功能性魚(yú)軟骨多糖制備工藝優(yōu)化及食用安全性評(píng)價(jià)

武瑞赟，桂 萌，劉子宇，Tharushi S. Shinali，尚 楠,

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)院研究所，北京 100068；4.北京語(yǔ)言大學(xué)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京 100083）

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性上皮腫瘤[1]，在歐美等一些發(fā)達(dá)國(guó)家，結(jié)直腸癌已經(jīng)成為繼肺癌、肝癌和乳腺癌后的第四大常見(jiàn)癌癥[2]，嚴(yán)重威脅人類健康。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，生活方式的轉(zhuǎn)變以及老齡化人口的增漲，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率明顯上升，亟需開(kāi)展有效的防治工作。由于結(jié)直腸癌發(fā)病因素復(fù)雜，病理表征多樣[3]。目前，結(jié)合外科手術(shù)和放療、化療的綜合治療對(duì)結(jié)直腸癌的治療效果并不理想，靶向治療費(fèi)用較為昂貴；此外，結(jié)直腸癌的形成和發(fā)展是一個(gè)多階段的漫長(zhǎng)過(guò)程，通常需要7～10 年的潛伏期[4]，這就為早期的預(yù)防提供了最佳的機(jī)會(huì)。預(yù)防藥物的開(kāi)發(fā)已成為目前結(jié)直腸癌研究中的熱點(diǎn)；但是，許多經(jīng)歷多年開(kāi)發(fā)的化學(xué)預(yù)防藥物都被發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)期服用下存在一定的安全問(wèn)題，如抗藥性或?qū)ζ渌K器的毒性[5]。因此，在滿足有效的同時(shí)，尋找安全低毒的預(yù)防物質(zhì)是目前迫切需要解決的問(wèn)題。

硫酸軟骨多糖（chondroitin sulfate，CS）廣泛存在于動(dòng)物軟骨、結(jié)締組織和細(xì)胞外基質(zhì)中，以D-葡萄糖醛酸（D-glucuronic acid，GlcA）和N-乙酰-D-半乳糖胺（N-acetyl-D-galactosamine，GalNAc）通過(guò)β-1,3糖苷鍵為基本二糖單位，二糖單位之間通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接形成的一類線性直鏈糖胺聚糖[6]，分子質(zhì)量約10～100 kDa，具有抗炎、止血、保持關(guān)節(jié)軟骨彈性、調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、調(diào)控細(xì)胞黏附分化和增殖、抗腫瘤等多種生物活性[7]。但是CS的高分子質(zhì)量和高電荷密度導(dǎo)致其生物利用率較低，限制了其生物功效的發(fā)揮[8-9]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，低分子質(zhì)量CS具有黏度小、溶解性好、易吸收等優(yōu)點(diǎn)，可有效克服CS生物利用率低的缺點(diǎn)，如牛源CS經(jīng)降解后制備出不同分子質(zhì)量的CS（92.7、54.1、26.3、19.7 kDa），通過(guò)體外氧化實(shí)驗(yàn)證明了低分子質(zhì)量的CS具有更高的抗氧化活性[10]。因此，開(kāi)發(fā)和制備分子質(zhì)量低、活性高的CS受到研究者的青睞。目前，低分子質(zhì)量CS主要通過(guò)酸降解法、氧化降解法、超聲降解法、輻射降解法以及酶解法獲得[11-14]，其中由于酶解法具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、操作簡(jiǎn)便、作用底物專一、產(chǎn)物分子質(zhì)量可控性高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用。

