無(wú)患子嫁接口愈合與內(nèi)源激素的關(guān)系※

●張佳興 盧俊杰 楊 琪 朱太富 蘇效蘭 羅筱韓，3 王連春※※

（1．西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 云南 昆明 650224；2．西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南 昆明 650224；3．中國(guó)前寒武系省級(jí)地質(zhì)自然保護(hù)區(qū)管護(hù)局 云南 昆明 650600）

無(wú)患子（Sapindus mukorossi）又名木患子、洗手果等，在中國(guó)主要分布于云南、貴州、四川等地[1]，是我國(guó)特有的落葉喬木植物資源。同時(shí)無(wú)患子是一種多用途物種，其用途有生物質(zhì)能源、天然洗滌原料[2-4]、藥用[5-8]、水土保持[7]、環(huán)保[10]等。然而無(wú)患子種植中大多數(shù)為綠化林且效益不可觀，90%以上苗木都是靠母樹種子直接播種培育的實(shí)生苗[10]；另外，市場(chǎng)上無(wú)患子嫁接苗、扦插苗不足10%，遠(yuǎn)不能滿足其大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需求[12]。嫁接體愈合是實(shí)現(xiàn)無(wú)患子規(guī)?；N植的前提，目前對(duì)于無(wú)患子嫁接沙藏愈合鮮有研究，因此，本試驗(yàn)以無(wú)患子母樹上無(wú)病害、生長(zhǎng)健壯的當(dāng)年生枝條分別作砧木和穂條進(jìn)行嫁接并沙藏。對(duì)嫁接體嫁接愈合過(guò)程中砧穂IAA、ABA、GA3的含量以及相互作用的關(guān)系進(jìn)行研究，探究嫁接體對(duì)不同激素含量及其比例的響應(yīng)，以期確定對(duì)愈合起著關(guān)鍵作用的內(nèi)源激素種類和濃度，為今后無(wú)患子嫁接的推廣提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于西南林業(yè)大學(xué)溫室大棚，屬于昆明市盤龍區(qū)。該區(qū)海拔1945 m，全年溫差較小，區(qū)內(nèi)年平均氣溫15℃，最熱月、最冷月平均氣溫分別為19℃和7.6℃。于2022年4月17日開展嫁接試驗(yàn)，溫室大棚內(nèi)白天的平均溫度26℃，夜間平均溫度16℃。

1.2 試驗(yàn)材料

砧木和接穗均采自西南林業(yè)大學(xué)培育的優(yōu)良無(wú)性系生長(zhǎng)健壯的母樹；砧木選取當(dāng)年生無(wú)病害枝條，長(zhǎng)度20 cm左右，至少3個(gè)芽點(diǎn)，粗度1 cm左右；接穗選用無(wú)患子生長(zhǎng)健壯、葉芽飽滿、5 cm左右的當(dāng)年生枝條。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2022年4月17日嫁接，采用切接的方法進(jìn)行無(wú)患子枝條與枝條的嫁接，完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，共嫁接150株。嫁接后在接穗和砧木的結(jié)合處用無(wú)菌紗布綁扎固定，并且露出穂芽部位。嫁接完畢后將嫁接體與地面呈90°擺放進(jìn)行沙藏。沙床布置在西南林業(yè)大學(xué)溫室大棚內(nèi)。白天溫度25～28℃，夜間15～18℃。沙床厚30 cm，長(zhǎng)寬均為50 cm，沙子的含水量以用手握緊沙子手指縫不滴水，手松開后沙子成團(tuán)而不散開為宜。沙藏完畢后在沙床上方蓋上遮陰網(wǎng)。最后按常規(guī)管理至嫁接口完全愈合。

1.4 測(cè)定方法

內(nèi)源激素測(cè)定方法參考李佳蔓[16]方法，略有改動(dòng)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采 用Excel 2019、Origin 2018、SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、畫圖以及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)患子嫁接愈合中砧木和接穗內(nèi)源激素含量變化

2.1.1 激素IAA含量變化特點(diǎn)IAA激素含量變化，見圖1。無(wú)患子砧木和接穗中IAA最初含量分別為459.23，549.76 ng/g。嫁接后4 d時(shí)達(dá)到最低水平，分別為105.39，160.17 ng/g。說(shuō)明無(wú)患子嫁接體在產(chǎn)生愈傷組織的過(guò)程中傷口處有較大的消耗；之后隨著時(shí)間推移，嫁接后的IAA含量呈波動(dòng)上升，32 d時(shí)含量最高，砧木和接穗IAA的濃度分別為416.58，502.42 ng/g?？傮w來(lái)看，無(wú)患子砧穗IAA含量變化趨勢(shì)大體一致，都呈先下降后上升的趨勢(shì)。說(shuō)明砧穗之間發(fā)揮著基本相同的作用。

