氣相色譜-離子遷移色譜結合化學計量學分析大鯢尾蒸制過程中揮發(fā)性成分特征

趙世博，成愷騏，賀敬媛，金文剛,3,

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建培育國家重點實驗室，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學 陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723001；3.陜西理工大學 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001）

大鯢（Andrias davidianus）俗稱“娃娃魚”，具有較高的食用和營養(yǎng)價值，其人工繁育與養(yǎng)殖在我國已實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，但是深加工利用程度相對較低[1-2]。當前，關于大鯢營養(yǎng)分析[3-4]、生物活性肽[5-8]、膠原蛋白/明膠[9-10]、分割加工與貯藏保鮮[11-13]等方面的研究頻見報道。預制菜肴是指以1 種或者多種農(nóng)產(chǎn)品為主要原料，經(jīng)過預加工（分切、腌制、滾揉、成型、調味等）和預烹飪（炒、炸、蒸制等），通過預包裝形成成品或者半成品預制菜肴[14]。隨著大鯢深加工的推進和水產(chǎn)預制調理食品的應用開發(fā)，已有研究嘗試將大鯢肉開發(fā)為各種預制調理食品[15-18]。長期以來，養(yǎng)殖大鯢主要以餐飲消費為主，大鯢尾肉質富有彈性，肥瘦相間，滋味鮮美多汁，富含大量多不飽和脂肪酸[19]。“清蒸大鯢尾”在第二屆全國大鯢美食節(jié)榮獲金獎[20]，將其開發(fā)為預制菜肴可豐富大鯢加工產(chǎn)品種類，對于大鯢產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

肉類及水產(chǎn)魚類熱加工過程中，蛋白質變性、分解、脂質氧化會產(chǎn)生較多揮發(fā)性風味化合物，對于產(chǎn)品風味品質具有重要影響。目前，氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）、氣相色譜-嗅聞、電子鼻和氣相色譜-離子遷移色譜（gas chromatography-ion mobility spectrometer，GC-IMS）等[21-23]技術已廣泛用于鑒定和定量分析食品中揮發(fā)性風味物質。與傳統(tǒng)GC-MS技術相比，GC-IMS技術顯示出諸多優(yōu)勢，特別是制樣簡單、高靈敏度和可視化等方面，已日益成為1 種檢測食品中揮發(fā)性風味物質的新興技術[21,23]。譚艷等[24]結合GC-MS與GC-IMS對4 種不同柚皮精油的揮發(fā)性成分進行對比研究，并指出GC-IMS檢測靈敏度高于GC-MS，可以檢測小分子和低含量的揮發(fā)性成分，能夠有效擴大樣品中揮發(fā)性成分的檢測范圍。且已有研究利用GC-MS和GC-IMS等技術對蝦醬發(fā)酵[25]、菲律賓蛤仔蒸煮[26]和海鱸魚蒸制[27]過程中揮發(fā)性風味物質變化進行檢測，并發(fā)現(xiàn)在不同處理時間下，肉制品揮發(fā)性風味物質均有明顯差異。因此，GC-IMS技術對于水產(chǎn)品加工過程揮發(fā)性成分鑒定和可視化表征方面具有明顯優(yōu)勢，可與GC-MS方法互補從而全面表征樣品的揮發(fā)性特征。

前期已對大鯢膠原蛋白[9]和不同部位組織[21]揮發(fā)性成分、肉中揮發(fā)性成分[16,23,28]、活性肽分離純化[7,29-30]等方面進行較多研究工作。隨著預制菜肴產(chǎn)品開發(fā)逐漸受到關注，還有研究利用GC-IMS技術已對大鯢肉油炸[16]、烤制[28]以及燉湯[31]過程中揮發(fā)性成分進行探究，然而對大鯢尾蒸制過程中品質及風味特征變化尚不明確。為此，本研究利用GC-IMS技術探究大鯢尾蒸制過程中揮發(fā)性成分指紋特征，采用偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）建立穩(wěn)定性和預測能力較好的模型，根據(jù)變量投影重要性（variable important in projection，VIP）值篩選特征揮發(fā)性風味物質，并進行主成分分析（principle component analysis，PCA），旨在為大鯢尾預制菜肴產(chǎn)品質量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活健康商品鯢尾3 條（體質量為（1.55±0.18） kg）購自漢中市魏大鯢生態(tài)養(yǎng)殖場，經(jīng)標準宰殺后取大鯢尾低溫運至實驗室，置于冰箱冷藏（4 ℃）備用。食鹽、蔥、生姜、大蒜、料酒等購自當?shù)厥称烦小?/p>