常見(jiàn)的CS大多來(lái)源于鯊魚(yú)軟骨組織，但過(guò)度捕撈造成鯊魚(yú)資源的日趨匱乏。鱘魚(yú)作為世界上最大最原始的軟骨硬鱗魚(yú)類，軟骨含量可占魚(yú)體的10%～20%[15-16]，為CS的研究提供了豐富的來(lái)源。實(shí)驗(yàn)室之前對(duì)鱘魚(yú)來(lái)源的CS進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，表明鱘魚(yú)CS（sturgeon sulfate chondropolysaccharides，SCS）具有和鯊魚(yú)CS一樣的官能團(tuán)和相似的結(jié)構(gòu)[17]，說(shuō)明SCS可作為鯊魚(yú)CS的良好替代物。且前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SCS具有抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用[18-19]，但體內(nèi)吸收效果不佳，大量不能吸收的CS主要是通過(guò)調(diào)節(jié)患病小鼠腸道菌群緩解或減緩結(jié)直腸癌的發(fā)展[20]。因此，本實(shí)驗(yàn)以SCS為原料，結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29增殖活性為指標(biāo)，通過(guò)酶解法，利用響應(yīng)面優(yōu)化制備具有抗結(jié)直腸癌活性的低分子質(zhì)量SCS。此外，開(kāi)發(fā)SCS相關(guān)的食品或保健食品目前缺乏明確的毒理安全評(píng)價(jià)資料。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)探究制備的SCS食用安全性，研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)以低分子質(zhì)量SCS為基礎(chǔ)的膳食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑預(yù)防、降低結(jié)直腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)SCS相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和進(jìn)一步的安全應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雜交鱘魚(yú)（Acipenser schrenckii×Huso dauricus）CS由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室制備保存。

BALB/c小鼠（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006）購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。SPF級(jí)健康5 周齡雌雄小鼠各半飼養(yǎng)于北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按照SPF級(jí)要求，溫度（22±2） ℃，相對(duì)濕度（50±10）%，嚴(yán)格按照12 h光照/黑暗循環(huán)進(jìn)行飼養(yǎng)和管理。實(shí)驗(yàn)中各組小鼠進(jìn)食和飲水自由。

硫酸軟骨素酶AC（chondroitinase sulfate AC，ChonAC） 北京碧澄生物科技有限公司；人源結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29細(xì)胞 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶細(xì)胞消化液、磷酸鹽緩沖液 美國(guó)Gibco公司；順鉑（cisplatin，DDP）美國(guó)Sigma公司；蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）試劑盒 北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；葡聚糖分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)聚合物標(biāo)準(zhǔn)品公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1/1C冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；UV2355紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼科儀器有限公司；SynergyHTX酶標(biāo)儀 美國(guó)Biotek公司；DHG-9141A恒溫恒熱培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；Hitachi 720血生化分析儀 日本日立公司；HEMAVET 950FS血細(xì)胞分析儀 美國(guó)DREW公司；3K15通用臺(tái)式冷凍離心機(jī)美國(guó)Sigma公司；UFSC40001 Amicon攪拌超濾杯 美國(guó)貝德福德密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HT-29細(xì)胞從液氮中取出，在37 ℃快速溶解后，離心收集細(xì)胞沉淀，加入新鮮的含有10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基并重懸細(xì)胞后，置于無(wú)菌的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%的二氧化碳條件下培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞增殖到90%左右時(shí)進(jìn)行傳代，3 代以上后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化2 min后，吹打細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104cells/mL，按照每孔100 μL加入到96 孔板中，于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜后，更換不同質(zhì)量濃度的SCS溶液（DMEM培養(yǎng)基配制），同時(shí)設(shè)置不添加任何藥物的空白處理組和DDP陽(yáng)性對(duì)照組。每個(gè)處理設(shè)置6 個(gè)平行，培養(yǎng)24 h后，每孔添加10 μL CCK-8試劑，避光4 h后，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，按照下式計(jì)算細(xì)胞抑制率。

式中：A處理為處理組吸光度；A空白為空白組吸光度；A對(duì)照為DDP陽(yáng)性對(duì)照組吸光度。

1.3.3 具有抑制結(jié)直腸癌增殖的低分子質(zhì)量SCS最優(yōu)制備條件確定

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

利用單因素試驗(yàn)，探究酶添加量、底物質(zhì)量濃度、pH值、酶解時(shí)間、酶解溫度5 個(gè)因素下酶解產(chǎn)物對(duì)HT-29細(xì)胞增殖抑制率，共進(jìn)行5 組實(shí)驗(yàn)。酶添加量選取0.012 5、0.025 0、0.050 0、0.100 0、0.200 0 IU/mg；pH值選取5、6、7、8、9；酶解時(shí)間選取15、30、60、90、120 min；底物質(zhì)量濃度選取0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL；酶解溫度選取20、25、30、35、40 ℃。單因素試驗(yàn)中每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.3.2 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)

