母女同患原發(fā)性膽汁性膽管炎報告并基因分析

秦玉潔， 周文秀， 周興念， 程明亮， 李 宏

1 貴州醫(yī)科大學， 貴陽 550025； 2 貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 感染科， 貴陽 550025

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)是一種慢性自身免疫性的膽汁淤積性肝病，其特點是慢性膽汁淤積、小葉間膽管破壞，嚴重者可進展為肝硬化、肝功能衰竭[1]。該病以女性為主，男女比例約為1∶8，亞太地區(qū)PBC總體患病率為9.8/100 000，中國達8.99/100 000[2]。PBC的病因是多因素的，大約三分之一的患者對熊去氧膽酸(UDCA)治療應答不佳。遺傳因素在自身免疫性疾病中起重要作用，但是PBC遺傳學的研究進展仍較緩慢，全基因組關聯(lián)研究(genome-wide association studies, GWAS)顯著提高了評估復雜疾病遺傳關系的能力[3]。本報告通過對母女二人進行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)測序、分析，揭示了PBC的遺傳易感性，患者母親存在AIH-PBC重疊綜合癥，同時存在自身免疫性胰腺炎。本研究篩選了母女二人PBC的一致候選基因，報告如下。

1 病例資料

患者女性，68歲，主訴“厭油、納差1周”于2021年3月21日入院。入院查體全身皮膚鞏膜輕度黃染，肝區(qū)叩擊痛陽性。肝功能檢查示：ALT 1073.50 U/L，AST 1172.10 U/L，TBil 55.70 μmol/L，DBil 39.60 μmol/L，IBil 17.65 μmol/L，Alb 37.00 g/L，A/G 0.940，GGT 210.42 U/L，ALP 165.00 U/L，TBA 86.00 μmol/L。自身免疫性肝病相關自身抗體檢查示：抗核抗體 (ANA) 陽性，抗線粒體抗體(AMA) 陽性，AMA-M2強陽性。免疫球蛋白示：IgG 27.4 g/L，IgM 0.95 g/L。甲、乙、丙、丁、戊型肝炎及銅藍蛋白檢查未見異常。上腹部MRI增強檢查未見肝硬化及脾腫大，骨密度檢查發(fā)現(xiàn)重度骨質疏松。肝穿刺病理活檢提示中度界面炎，小葉間膽管上皮損傷，在肝門淋巴結中觀察到大量淋巴細胞和漿細胞，HE染色可見散在的肝壞死和大量炎性細胞浸潤，Masson染色顯示肝門纖維化和纖維間隔形成，小葉間膽管損傷。IgG4染色陰性，IgG染色陽性(圖1)。符合AIH-PBC重疊綜合征，G2～3，S2。國際AIH組織評分(IAIHG)20分。給予UDCA 15 mg·kg-1·d-1，甲潑尼龍60 mg/d口服，骨質疏松癥的對癥治療使用咀嚼維生素D鈣片?；颊吒喂δ苊黠@好轉，血清IgG4、IgG、IgA、IgM下降，患者出院后，因震顫和血壓升高停用甲潑尼龍。隨后肝功能惡化，調整用藥為UDCA 15 mg·kg-1·d-1、甲潑尼龍8 mg、硫唑嘌呤0.5 mg，肝功能再次改善，肝功能和身體狀態(tài)恢復到滿意水平，該患者仍在隨訪中。

注：a，HE染色，×100； b，Masson染色，×100；c，IgG染色，×100；d，IgG4染色，×100；e，CK7染色，×100；f，CK19染色，×100。

患者女兒，47歲，主訴“體檢發(fā)現(xiàn)肝功能異常7年”?；颊吒鶕?jù)其母親主診醫(yī)生建議進行肝穿刺病理檢查。肝功能檢查ALT 73.80 U/L，AST 59.00 U/L，GGT 341.00 U/L，ALP 219.00 U/L。ANA陽性， AMA強陽性，AMA-M2強陽性。免疫球蛋白：IgG 12.7 g/L，IgA 3.52 g/L，IgM 2.82 g/L。甲、乙、丙、丁、戊型肝炎及銅藍蛋白未見異常。上腹部MRI增強掃描未見肝硬化及脾腫大，骨密度測定正常，IAIHG評分10分。肝穿刺病理活檢提示肝細胞彌漫性水樣變性，部分肝細胞內見色素顆粒沉積，肝竇內見少量單個核炎細胞為主的混合炎細胞，匯管區(qū)炎癥表現(xiàn)，纖維組織增生，大量單個核細胞為主的混合炎細胞浸潤，小葉間膽管損傷，空泡變，局灶膽管基底膜破壞。IgG4染色陰性，IgG 染色炎性細胞陽性(圖2)。結合組織學特點及病史，患者ALT未達到5倍以上上限標準，暫不考慮診斷AIH，符合PBC Ⅰ期診斷。