6 種分析純正構酮（2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮和2-壬酮） 國藥化學試劑（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

FlavourSpec?GC-IMS聯(lián)用儀 德國G.A.S公司；SC-350W萬能蒸烤箱 松下家電（中國）有限公司；T25組織分散機 德國IKA公司；YP102N電子天平上海舍巖儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大鯢尾預處理

將4 ℃冷藏大鯢尾清洗后，用刀切割大鯢尾中部肉為厚度均勻薄片（約5 mm），稱取1 000 g，加入食鹽3 g、料酒20 mL、蔥5 g、姜5 g和蒜末10 g拌勻腌制20 min后，均勻裝盤上屜進行蒸制。分別于0、2、5、8 min取樣獲得不同蒸制時間大鯢尾樣品。

1.3.2 感官評價方法

招募10 名食品專業(yè)研究生組成感官評價小組，經(jīng)過食品感官初步培訓，模擬正常進餐環(huán)境從質地、風味、多汁性、色澤4 個方面對不同蒸制時間大鯢尾樣品逐一評分計算平均值[31]。最終感官評分＝質地×0.25+風味×0.25+多汁性×0.25+色澤×0.25，并制定評分標準（表1）。

表1 感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation

1.3.3 揮發(fā)性氣味檢測

采用GC-IMS對不同蒸制時間大鯢尾樣品氣味成分進行檢測。分別取蒸制過程中不同時間段大鯢尾樣品，使用組織分散機勻漿后精密稱取3.0 g，放入20.0 mL頂空進樣瓶中，于60 ℃孵育15 min，進樣500 μL后上機分析。儀器詳細參數(shù)設置為：自動頂空進樣單元：進樣體積500 μL、孵育時間15 min、孵育溫度60 ℃、進樣針溫度85 ℃、孵化轉速500 r/min；氣相-離子遷移譜單元：分析時間20 min、MXT-5色譜柱（15 m×0.53 mm，1 μm）、柱溫60 ℃、載氣/漂移氣N2、IMS溫度45 ℃。使用6 種正構酮為內(nèi)標進行保留時間和保留指數(shù)校正，結合風味儀內(nèi)置譜庫NIST 2014進行定性分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結果調用儀器LAV和Reporter、Gallery Plot分別獲得圖譜。通過儀器內(nèi)置的GC×IMS Library Search NIST 2014數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對樣品揮發(fā)性成分進行定性分析。根據(jù)揮發(fā)性成分峰體積歸一化法獲得各類揮發(fā)性成分相對含量，SPSS 22.0沃特-鄧肯法多重比較顯著性差異（顯著性水平設置為0.05）。利用SIMCA 14.1軟件中得到PLS-DA得分散點圖對大鯢尾樣品中揮發(fā)性有機物質進行分類，結合VIP值＞1篩選出潛在特征風味，進一步分析不同蒸制時間大鯢尾揮發(fā)性成分之間差異。

2 結果與討論

2.1 不同蒸制時間大鯢尾感官評分結果

由圖1A可知，蒸制過程中大鯢尾由外觀色澤逐漸轉為黃亮，其原因可能是肌肉組織中的蛋白質由于蒸制溫度升高而變性，顏色逐漸變白，脂肪組織黃度也發(fā)生較大變化。由圖1B可知，0～5 min時大鯢尾感官評分呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，且差異顯著（P＜0.05）；而5～8 min時感官評分趨向恒定?？紤]到大鯢尾富含多不飽和脂肪酸[17]，大鯢尾蒸制時間不宜過長。結合感官評分結果，蒸制5 min大鯢尾質地、風味、多汁性和色澤較好。

圖1 大鯢尾蒸制過程中外觀（A）及感官評分（B）結果Fig. 1 Photographs (A) and sensory scores (B) of giant salamander tails during steaming process

