，促進(jìn)CCA細(xì)胞的增殖和遷移，這也說(shuō)明TAM分泌的外泌體可能是TAM和CCA細(xì)胞之間的信息傳遞媒介。

總之，TAM細(xì)胞通過(guò)Wnt/β-catenin通路和分泌外泌體的方式促進(jìn)CCA細(xì)胞的增殖。

2.3 TAM促進(jìn)CCA的血管生成 腫瘤血管生成在CCA的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用，新生的血管為CCA組織提供營(yíng)養(yǎng)，并促進(jìn)CCA的轉(zhuǎn)移。TAM在腫瘤血管周圍部位聚集，TAM的聚集引起血管生成因子相關(guān)基因(表皮調(diào)節(jié)素、VEGFA和CXCL3)的高表達(dá)，從而增加CCA新生血管的生成[15,20]。此外，在CCA腫瘤組織中，TAM通過(guò)分泌促血管生成因子，如VEGF-A、血管生成素、IL-8和炎癥相關(guān)細(xì)胞因子，如環(huán)氧合酶-2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，來(lái)促進(jìn)腫瘤新生血管的生成，從而加劇CCA的進(jìn)展[21]。在CCA中，TAM通過(guò)上調(diào)血管生成因子相關(guān)基因和分泌促血管生成因子促進(jìn)CCA的血管生成。

2.4 TAM促進(jìn)CCA的轉(zhuǎn)移 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial-mesenchymal transition, EMT)在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，可增強(qiáng)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Sun等[22]將iCCA與TAM共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其上皮標(biāo)志物N-鈣黏蛋白和緊密連接蛋白表達(dá)減少,而間充質(zhì)標(biāo)志物E-鈣黏蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和波形蛋白增多，說(shuō)明TAM可以促進(jìn)iCCA細(xì)胞的EMT，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TAM通過(guò)激活A(yù)KT3/PRAS40信號(hào)通路促進(jìn)iCCA細(xì)胞的EMT，增強(qiáng)iCCA的轉(zhuǎn)移。Techasen等[23]證明TAM通過(guò)分泌IL-4、IL-6、IL-10、TNFα和TGFβ1，使上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白和細(xì)胞角蛋白19表達(dá)減少，而間充質(zhì)標(biāo)志物鈣結(jié)合蛋白S100A9和MMP9表達(dá)增多，從而促進(jìn)CCA的EMT。因此，TAM通過(guò)AKT3/PRAS40信號(hào)通路和分泌細(xì)胞因子的方式使上皮標(biāo)志物的表達(dá)減少，間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)增多，促進(jìn)了CCA的EMT。

2.5 TAM促進(jìn)CCA的免疫耐藥 吉西他濱是治療CCA的關(guān)鍵藥物，對(duì)于局部晚期或轉(zhuǎn)移性CCA，順鉑加吉西他濱是最有效的化療方案[2]。在eCCA中，選取26例腫瘤復(fù)發(fā)患者接受以吉西他濱為基礎(chǔ)的化療，結(jié)果證明TAM、TAN和Treg免疫細(xì)胞高表達(dá)的患者疾病進(jìn)展率高于TAM、TAN和Treg低表達(dá)組 ，說(shuō)明TAM等免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)與患者的不良預(yù)后以及吉西他濱耐藥有關(guān)[24]。

圖1 TAM對(duì)CCA的作用

3 TAM在CCA免疫治療中的作用

有報(bào)道[25]稱CSF-1的過(guò)度表達(dá)與腫瘤組織中TAM的募集和極化密切相關(guān)。集落刺激因子-1受體(CSF-1R) 是表達(dá)于巨噬細(xì)胞表面的受體酪氨酸激酶，其配體CSF-1與之結(jié)合后可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖、分化和趨化活性增加[26]。在腫瘤的臨床前模型中，大量研究[27-28]表明CSF-1R抑制劑可以減少腫瘤組織中TAM的數(shù)量，延緩腫瘤進(jìn)展，延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存時(shí)間。在小鼠CCA異種移植模型中，CSF-1R抑制劑可以抑制小鼠模型中TAM的募集和極化，使用CSF-1R抑制劑后小鼠移植瘤中CD68+巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，小鼠移植瘤體積和質(zhì)量也均有減小，說(shuō)明CCA的CSF-1R靶向治療效果顯著[18]。