候選遺傳變異的篩選以“PASS”實施嚴格的遺傳變異質量控制。為了識別感興趣的PBC 候選基因中潛在的功能變異，去除了同義突變，并包括了非同義突變、剪接突變和移碼突變。考慮到臨床意義，筆者專注于包括 SIFT、PolyPhen2、突變評估器、con-del和FATHMM在內的工具來預測有害突變。為了探究與PBC相關的基因變異，保留了兩例患者共有但正常家庭成員中(患者父親)沒有的突變。在NCBI、GeneCards、OMIM等數(shù)據(jù)庫中檢索候選基因的功能及其與免疫反應和免疫耐受的相關性。表1列出了兩例患者(母親和女兒)遺傳變異的功能注釋，發(fā)現(xiàn)兩例患者的基因變異以錯義突變居多，產(chǎn)生堿基突變和氨基酸突變，止損突變在所有基因突變類型中所占比例最小。經(jīng)過質量控制和同義突變、高頻突變、無臨床意義突變的剔除，分別獲得女兒298個基因突變和母親293個基因突變。錯義突變仍然是基因突變的主要類型(表2)。本研究調查了母親和女兒之間同類的常見基因變異。共獲得136個基因變異，其中錯義突變130個，停止增益突變5個，剪接突變1個。通過母女常見遺傳變異的基因富集分析，如果所有分析工具都預測為有害突變，則共有9個共同SNP位點，分別位于GPSM2、CACNA1S、CRYBA2、SLC7A14、CA13、NOTCH1、PNPLA7、IFT140和BEST2基因中(表3)。

表1 患者基因變異功能注釋

表2 患者候選基因變異功能注釋

表3 患者共有變異基因的 SNP 位點及相應氨基酸變化

2 討論

PBC是自身免疫介導的慢性膽汁淤積性肝病，女性患者多見，其病因和發(fā)病機制尚未完全明確，其致病因素包括遺傳易感性和環(huán)境因素[4]。研究[5-7]發(fā)現(xiàn)PBC先證者一級親屬的患病率高于健康對照組，PBC先證者一級親屬PBC患病風險較健康對照組增加約10倍，血清AMA陽性率也高于健康對照組，但總體發(fā)生率較低。Selmi等[8]對PBC家系進行研究，發(fā)現(xiàn)PBC家系的同卵雙胞胎患病的一致率顯著高于異卵雙胞胎，家族聚集提示遺傳易感性在PBC的發(fā)病機制中起重要作用。PBC與遺傳易感性及環(huán)境誘因都可能相關，基因易感性不容忽視。PBC發(fā)病率受家庭成員的患病率影響較大，甚至有些兒童也因基因易感性患病。PBC患者的一級親屬患病率大大增加，AMA陽性親屬患PBC的風險較AMA陰性親屬更高[9]。PBC女性患者的一級親屬中女兒患病相對風險最高，我國學者[10]研究發(fā)現(xiàn)PBC與HLA等位基因兩者之間關系密切，特別是DRB1*0701與疾病易感性顯著有關。

同卵雙胞胎PBC的發(fā)病率高于異卵雙胞胎，證實遺傳風險的存在，無癥狀親屬的AMA陽性患者PBC發(fā)病率顯著增加，高通量遺傳學研究增加了人們對PBC基因遺傳因素相關性的理解，隨著遺傳流行病學和高通量測序研究的開展，對PBC發(fā)病機制的遺傳因素研究越來越深入。SNP低頻變異可能與特定疾病的家族聚集現(xiàn)象相關，全外顯子組測序(whole exome-sequencing,WES)為PBC家系中SNP低頻變異檢測提供了技術手段，其高通量測序特性可檢測變異頻率<0.01的低頻變異位點。因此，WES技術可用于家族性疾病的研究，探究低頻變異位點[11]。本研究發(fā)現(xiàn)母女二人均存在GPSM2、CACNA1S、CRYBA2、SLC7A14、CA13、NOTCH1、PNPLA7、IFT140和BEST2多態(tài)性改變，可能與PBC家族易感性有關。