2.2 大鯢尾蒸制過程中GC-IMS揮發(fā)性成分分析

利用GC-IMS對蒸制不同時間大鯢尾中的揮發(fā)性成分進行檢測。圖2為GC-IMS儀器自帶LAV分析軟件中的Reporter插件導出的3D譜圖，每個斑點代表一種揮發(fā)性成分，色澤深淺表示信號強弱（顏色越深，揮發(fā)性成分相對含量越高）[22,25]。從3D圖中很難用肉眼直觀進行揮發(fā)性成分比較，需要進一步降維處理。

圖2 大鯢尾蒸制過程中GC-IMS三維譜圖Fig. 2 Three-dimensional GC-IMS spectra of giant salamander tails during steaming process

圖3為將上述3D譜圖投影獲得蒸制大鯢尾2D譜圖，可相對容易比較不同蒸制時間大鯢尾揮發(fā)性成分的差異。由圖3可知，不同蒸制條件大鯢尾樣品揮發(fā)性成分通過GC-IMS技術被較好地分離開來，且不同樣品中部分成分含量有升有降，反映了細微差異[25,30]。研究人員通過GC-IMS技術分析海鱸魚蒸制過程中揮發(fā)性成分的差異，表明不同蒸制階段魚肉揮發(fā)性成分具有一定差異[16,27]。本研究顯示大鯢尾不同蒸制時間下?lián)]發(fā)性成分GC-IMS特征譜也存在相對差異，可能與蒸制熟化過程脂質氧化等因素有關[26]。

圖3 大鯢尾蒸制過程中GC-IMS二維譜圖Fig. 3 Two-dimensional GC-IMS spectra of giant salamander tails during steaming

2.3 大鯢尾蒸制前期GC-IMS揮發(fā)性風味成分定性分析

圖4 大鯢尾蒸制0 min揮發(fā)性成分定性分析Fig. 4 Qualitative analysis of volatile compounds of giant salamander tail steamed for 0 min

圖4為大鯢尾蒸煮過程中揮發(fā)性成分定性分析圖譜（以0 min樣品為例），圖中顯示的數(shù)字代表定性分析的具體揮發(fā)性成分。根據(jù)風味儀軟件內(nèi)置的NIST 2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與G.A.S.的IMS遷移時間數(shù)據(jù)庫，從不同蒸制時間大鯢尾45 個信號峰中，鑒定出29 種揮發(fā)性有機化合物（表2），可分為2 種醇類、4 種醛類、3 種酮類、9 種酯類、8 種醚類、2 種酸類和1 種酚類。

表2 大鯢尾蒸制最終鑒定的揮發(fā)性成分Table 2 Identification of volatile constituents from giant salamander tails during steaming

2.4 不同蒸制時間大鯢尾揮發(fā)性成分Gallery指紋圖譜

利用GC-IMS分析大鯢尾蒸制過程中揮發(fā)性風味物質的變化。指紋圖譜中代表揮發(fā)性物質的點亮度發(fā)生明顯變化，說明不同蒸制時間下大鯢尾中揮發(fā)性風味物質組成存在明顯差異；紅色信號越深，則表示該物質含量相對越高。由圖5A可知，隨著蒸煮時間延長，部分物質由藍色變?yōu)榧t色，即含量逐漸增加（戊酸乙酯，正己醛等）；另一些物質隨著蒸煮時間延長而減少（6-甲基-5-庚烯-2-酮、3-羥基-2-丁酮等）。此外，隨著蒸制時間延長，大鯢尾中揮發(fā)性風味物質種類和濃度總體有不同程度上升，這可能與大鯢尾蒸制過程中發(fā)生的脂類氧化和裂解有關[32-33]。此外一定的熱處理可促進大鯢尾中揮發(fā)性風味化合物的釋放，從而豐富了清蒸大鯢尾的風味。榮建華等[34]通過基于電子鼻和SPME-GC-MS聯(lián)用分析蒸制對脆肉鯇魚肉揮發(fā)性成分的影響，發(fā)現(xiàn)蒸制可顯著提高魚肉中揮發(fā)性物質的相對含量。

圖5 蒸制不同時間大鯢尾中各種揮發(fā)性成分分析Fig. 5 Analysis of various volatile components in the tail of giant salamander at different times of steaming

