大鯢皮膠原抗氧化肽的制備及分離純化

周艷華，郟修齊，李 濤，王建文，羅慶華

（1.長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.張家界金鯢生物產(chǎn)品開發(fā)有限公司，湖南 張家界 427000；3.湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410111；4.長沙學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 長沙 410022）

中國大鯢（Andrias davidianus）俗稱娃娃魚，是國家二級保護(hù)動物[1]。大鯢營養(yǎng)價值高，我國在20世紀(jì)60年代開始對大鯢進(jìn)行人工養(yǎng)殖[2]，在過去數(shù)十年間，大鯢養(yǎng)殖數(shù)量得到了空前發(fā)展。大鯢養(yǎng)殖數(shù)量的增長，促進(jìn)了大鯢的精深加工，同時也產(chǎn)生了大量加工副產(chǎn)物大鯢皮。大鯢皮大量丟棄不僅會對環(huán)境造成污染，也是對資源的極度浪費(fèi)。大鯢皮富含膠原蛋白，關(guān)于從大鯢皮中提取膠原蛋白的研究已有報(bào)道，周艷華等[3-4]采用胃蛋白酶從干制大鯢皮中提取膠原蛋白，采用干制粉碎、勻漿等工藝，大大地提高了大鯢皮膠原蛋白的提取率，其提取率可高達(dá)86.7%，提取得到的膠原蛋白具有較為完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)。顧賽麒等[5]采用乙酸、胃蛋白酶提取大鯢皮分別得到了酸溶性和酶溶性膠原蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均為Ⅰ型膠原蛋白。楊碧仙等[6]采用鹽酸提取大鯢皮中的膠原蛋白，其得率為40.2%。這些研究都為大鯢皮膠原蛋白的后續(xù)開發(fā)利用提供了可能。

自由基是存在于人體內(nèi)的一種有害基團(tuán)，當(dāng)自由基在人體中不斷累積達(dá)到一定量時，就會引發(fā)感冒、衰老、癌癥等[7]，因此需要不斷清除人體內(nèi)的自由基?？寡趸钚砸话闶侵溉梭w清除自由基的能力[8]，目前，抗氧化活性的研究主要集中在生物活性肽[9-12]、黃酮類化合物[13]、酚類化合物[14]以及其他物質(zhì)[15-16]的抗氧化活性研究。

大鯢皮中富含膠原蛋白，目前從大鯢皮中提取膠原蛋白研究其肽的抗氧化活性的報(bào)道較少，且關(guān)于大鯢皮膠原蛋白肽分離純化和抗氧化機(jī)理等方面的研究也存在不足。因此，本研究從大鯢皮中提取膠原蛋白，并對膠原抗氧化肽的制備工藝進(jìn)行研究，以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為評價指標(biāo)評價其抗氧化活性，在單因素分析基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化大鯢皮膠原蛋白制備抗氧化肽的工藝條件。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用超濾、凝膠色譜等技術(shù)對大鯢皮膠原抗氧化肽進(jìn)行分離純化，分析其抗氧化活性與氨基酸組成之間的關(guān)系，以探尋大鯢皮膠原抗氧化肽的抗氧化機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鯢皮 張家界金鯢生物股份有限公司；羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH、胃蛋白酶（250 U/mg） 美國Sigma公司；透析袋 上海源葉生物科技有限公司；堿性蛋白酶（20 萬U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；中空纖維超濾膜（分子質(zhì)量分別為6、3 kDa）、葡聚糖凝膠樹脂Sephadex G-25 美國Pharmacia公司；乙酸、氫氧化鈉、正丁醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR-2140電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；1-4LD型冷凍干燥機(jī) 德國Alpha公司；Avanti J-26XP冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；PHS-3C型精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；DK-98-11A恒溫水浴鍋、FW100萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；FYL-C020E料理機(jī) 九陽股份有限公司；UV1800紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；HDB-7L核酸蛋白檢測儀、CBS-A程控多功能全自動部分收集器上海滬西分析儀器有限公司；L-8800型氨基酸分析儀日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 大鯢皮膠原蛋白制備