試驗(yàn)中使用Design-Expert 8.0.6軟件輔助設(shè)計(jì)PB試驗(yàn)，選用N＝12的PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素及水平如表1所示，響應(yīng)值為酶解產(chǎn)物（1 000 μg/mL）對(duì)HT-29細(xì)胞存活率。通過(guò)對(duì)各因素效應(yīng)值、方差和貢獻(xiàn)率的分析，選出貢獻(xiàn)率前3的因素進(jìn)行下一步研究。

表1 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Low and high levels of each independent variable used in Plackett Burman design

表2 PB試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Plackett Burman design and experimental results

1.3.3.3 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)PB試驗(yàn)得到的顯著因素和效應(yīng)值，利用軟件設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)的方向和步長(zhǎng)。非顯著因素的取值根據(jù)PB試驗(yàn)中的效應(yīng)值確定。

1.3.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

由最陡爬坡試驗(yàn)得到的拐點(diǎn)可確定響應(yīng)中心及接近響應(yīng)值區(qū)間的因素取值范圍，利用Box-Benhnken（BB）法，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)產(chǎn)物（1 000 μg/mL）作用下HT-29細(xì)胞存活率進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到等高線圖和響應(yīng)面曲線圖，并獲得最優(yōu)酶解制備條件，對(duì)模型進(jìn)行方差分析，確定可信度并進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.4 低分子質(zhì)量SCS分離

將在最優(yōu)酶解條件下獲得的SCS酶解溶液經(jīng)三氯乙酸除去蛋白后離心取上清，添加到Amicon攪拌超濾杯中，并連續(xù)通過(guò)不同分子質(zhì)量的超濾膜（截留分子質(zhì)量5、3、0.5 kDa）。超濾過(guò)程中的壓力調(diào)節(jié)0.10～0.22 mPa。收集3 種超濾成分，包括＞5、3～5、0.5～3 kDa，并冷凍干燥樣品，分別命名為SCS-1、SCS-2和SCS-3。測(cè)定不同分子質(zhì)量的凍干SCS質(zhì)量，并測(cè)定其對(duì)HT-29細(xì)胞存活率的影響。

1.3.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組和處理

BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為6 組，其中雌性和雄性各3 組，每組10 只，實(shí)驗(yàn)采用最大灌胃劑量方法，每只小鼠灌胃劑量為1 mg/（g·d），分別灌胃SCS和SCS-F2，另設(shè)生理鹽水為正常對(duì)照組，按照每只0.2 mL/d進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃2 周后處死小鼠，取各組織臟器進(jìn)行病理分析，經(jīng)眼球采血后，進(jìn)行血液指標(biāo)和血生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.6 血常規(guī)測(cè)定

使用血液細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)測(cè)定，指標(biāo)包括紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞比容、平均紅細(xì)胞體積、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)等。

1.3.7 血液生化指標(biāo)測(cè)定

使用血生化測(cè)定儀進(jìn)行液生化指標(biāo)測(cè)定，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白等。

1.3.8 病理切片觀察

將剖取的臟器組織置于10%的中性福爾馬林組織固定液中，使用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液和無(wú)水乙醇進(jìn)行梯度脫水，二甲苯透明后，石蠟包埋。使用切片機(jī)對(duì)組織進(jìn)行切片，厚度5 μm，按照試劑盒進(jìn)行操作進(jìn)行染色后使用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)并采集圖片，進(jìn)行病理分析。

取小鼠結(jié)直腸樣本制好的HE染色切片，顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照記錄，每個(gè)樣本隨機(jī)選取2～3 個(gè)不同視野進(jìn)行拍照，利用軟件進(jìn)行圖像分析。選取組織結(jié)構(gòu)完整性好的隱窩，對(duì)結(jié)直腸縱切后，記錄每個(gè)隱窩縱向一半時(shí)的細(xì)胞數(shù)為所需隱窩深度，每個(gè)樣本的計(jì)數(shù)均需要大于20 個(gè)隱窩。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各個(gè)組別臟器指標(biāo)、血生化以及血液學(xué)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)完全后將實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)與空白組利用SPSS軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析的方法對(duì)各組間的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