為直觀清楚顯示蒸制不同時間大鯢尾揮發(fā)性有機物差異，將指紋圖譜上各種有機物的峰體積歸一化處理，得到不同蒸制時間大鯢尾中揮發(fā)性成分種類相對含量。由圖5B可知，可以將不同蒸制時間大鯢尾中揮發(fā)性成分大體分為6 類，即醛類、醇類、酮類、酯類、醚類、和酚類，其中醛類約占5.82%～10.34%，由正己醛、2-已烯醛和順-2-甲基-2-丁醛構成；醇類約占20.99%～35.20%，由異戊醇、乙醇構成；酮類約占0.82%～1.44%；酯類約占22.92%～31.34%，由丁位辛內(nèi)酯、水楊酸甲酯（單體和二聚體）、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸丙酯、乙酸乙酯構成。醚類約占32.20%～40.63%，由甲基烯丙基三硫醚、二丙基二硫醚、烯丙基二硫醚、雙(1-甲基丙烯基)二硫化物、異丁基丙基硫醚和烯丙基甲基二硫醚構成；酚類含量最少，約占0.30%～1.23%，由2-甲氧基-4-甲基苯酚構成。此外，不同蒸制時間大鯢尾樣品中所含6 種類別化合物相對含量具有一定的差異性，大鯢尾蒸制前以醇類（20.99%）、醚類（35.26%）、酯類（31.34%）和醛類（9.87%）為主，酮類和酚類相對含量較少。與蒸制0 min相比，大鯢尾蒸制2 min后，酯類、醚類、酮類和酚類相對含量有所下降，而醇類、醛類化合物相對含量有所上升；隨后酯類化合物相對含量持續(xù)下降，醇類化合物先增加，并在蒸制5 min時相對含量最高，然后減少；醚類化合物先減少后增加，并在蒸制2 min時含量最少；酚類化合物先減少后增加；醛類化合物先增加再減少再增加；酮類化合物的相對含量則先減少后增加。

不同種類的化合物具有不同的香氣特征，醛類是脂肪降解的主要產(chǎn)物，其閾值低，對大鯢尾整體風味貢獻值較大；酮類、醇類主要來源于脂肪氧化，其閾值高于醛類，且酮類能消除腥味，一般產(chǎn)生植物香、水果香等比較柔和的氣味，對肉類風味貢獻較大[35]。醛類在肉制品中大量存在，且蔥、姜、蒜等調味料的添加會賦予肉品更多的醛類化合物，能為大鯢尾的整體風味提供更豐富的果香氣[36]。硫醚類化合物較多，含量較高的是烯丙基二硫醚和雙(1-甲基丙烯基)二硫化物，它們含有強烈的大蒜氣味，可能源自大鯢尾制作過程中添加了蔥、姜、蒜等烹飪佐料。酯類和醇類是料酒中占比最大、數(shù)量最多的揮發(fā)性化合物[37]，可能導致本研究中大鯢尾酯類、醇類較多，同時酯類、醇類也可以為大鯢尾提供甜香、水果香等氣味。聚類熱圖中揮發(fā)性成分的顏色由藍色到紅色，代表各個物質成分由低到高，也能較好表示大鯢尾中揮發(fā)性化合物在不同組分中的含量差異。由圖5C可知，5-甲基-3庚酮、乙酸異戊酯M、烯丙基二硫醚M、正己醛、異戊醇和乙醇在蒸制時間5 min時顏色最深，表示其含量較高，相反這些物質在0 min時含量較低；乙酸異戊酯D、乙酸異丁酯、乙酸丙酯、二丙基二硫醚、2-己烯醛和6-甲基-5-庚烯-2-酮在0 min時表達量較高，在8 min時表達量較低。以上含量不同的揮發(fā)性成分可能賦予了不同蒸制時間大鯢尾差異性風味特征。

2.5 PLS-DA及模型驗證

利用PLS-DA得分散點圖對不同蒸制時間下大鯢尾樣品中的揮發(fā)性有機物質進行分類，將數(shù)據(jù)進行降維分析，可以對復雜數(shù)據(jù)進行判別和預測。隨機改變分類變量的排列順序建立相應的模型，由圖6A可知，R2X（cum）＝0.935，R2Y（cum）＝0.929，當R2和Q2值為0.5～1.0時，表明模型有較好的概括解釋率；Q2（cum）＝0.87，表示模型有較好預測和解釋能力。