GPSM2是G蛋白信號調節(jié)劑2，該基因編碼的蛋白屬于調節(jié)G蛋白激活的蛋白家族，將細胞表面受體接收到的細胞外信號轉導為細胞內各種反應。GPSM2突變導致常染色體隱性遺傳病Chudley-McCullough綜合征，可導致GPSM功能障礙引起的耳聾。研究[12]發(fā)現(xiàn)GPSM2表達與乙型肝炎和肝癌密切相關，可能通過促進細胞周期導致腫瘤細胞增殖。CACNA1S是鈣電壓門控通道亞基α1 S，該基因是編碼骨骼肌細胞中緩慢失活的L型電壓依賴性鈣通道的五個亞基之一。CACNA1S基因的變異與惡性高熱易感性和低鉀性周期性麻痹等遺傳疾病相關。CRYBA2是白內障致病相關基因。SLC7A14是溶質載體家族7成員14，該基因編碼一種糖基化的陽離子氨基酸轉運蛋白，主要在皮膚成纖維細胞、神經(jīng)組織和原代內皮細胞中表達。PNPLA7與脂肪細胞分化的調節(jié)有關，IFT140基因編碼鞭毛內運輸復合物A，鞭毛內運輸參與初級纖毛的發(fā)生、再吸收和信號傳導。BEST2是陰離子通道bestrophin基因家族的成員。

NOTCH1編碼NOTCH蛋白家族的成員。Notch信號通路是一種進化上保守的細胞間信號通路，在肝臟發(fā)育過程中起重要作用。它通過Notch家族受體與其同源配體的結合來調節(jié)相鄰細胞之間的相互作用。肝臟含有潛能祖細胞，增殖并分化為肝細胞或膽管細胞。盡管成體肝細胞中Notch信號通路活性不高，研究[13]表明無論是在非酒精性脂肪性肝病患者還是小鼠模型中，肝細胞Notch信號通路都會被激活，隨后進一步激活肝星狀細胞，導致肝纖維化的產(chǎn)生。研究[14]表明膽管結扎后膽汁酸的積累和氧化應激導致炎癥反應是誘導肝損傷和肝纖維化的主要因素，膽汁淤積后的肝臟釋放促炎細胞因子IL-6、TNFα 和 NF-κB。 IL-6與IL-6R和gp130的六聚體復合物激活Janus激酶(JAK)，進而激活下游信號通路。JAK誘導自身酪氨酸磷酸化及STAT3二聚化，激活Notch信號通路IL-6/STAT3/NOTCH。

在小鼠肝細胞中過表達JAG1將誘導高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肝纖維化，而在小鼠肝細胞中特異性敲除JAG1可以降低肝纖維化程度，表明肝細胞中JAG1-Notch信號通路的激活在肝纖維化過程中起重要作用[15]。JAG1與NOTCH2和NOTCH3受體相互作用導致肝臟祖細胞中Notch信號通路的激活，JAG1是Alagille綜合征致病基因，表明Notch信號在膽管穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，但這種信號通路的功能研究一直很困難。Zhang等[16]研究表明，在膽汁淤積性肝纖維化中，Notch信號激活肝祖細胞分化為膽管細胞是不可或缺的，Notch 信號增強了膽管細胞的增殖，抑制Notch信號激活后膽管細胞增殖顯著減少，肝纖維化程度明顯減輕。因此，抑制Notch信號通路可能是治療膽汁淤積性肝纖維化的方法之一。

PBC病因至今尚未明確，通常認為是環(huán)境因素和遺傳因素交互作用的結果，但近年研究發(fā)現(xiàn)其有一定的家族遺傳易感性。本研究通過對同患PBC母女二人進行SNP測序，并根據(jù)結果進行分析，發(fā)現(xiàn)其有共同的NOTCH1多態(tài)性改變，可能是母女共同致病基因，提示對于PBC患者家族一級親屬成員檢測NOTCH1多態(tài)性有助于確定遺傳概率，可能有利于該病的早期診斷及早期干預，但仍需要進一步研究NOTCH1在PBC中的作用機制，為PBC的治療提供更多的證據(jù)。全基因組的研究及進展有望解開遺傳和疾病之間復雜的關系，完全解決PBC的發(fā)病機制仍有待研究。

倫理學聲明：本例報告已獲得患者知情同意。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：秦玉潔負責文章撰寫；周文秀負責臨床資料收集整理；周興念負責研究數(shù)據(jù)的獲取分析解釋過程；程明亮、李宏負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。