如圖1所示，隨著酶添加量、pH值、溫度、酶解時(shí)間和底物質(zhì)量濃度的增加，酶解產(chǎn)物對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制率呈現(xiàn)先增加后降低或趨于不變的趨勢(shì)。其中，酶添加量在0.1、0.2 IU/mg時(shí)達(dá)到最大（圖1A），這是由于在一定的底物質(zhì)量濃度時(shí)，大分子、長(zhǎng)鏈的糖鏈會(huì)被酶解成短鏈的多糖，從而分子質(zhì)量降低[13-14]，但是酶解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的抑制率與酶解效率并不呈正相關(guān)，小分子的糖越多，分子質(zhì)量越低并不一定代表對(duì)細(xì)胞的抑制活性越強(qiáng)。如圖1B所示，當(dāng)pH值為7時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制率最高為58.05%；而后隨pH值增加，酶解產(chǎn)物的細(xì)胞活性抑制率降低。這可能是由于隨pH值增加，糖苷鍵斷裂加劇，聚合度減低，形成的單糖越多，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供的營(yíng)養(yǎng)越充分，促進(jìn)細(xì)胞增殖[21]，也因此細(xì)胞的抑制率有所降低。在固定酶添加量和pH值的條件下，酶解溫度對(duì)產(chǎn)物活性的影響如圖1C所示，酶解溫度為35 ℃時(shí)，產(chǎn)物對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制率最高，為62.43%。這是由于溫度的升高，使酶與底物之間的分子運(yùn)動(dòng)速率增加，酶的作用效果加強(qiáng)，酶解效率也有所增加，糖苷鍵斷裂的數(shù)量增加，使更多具有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的活性糖鏈片段被分離出來(lái)。在此條件下，隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞抑制率在60 min時(shí)達(dá)到最大值64.41%（圖1D）；而后酶解時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，一方面底物和酶的含量有限，酶解效率減緩；另一方面，酶解得到的寡糖或者二糖增加，細(xì)胞生長(zhǎng)需要的碳源增加，使得細(xì)胞的增殖能力有所上升，SCS對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制率降低。保持其他條件不變的情況下，底物質(zhì)量濃度為1、2 mg/mL時(shí)，產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的抑制率最大，分別為70.04%和70.11%（圖1E），且與其他各組差異顯著。細(xì)胞抑制率增長(zhǎng)表明酶解反應(yīng)后更多具有活性的SCS被解離[22-23]，糖苷鍵斷裂，具有抗腫瘤活性的糖鏈被解離出來(lái)。通過(guò)單因素試驗(yàn)得到最適酶添加量、pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間及底物質(zhì)量濃度分別為0.1 IU/mg、7、35 ℃、60 min和1 mg/mL。

圖1 酶添加量（A）、pH值（B）、溫度（C）、酶解時(shí)間（D）、底物質(zhì)量濃度（E）對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響Fig. 1 Effects of enzyme dosage (A), pH (B), temperature (C),enzymatic hydrolysis time (D) and substrate concentration (E) on cell proliferation activity

2.2 PB試驗(yàn)

利用Design Expert 8.0.6設(shè)計(jì)N＝12的Plackett-Burman，選擇對(duì)酶添加量（A）、底物質(zhì)量濃度（B）、酶解溫度（C）、pH值（D）及溫度（E）5 個(gè)因素進(jìn)行分析。考察各因素對(duì)制備的酶解產(chǎn)物抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖活性的影響，以上述因素在單因素實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果選擇合適的范圍和高低水平，以酶解產(chǎn)物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29的抑制率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)和結(jié)果分別如表1、2所示。

用Design Expert 8.0.6對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行效應(yīng)分析以及方差分析，結(jié)果如表3、4所示。由表3可知，酶添加量、底物質(zhì)量濃度、酶解時(shí)間這3 個(gè)因素為正效應(yīng)；pH值、溫度2 個(gè)因素為負(fù)效應(yīng)，并且這些因素效應(yīng)值的大小與貢獻(xiàn)率保持一致。由表4可知，模型顯著，說(shuō)明PB模型選擇合適，各因素P值的大小反映了該因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的顯著程度，P值越小說(shuō)明該因素對(duì)結(jié)果影響越顯著。因此可選用這3 個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。對(duì)于其他的因素，pH值、溫度為負(fù)效應(yīng)，因此應(yīng)選取其低水平，即pH 5、溫度35 ℃。

表3 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及效應(yīng)分析Table 3 Analysis of effect and contribution rate of each variable used in PB design

表4 PB試驗(yàn)整體因素模型方差分析表Table 4 Analysis of variance for the effect of each variable on cell proliferation activity in PB design