圖6 不同蒸制時間大鯢尾揮發(fā)性成分PLS-DA得分圖（A）、置換檢驗結果（B）、PCA結果（C）及VIP值分布（D）Fig. 6 PLS-DA score plot (A), permutation test plot (B), PCA plot (C) and VIP value distribution (D) of giant salamander tail at different steaming times

將樣本進行順序置換（n＝200），重新得出統(tǒng)計檢驗量，構造經(jīng)驗分布，以此為基礎進行建模。Q2代表累計交叉有效性，其值與模型預測能力成正比關系；R2代表累計方差值，表示被用來建立PLS-DA判別模型的原始數(shù)據(jù)數(shù)量，其值大反映出模型解釋變異好。對PLS-DA模型進行擬合，得到R2X＝0.935，R2Y＝0.929，Q2＝0.87，表明所建模型擬合效果較好。為繼續(xù)驗證模型是否存在過擬合，將部分樣本類別進行200 次的置換擬合。由圖6B可知，R2與縱軸相交于（0，0.165），Q2與縱軸相交于（0，-0.443），R2和Q2的2 條回歸線斜率相對較大，左邊隨機排列產(chǎn)生的實驗值R2和Q2值均低于最右邊的R2和Q2值，且Q2回歸線的截距是負數(shù)，說明PLS-DA判別模型無過擬合現(xiàn)象，模型可用于不同蒸制時間大鯢尾揮發(fā)性成分的分類判別。由圖6C可知，對于PCA，PC1貢獻率66.5%，PC2貢獻率31.1%，降維后2 個PC累計貢獻率為97.6%，能較好表征原始數(shù)據(jù)的特征。

徐永霞等[26]通過海鱸魚肉蒸制過程通過GC-IMS風味數(shù)據(jù)篩選出了11 種特征揮發(fā)性標志物（VIP值＞1)。本研究通過GC-IMS指紋圖譜，將不同蒸制時間下的大鯢尾樣品29 種揮發(fā)性化合物的關系進行可視化。依據(jù)PLS-DA模型中的VIP值將每個變量對分類的貢獻進行量化，篩選VIP值＞1的揮發(fā)性有機物作為潛在的特征風味成分。由圖6D可知，大鯢尾蒸制過程中共有10 種差異揮發(fā)性風味物質VIP＞1，包括1 種醇類（異戊醇）、1 種酚類（2-甲氧基-4-甲基苯酚）、3 種醚類（烯丙基甲基二硫醚、二丙基二硫醚、異丁基丙基硫醚）、1 種酸類（3-甲基戊酸）、2 種醛類（2-己烯醛、順-2-甲基-2-丁醛）、2 種酯類（乙酸乙酯、水楊酸甲酯）。這些物質整體可能是由于香辛料遷移、大鯢尾蛋白和脂質氧化等多因素產(chǎn)生的揮發(fā)物，最終賦予大鯢尾蒸制后獨特特征風味，然而這些風味化合物的明確香氣類型和輪廓還有待于今后通過氣相色譜-嗅聞技術來確認和揭示。

3 結 論

在感官評價基礎上，采用GC-IMS初步確定了不同蒸制時間大鯢尾揮發(fā)性風味物質。從大鯢尾中共鑒定出29 種揮發(fā)性有機化合物。大鯢尾蒸制過程中整體以醚類、酯類和醇類為主。隨著蒸制過程的進行，各類揮發(fā)物相對含量呈現(xiàn)一定動態(tài)變化，這可能源于大鯢尾脂質氧化分解、香辛料等佐料的滲透或分解等綜合因素。結果表明，大鯢尾蒸制5 min感官品質最佳。采用PLS-DA模型從29 種揮發(fā)性有機物中篩選出10 種差異揮發(fā)性成分。PCA結果表明，2 個主成分累計貢獻率為97.6%，說明這些特征揮發(fā)性成分可對大鯢尾蒸制階段進行較好區(qū)分。該研究為大鯢蒸制不同時間肉品的風味和質量控制提供了參考。