參考周艷華等[3]的方法，具體工藝流程如下：大鯢皮→剪成小塊→60 ℃烘干→粉碎→加入0.1 mol/L NaOH去除雜蛋白→加入10%正丁醇去除脂肪→加入0.5 mol/L乙酸溶脹24 h→搗碎→大鯢皮勻漿液→加入胃蛋白酶→酶解液→鹽析→膠原蛋白粗品→透析→膠原蛋白提取液→冷凍干燥→大鯢皮膠原蛋白成品。

1.3.2 大鯢皮膠原肽的制備

參考文獻(xiàn)[17]的方法，具體操作流程如下：取5 g大鯢皮膠原蛋白加入100 mL蒸餾水制成懸浮液→調(diào)節(jié)pH值→加入堿性蛋白酶→恒溫水浴酶解→滅酶（90 ℃，10 min）→離心（5 000 r/min，10 min）→取上清液→濃縮→冷凍干燥→大鯢皮膠原肽。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

在底物質(zhì)量濃度5 g/100 mL條件下，分別考察酶添加量（5 000、6 000、7 000、8 000、9 000 U/g）、pH值（7.5、8.0、8.5、9.0、9.5）、酶解時間（1、2、3、4、5、6 h）、酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）對DPPH自由基清除率的影響，確定最適制備條件。

1.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以DPPH自由基清除率為評價指標(biāo)，對酶添加量、酶解pH值、酶解溫度和酶解時間4 個因素設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，確定酶解的最佳工藝條件，各因素及水平表如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Code and level of independent variables used for orthogonal array design

1.3.5 大鯢皮膠原抗氧化肽超濾分離純化

采用不同分子質(zhì)量（6、3 kDa）的超濾膜對大鯢皮膠原肽進(jìn)行超濾，分別收集不同分子質(zhì)量（＞6、3～6、＜3 kDa）的組分，并命名為組分P1、P2、P3。將收集的3 個不同分子質(zhì)量的組分經(jīng)濃縮后冷凍干燥，保存?zhèn)溆?。將組分P1、P2、P3溶解（質(zhì)量濃度為5 mg/mL，下同），以DPPH自由基清除率為指標(biāo)評價其抗氧化活性，分別測定其抗氧化活性。

1.3.6 大鯢皮膠原抗氧化肽凝膠色譜分離純化

采用凝膠色譜技術(shù)，通過Sephadex G-25分離純化，以去離子水為洗脫液洗脫樣品，每5 min收集一管樣品，采用核酸蛋白檢測儀在220 nm處測定樣品的吸光度，得到樣品洗脫曲線，根據(jù)樣品洗脫曲線收集不同組分的樣品，經(jīng)濃縮后冷凍干燥。以DPPH自由基清除率為評價指標(biāo)，進(jìn)一步測定經(jīng)Sephadex G-25分離純化后各組分的抗氧化活性。

1.3.7 大鯢皮膠原抗氧化肽氨基酸組成分析

將經(jīng)凝膠色譜分離純化后抗氧化活性最強(qiáng)的大鯢膠原抗氧化目標(biāo)肽按照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》方法，采用氨基酸自動分析儀測定其氨基酸組成。

1.3.8 大鯢皮膠原蛋白提取率的測定

參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》進(jìn)行羥脯胺酸含量測定。膠原蛋白質(zhì)量（g）由其所含的羥脯氨酸質(zhì)量乘以換算系數(shù)（11.1）得到。大鯢皮膠原蛋白提取率按下式計(jì)算。

式中：m1為酶解液中羥脯氨酸質(zhì)量/g；m2為大鯢皮中膠原蛋白質(zhì)量/g；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.9 大鯢皮膠原肽抗氧化活性的測定

以DPPH自由基清除率為指標(biāo)評價其抗氧化活性。DPPH自由基清除率測定方法參照GB/T 39100—2020《多肽抗氧化性測定DPPH和ABTS法》。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳堿性蛋白酶添加量的確定