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡法是將各因素正負(fù)效應(yīng)的變化確定為爬坡方向，利用各因素的效應(yīng)值大小確定變化步長(zhǎng)，可以更經(jīng)濟(jì)快速地逼近最佳值區(qū)域，得到有效的響應(yīng)擬合方程。根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，篩選出主要的影響因素并設(shè)計(jì)最陡爬坡路徑。最陡爬坡試驗(yàn)拐點(diǎn)圖如圖2所示。編號(hào)為4的實(shí)驗(yàn)是最大值點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的條件為酶添加量0.1 IU/mg、底物質(zhì)量濃度1 mg/mL、酶解時(shí)間90 min。對(duì)應(yīng)對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制率可達(dá)80.95%，故該點(diǎn)為下一步BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

圖2 最陡爬坡試驗(yàn)Fig. 2 Results of steepest ascent test

2.4 BB響應(yīng)面試驗(yàn)

利用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)酶添加量（A）、底物質(zhì)量濃度（B）、酶解時(shí)間（C）設(shè)計(jì)三因素三水平的實(shí)驗(yàn)，BB試驗(yàn)的結(jié)果如表5所示。BB試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析使用Design-Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表6所示。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 5 Box-Behnken design and experimental results

表6 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析Table 6 AVOVA of quadratic polynomial model developed based on Box-Behnken design

由表6可知，所選擇的回歸模型的P值小于0.05，表明整體模型對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著的影響，具有可信度；失擬項(xiàng)的P值為0.053 5，不顯著，說(shuō)明未知因素對(duì)結(jié)果的影響較小，殘差主要由隨機(jī)誤差引起，模型選擇適當(dāng)；該模型的相關(guān)系數(shù)R2＝0.978 7，信噪比大于4，表明模型可信。低分子質(zhì)量硫酸軟骨對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制率（Y）對(duì)酶添加量（A）、底物質(zhì)量濃度（B）、酶解時(shí)間（C）的多元二次回歸方程為：

由回歸方程所做的響應(yīng)面立體圖見(jiàn)圖3所示，主要反映了酶添加量、底物質(zhì)量濃度和酶解時(shí)間之間的交互作用。通過(guò)方程可知，二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)值，表明方程具有最大值。利用Design-expert8.0.5b分析計(jì)算，酶解最佳條件為酶添加量0.103 IU/mg、底物質(zhì)量濃度1.005 mg/mL、酶解時(shí)間87 min，可得最大抑制率82.63%。按照工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果為82.55%，與預(yù)測(cè)值基本吻合，說(shuō)明模型很好地預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。

圖3 兩因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig. 3 Response surfaces and contour plots showing individual and interactive effects of variables on inhibitory activity against cell proliferation

2.5 具有抗結(jié)直腸癌活性的低分子質(zhì)量SCS的超濾分離

超濾分離后各組分相對(duì)含量如圖4A所示，共收集到3 個(gè)組分，凍干并計(jì)算相對(duì)含量，SCS-F1、SCS-F2和SCS-F3分別占SCS總質(zhì)量的24.11%，57.07%和18.02%。配制1 000 μg/mL的各組分樣品進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)各組分對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29增殖活性的抑制效果。如圖4B所示，SCS-F2具有更高的抑制活性（88.87%），顯著高于陽(yáng)性對(duì)照DDP處理組（50.70%）。同時(shí)分子質(zhì)量最小的SCS-F3卻顯示出較低的抑制活性，約29.13%，低于陽(yáng)性對(duì)照DDP組，這可能是由于分子質(zhì)量降低，具有抗腫瘤活性的官能團(tuán)減少或者消除[23]，使得該組分（SCS-F3）不具有抗腫瘤活性，因此選擇SCS-F2進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 不同分子質(zhì)量截留超濾后各組分相對(duì)含量（A）和對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29增殖活性的影響（B）Fig. 4 Percentages of ultrafiltration fractions with different molecular masses (A) and their inhibitory effects on the proliferation of colorectal cancer cell line HT-29 (B)