MCP-1又被稱為CCL2,也是一種很強(qiáng)的TAM趨化激活劑，盡管 MCP-1 的產(chǎn)生曾經(jīng)被認(rèn)為是宿主抵御腫瘤的一種表現(xiàn)，但現(xiàn)在認(rèn)為它可以將TAM募集到腫瘤組織中，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[29]。TWAKE與其受體Fn14結(jié)合后可激活NF-κB通路分泌MCP-1、IL-6、IL-8、CSF-1和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，增加TAM在CCA組織中的募集。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)阻斷了TWAKE/Fn14通路， MCP-1表達(dá)減少，使TAM在CCA組織中的募集減少。此外，向小鼠CCA異種移植模型中多次注射抗MCP-1抗體，小鼠CCA異種移植模型中的移植瘤明顯減小且TAM的數(shù)量與對(duì)照組相比減少了56.5%，說(shuō)明CCA的MCP-1靶向治療效果較好[30]。

CD47是一種表達(dá)在正常細(xì)胞表面的抗吞噬蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，通過(guò)和巨噬細(xì)胞表面的信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(signal regulatory protein α，SIRPα)結(jié)合來(lái)抑制巨噬細(xì)胞的吞噬作用，從而保護(hù)正常細(xì)胞不被清除。當(dāng)細(xì)胞老化或病變時(shí)，細(xì)胞表面就會(huì)逐漸喪失CD47，以幫助巨噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬這些細(xì)胞[31]。有報(bào)道稱CCA細(xì)胞比HCC細(xì)胞有著更高的CD47表達(dá)，從而通過(guò)與巨噬細(xì)胞SIRPα結(jié)合來(lái)“欺騙”巨噬細(xì)胞，使巨噬細(xì)胞不將其吞噬?？笴D47抗體可以阻斷CD47-SIRPA的相互作用導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)，從而減輕了小鼠CCA異種移植模型中的腫瘤負(fù)荷[32]。

細(xì)胞程序性死亡受體(programmed cell death-1，PD-1)和細(xì)胞程序性死亡-配體1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)的表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的重要機(jī)制[33]，CCA細(xì)胞上的 PD-L1 和T淋巴細(xì)胞上的 PD-1 結(jié)合后可以抑制CTL的正常免疫活性，減弱機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。此外，CCA中的TAM也可以表達(dá)PD-L1，介導(dǎo)CCA的免疫逃逸[34]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint blockade，ICB)采用抗原抗體相結(jié)合的方式阻斷PD-1和 PD-L1的結(jié)合，用于CCA的免疫治療，但由于CCA腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞TAM和骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞抑制了CTL的活性，介導(dǎo)了CAA的免疫逃逸，導(dǎo)致ICB單藥治療效果較差，但Loeuillard等[34]發(fā)現(xiàn)將ICB與TAM阻斷劑和骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞阻斷劑聯(lián)合應(yīng)用，治療CCA效果明顯提高。

4 小結(jié)

總之，TAM在CCA的免疫逃逸、細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫耐藥等方面起到重要作用，并作為一種免疫治療的新型靶點(diǎn)在CCA的臨床治療研究中具有廣闊的應(yīng)用前景，但是TAM靶向治療的安全性還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。雖然CCA惡性程度高，起病隱匿，但隨著近年來(lái)研究人員對(duì)TME的深入研究，發(fā)現(xiàn)了許多例如TAM的特異性靶點(diǎn)，相信隨著各種靶向藥物的問(wèn)世，CCA的精準(zhǔn)治療時(shí)代即將到來(lái)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：韓品盛負(fù)責(zé)文獻(xiàn)查閱，論文撰寫；楊龍、崔濤負(fù)責(zé)論文修改，研究指導(dǎo)；張雅敏負(fù)責(zé)研究指導(dǎo)，經(jīng)費(fèi)支持。