由圖1可知，當(dāng)堿性蛋白酶添加量為5 000～8 000 U/g時，隨著酶添加量的增加，大鯢皮膠原肽抗氧化活性增長較快，差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)酶添加量達(dá)到8 000 U/g之后，其抗氧化活性增長趨于平緩。這是由于在酶解過程中，隨著酶添加量的增加，酶與大鯢皮膠原蛋白不斷反應(yīng)，產(chǎn)生小分子肽，隨著小分子肽數(shù)量的增加，其抗氧化活性也逐漸增強(qiáng)[18]。然而，當(dāng)酶添加量達(dá)到8 000 U/g之后，由于堿性蛋白酶與大鯢皮膠原蛋白基本反應(yīng)完全，因此，當(dāng)酶添加量繼續(xù)增加時，其抗氧化活性的增長亦趨于平穩(wěn)。從經(jīng)濟(jì)因素考慮，選擇酶添加量為8 000 U/g為宜。

圖1 堿性蛋白酶添加量對大鯢皮膠原肽抗氧化活性的影響Fig. 1 Effect of alkaline protease dosage on the DPPH radical scavenging activity of antioxidant peptides from giant salamander skin collagen

2.2 最佳酶解pH值的確定

由圖2 可知，隨著酶解液p H 值的增加，大鯢皮膠原肽抗氧化活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢。酶解pH值為7.5～8.0時，DPPH自由基清除率顯著上升（P＜0.05）；pH 8.0～9.0時，DPPH自由基清除率顯著上升（P＜0.05）；當(dāng)酶解液pH 9.0時，其抗氧化活性最高。這可能與堿性蛋白酶在pH 9.0時酶活性高有關(guān)。當(dāng)酶活性較高時，其作用于大鯢皮膠原蛋白的位點(diǎn)較多，產(chǎn)生的大鯢皮膠原小分子肽數(shù)量增多，其清除DPPH自由基的活性增強(qiáng)，因此，抗氧化活性也增強(qiáng)[17]。

圖2 pH值對大鯢皮膠原肽抗氧化活性的影響Fig. 2 Effect of pH on the DPPH radical scavenging activity of antioxidant peptides from giant salamander skin collagen

2.3 最佳酶解時間的確定

由圖3可知，酶解1～4 h時，隨著酶解時間的延長，大鯢皮膠原肽抗氧化活性顯著增加（P＜0.05）；當(dāng)酶解時間達(dá)到4 h后，抗氧化活性增長趨于平緩。這是由于在酶解過程中，隨著酶解時間延長，酶與底物大鯢皮膠原蛋白不斷反應(yīng)，產(chǎn)生小分子肽，隨著小分子肽數(shù)量的增加，其抗氧化活性也逐漸增強(qiáng)[19]。此外，當(dāng)酶解時間達(dá)到4 h之后，由于堿性蛋白酶與大鯢皮膠原蛋白基本反應(yīng)完全，因此，當(dāng)酶解時間繼續(xù)延長時，抗氧化活性的增長亦趨于平穩(wěn)。因此，從經(jīng)濟(jì)因素考慮，選擇酶解時間4 h為宜。

圖3 酶解時間對大鯢皮膠原肽抗氧化活性的影響Fig. 3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the DPPH radical scavenging activity of antioxidant peptides from giant salamander skin collagen

2.4 最佳酶解溫度的確定

由圖4可知，隨著酶解溫度的增加，大鯢皮膠原肽抗氧化活性先升后降。根據(jù)單因素方差分析可知，在溫度為40～55 ℃時，DPPH自由基清除率顯著上升；當(dāng)酶解溫度為55 ℃時，DPPH自由基清除率最高，抗氧化活性最高。這可能與堿性蛋白酶在溫度為55 ℃時其酶活性高有關(guān)。當(dāng)酶活性高時，產(chǎn)生的小分子肽數(shù)量增多，其清除DPPH自由基的活性也隨之增強(qiáng)，因此，其抗氧化活性也增加[20]。