2.6 具有抗腫瘤活性的低分子質(zhì)量SCS毒性分析

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間，各小鼠均未表現(xiàn)出明顯的不良反應(yīng)，且無(wú)意外死亡狀況發(fā)生。隨機(jī)剖取各組中的小鼠，觀察不同處理對(duì)小鼠心、肝、脾、肺、腎和結(jié)腸組織的影響。表7中臟器質(zhì)量結(jié)果顯示，SCS-F2對(duì)臟器的生長(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有影響。如圖5所示，各組臟器的形態(tài)、顏色和質(zhì)地未見(jiàn)變化。其中肝臟組織切片的HE染色圖顯示各組肝臟中肝小葉排列規(guī)則、結(jié)構(gòu)無(wú)異常、無(wú)病理性改變，但是在空白對(duì)照組中，可見(jiàn)少部分胞漿呈空泡網(wǎng)格狀，猜測(cè)可能有輕微炎癥現(xiàn)象，SCS-F2處理組中未見(jiàn)該現(xiàn)象，且干細(xì)胞索排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，胞核位于中央，胞漿分布均勻，未見(jiàn)變性壞死，說(shuō)明對(duì)肝臟沒(méi)有毒性影響，結(jié)合上述肝臟血生化指標(biāo)（表7），SCS-F2處理組中血液中抗炎指標(biāo)均高于空白組，說(shuō)明SCS-F2一定程度上對(duì)肝臟具有保護(hù)作用。

圖5 SCS和SCS-F2對(duì)小鼠組織臟器的影響（200×）Fig. 5 Effects of SCS and SCS-F2 on visceral tissues of mice (200 ×)

表7 SCS和SCS-F2對(duì)小鼠臟器質(zhì)量、血常規(guī)及血生化的影響Table 7 Effects of SCS and SCS-F2 on visceral organ mass, complete blood count and blood biochemical indexes in mice

腎臟病理切片觀察可以看出，各組小鼠腎臟組織中腎皮質(zhì)及腎髓質(zhì)分界清晰，腎小球分散且分布均勻，周圍組織未見(jiàn)明顯病變，均為正常腎臟組織。腎臟的基本功能是產(chǎn)生尿液[24-25]，清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物及不可被吸收的殘?jiān)?，具有保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和新陳代謝的正常進(jìn)行的作用[26-29]，說(shuō)明SCS-F2對(duì)腎臟不具有毒副作用。

異常隱窩灶（aberrant crypt foci，ACF）是結(jié)直腸的一種癌前病變，是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)重要階段[30-31]。因此，對(duì)ACF的檢測(cè)和改善可以有效預(yù)防結(jié)直腸癌的早期發(fā)生[32]。如圖5所示，各組中小鼠結(jié)腸隱窩細(xì)胞排列整齊規(guī)則；對(duì)比正常對(duì)照組，SCS-F2處理組中不論是雄性或者是雌性小鼠中結(jié)腸均為出現(xiàn)柱狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞增生的現(xiàn)象。如圖6所示，與正常對(duì)照組和SCS處理組相比，SCS-F2處理后ACF數(shù)量較低，僅為6.11±2.09（雄性）和6.00±3.21（雌性），說(shuō)明SCS-F2具有預(yù)防和治療結(jié)直腸癌的潛力。綜合以上結(jié)果，SCS-F2屬于實(shí)際無(wú)毒級(jí)，對(duì)小鼠內(nèi)臟器官無(wú)不良影響。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與技術(shù)評(píng)價(jià)規(guī)范》，當(dāng)死亡數(shù)量≤50%時(shí)，可以進(jìn)入下一階段的毒理學(xué)試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組在1 000 μg/（g·d）劑量下滿足食品安全要求，可初步確定SCS-F2安全。

圖6 SCS和SCS-F2對(duì)小鼠結(jié)腸ACF的影響Fig. 6 Effects of SCS and SCS-F2 on colonic aberrant crypt foci in mice

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以SCS為原料，以結(jié)直腸癌細(xì)胞抑制率為指標(biāo)，利用酶解法和響應(yīng)面法結(jié)合的手段，確定最佳酶解制備條件，通過(guò)凝膠層析色譜，分離純化出具有高活性的低分子質(zhì)量SCS；采用小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)，對(duì)SCS-F2的食用安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，制備的低分子質(zhì)量SCS具有較高的抑制結(jié)直腸癌增殖活性，且無(wú)毒副作用，在1 000 μg/（g·d）劑量下滿足保健食品的要求。本研究為開(kāi)發(fā)高活性、低分子質(zhì)量SCS的制備和研究提供新思路，初步了解SCS是否具有食用安全性，為SCS相關(guān)產(chǎn)品的日后開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。