圖4 酶解溫度對大鯢皮膠原肽抗氧化活性的影響Fig. 4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the DPPH radical scavenging activity of antioxidant peptides from giant salamander skin collagen

2.5 堿性蛋白酶酶解大鯢皮膠原蛋白制備抗氧化肽工藝條件正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素的基礎(chǔ)上，根據(jù)上述制定的因素和水平表，以DPPH自由基清除率為評價指標(biāo)，對酶添加量（A）、酶解pH值（B）、酶解溫度（C）和酶解時間（D）4 個因素設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and experimental results

由正交試驗(yàn)極差值可知，影響DPPH自由基清除率各因素的主次關(guān)系為：酶解時間＞酶解溫度＞酶添加量＞酶解pH值，酶解時間對大鯢皮膠原肽抗氧化活性影響最顯著。由表2可知，大鯢皮膠原抗氧化肽酶解的最佳條件組合為A3B2C2D3，即酶添加量9 000 U/g、酶解pH 9.0、酶解溫度55 ℃、酶解時間5 h，在此工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，最終得到大鯢皮膠原肽DPPH自由基清除率為42.5%。此外，從環(huán)保和節(jié)能的角度考慮，進(jìn)一步優(yōu)化酶解條件組合，即A2B2C2D2（酶添加量8 000U/g、酶解pH 9.0、酶解溫度55 ℃、時間4 h），在此基礎(chǔ)下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明大鯢皮膠原肽DPPH自由基清除率為40.2%。

大鯢皮膠原蛋白肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性。周艷華等[17]的研究中，大鯢皮膠原肽抗氧化活性以羥自由基為評價指標(biāo)，對酶解工藝進(jìn)行了研究，但未對其他自由基進(jìn)行評價，且研究只對初步酶解進(jìn)行研究，并未涉獵后續(xù)分離純化，因此對其清除羥自由基的作用機(jī)理尚不清晰。本研究進(jìn)一步以DPPH自由基清除能力為評價指標(biāo)研究了大鯢皮膠原蛋白肽抗氧化活性，得到最適酶解工藝。

2.6 大鯢皮膠原抗氧化肽超濾分離純化

超濾是一種根據(jù)被分離物分子質(zhì)量大小不同而實(shí)現(xiàn)分離純化的技術(shù)[21]。通過試驗(yàn)優(yōu)化，在酶添加量8 000 U/g、酶解pH 9.0、酶解溫度55 ℃、酶解時間4 h條件下制備大鯢皮膠原抗氧化肽，其清除DPPH自由基的活性較高。將其通過不同分子質(zhì)量（6、3 kDa）的超濾膜，得到3 個組分P1（＞6 kDa）、P2（3～6 kDa）、P3（＜3 kDa）。以DPPH自由基清除率為評價指標(biāo)，分別測定組分P1、P2、P3的抗氧化活性。由表3可知，P3具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其抗氧化活性明顯高于原酶解液和其他2 個組分。P1、P2、P3抗氧化活性存在差異，這可能與堿性蛋白酶作用于不同的酶切位點(diǎn)，其酶解產(chǎn)物暴露出不同的氨基酸殘基有關(guān)[22]。經(jīng)對比，P3的抗氧化活性比原酶解液提高16.5%。表明通過超濾，大鯢皮膠原小分子肽具有更高的抗氧化活性。這一結(jié)果與先前研究結(jié)果相符，小分子肽具有更強(qiáng)的抗氧化活性[23-25]。因此，將超濾組分P3繼續(xù)進(jìn)行下一步的分離純化。

表3 超濾組分的抗氧化活性Table 3 Antioxidant activity of ultrafiltration filtrations

2.7 大鯢皮膠原抗氧化肽凝膠色譜分離純化

采用凝膠色譜技術(shù)分離，通過Sephadex G-25分離純化P3，得到3 個組分SP1、SP2、SP3，以DPPH自由基清除率為評價指標(biāo)，分別測定組分SP1、SP2、SP3的抗氧化活性。由表4可知，SP3具有較強(qiáng)的抗氧化活性，DPPH自由基清除率為72.3%，高于純化前的P3。表明通過凝膠色譜分離純化技術(shù)，大鯢皮膠原小分子肽進(jìn)一步得到純化，具有更高的抗氧化活性。肽是介于蛋白質(zhì)與氨基酸的中間產(chǎn)物，肽的分子質(zhì)量不同，其生理活性也存在差異。一般認(rèn)為，小分子肽具有更強(qiáng)的生理活性。凝膠色譜分離技術(shù)根據(jù)分子質(zhì)量大小對不同對物質(zhì)進(jìn)行分離，分子質(zhì)量大的物質(zhì)先出峰，分子質(zhì)量小則后出鋒。根據(jù)凝膠色譜圖可以看出SP3相對分子質(zhì)量更?。▓D5）。通過測定抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)其抗氧化活性更高，與小分子肽具有更強(qiáng)的抗氧化活性的結(jié)果一致。

圖5 大鯢皮膠原抗氧化肽凝膠色譜分離純化Fig. 5 Gel permeation chromatogram of antioxidant peptides from giant salamander skin collagen

表4 凝膠色譜組分的抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of gel chromatography fractions

2.8 大鯢皮膠原抗氧化肽氨基酸組成分析

采用氨基酸自動分析儀技術(shù)進(jìn)一步分析SP3的氨基酸組成。由表5可知，大鯢皮膠原抗氧化肽氨基酸組成中，甘氨酸、脯氨酸含量較高，胱氨酸含量較低，這一特征符合膠原抗氧化肽的氨基酸組成特征[26]。除甘氨酸、脯氨酸含量較高外，大鯢皮膠原蛋白抗氧化肽中還含有較高含量的丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、亮氨酸等氨基酸。據(jù)報(bào)道，具有疏水性氨基酸（亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸）、芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸，組氨酸）、含硫氨基酸（胱氨酸、甲硫氨酸）、酸性氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸）和堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸）的肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性[27-31]。這可能是大鯢皮膠原抗氧化肽SP3具有較高抗氧化活性的原因。

表5 大鯢皮膠原抗氧化肽SP3的氨基酸組成分析Table 5 Analysis of amino acid composition of antioxidant peptide SP3

3 結(jié) 論

本研究以DPPH自由基清除率為指標(biāo)評價大鯢皮膠原抗氧化肽抗氧化活性，確定了制備大鯢皮膠原抗氧化肽的最適工藝條件：酶添加量8 000 U/g、酶解pH 9.0、酶解溫度55 ℃、酶解時間4 h。在此工藝條件下，大鯢皮膠原抗氧化肽DPPH自由基清除率為40.2%。采用超濾分離得到3 個分子質(zhì)量不同的組分，結(jié)果表明，P3（＜3 kDa）具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其DPPH自由基清除率為56.7%。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用凝膠色譜技術(shù)分離，通過Sephadex G-25分離純化P3，得到3 個不同分子質(zhì)量大小的組分，其中SP3具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其DPPH自由基清除率為72.3%。最后采用氨基酸自動分析儀技術(shù)進(jìn)一步分析SP3的氨基酸組成，探尋大鯢皮膠原肽抗氧化活性與其氨基酸組成之間的內(nèi)在聯(lián)系，結(jié)果表明大鯢皮膠原抗氧化肽氨基酸組成中，甘氨酸、脯氨酸含量較高，胱氨酸含量較低，這一特征符合膠原抗氧化肽的氨基酸組成特征。除了甘氨酸、脯氨酸含量較高外，大鯢皮膠原蛋白抗氧化肽中還含有較高含量的具有明顯抗氧化活性的丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、亮氨酸等氨基酸，這可能是大鯢皮膠原抗氧化肽SP3具有較高抗氧化活性的原因。后續(xù)研究可采用DNA翻譯、肽測序儀、電噴霧電離和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜等技術(shù)[32]分析SP3的肽序列，以進(jìn)一步探尋大鯢皮膠原抗氧化肽的抗氧化機(jī)理。