圖1 砧木、接穗IAA含量

2.1.2 激素ABA含量變化特點(diǎn)ABA激素含量變化，見圖2。砧木ABA含量呈先上升后下降的起伏變化。砧木ABA的最初含量為50.27 ng/g，嫁接產(chǎn)生傷口后有一段時(shí)間小幅度的增長(zhǎng)積累，11 d時(shí)稍有回落，推測(cè)是由于ABA合成受阻促進(jìn)愈傷組織形成。砧木始終表現(xiàn)出ABA含量升高的趨勢(shì)可能是根系在植株處于逆境中生成的ABA通過(guò)木質(zhì)部導(dǎo)管向地上部運(yùn)輸被隔斷導(dǎo)致的積累。接穗中的ABA含量呈先下降后上升的趨勢(shì)。最初的含量為206.15 ng/g，在歷經(jīng)創(chuàng)傷后一直到第4天都表現(xiàn)出急速下降的狀態(tài)。在第4天的時(shí)候含量最低，為122.46 ng/g。說(shuō)明嫁接體傷口氧化應(yīng)激時(shí)會(huì)大量消耗ABA。

圖2 砧木、接穗 ABA含量

2.1.3 激素GA3含量變化特點(diǎn)GA3含量變化， 見圖3，砧木中的GA3含量最初為1467.95 ng/g，之后一直到第4天ABA含量整體表現(xiàn)出了波動(dòng)下降的趨勢(shì)，最低含量為650.81 ng/g。這是因?yàn)镚A3為了在砧穗間啟動(dòng)嫁接體傷口重連過(guò)程而進(jìn)行了降解。在之后的過(guò)程中，GA3整體波動(dòng)較大但總體的變化是呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明GA3加速次生結(jié)構(gòu)生成，有利于嫁接體重建體構(gòu)成。接穗中的GA3含量變化跟砧木有所不同，呈先上升后下降，最低含量為2572.17 ng/g，最高含量為4471.36 ng/g。從圖3中可明顯觀察到，接穗中GA3的含量整體要比砧木高許多。

圖3 砧木、接穗GA3含量

2.1.4 激素IAA/ABA、GA3/ABA、以及GA3/IAA比值變化特點(diǎn)由圖4可知，砧木與接穗的IAA/ABA比值變化大致相同，都是呈先下降后上升的波動(dòng)趨勢(shì)。0～4 d時(shí)，砧木由于嫁接后受到損傷，ABA含量增強(qiáng)同時(shí)IAA含量被消耗，符合IAA與ABA拮抗作用機(jī)理。11 d之后隨著比值增加，IAA含量由于積累而增大、ABA含量減少，有利于細(xì)胞增殖分裂及木質(zhì)部與韌皮部的連接。接穗的IAA/ABA比值的走向比較穩(wěn)定，說(shuō)明穩(wěn)定的內(nèi)源激素水平對(duì)嫁接后的植株生長(zhǎng)不可或缺。由圖5可知，在砧木與接穗的GA3/ABA比值總體呈先下降后上升的趨勢(shì)，4 d后比值波動(dòng)性上升，這與高比值GA3/ABA能激發(fā)形成層細(xì)胞活躍狀態(tài)有關(guān)。接穗中，最初連續(xù)4 d的比值呈曲折上升趨勢(shì)，之后于砧木的比值呈現(xiàn)出來(lái)的趨勢(shì)大體相同。整個(gè)過(guò)程處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。

圖4 砧木、接穗IAA/ABA含量

圖5 砧木、接穗GA3/ABA含量

由圖6可知，砧木和接穗GA3/IAA比值的變化特點(diǎn)大致相同，都是波動(dòng)性上升然后下降。0～4 d，砧木中的GA3含量增加是為了減輕抑制促進(jìn)細(xì)胞增殖分化與植株生長(zhǎng)的作用。之后二者比值下降是由于隨著時(shí)間的推移IAA的含量逐漸積累。

圖6 砧木、接穗GA3/IAA含量

2.2 嫁接愈合過(guò)程中內(nèi)源激素含量相關(guān)性分析

相比于單一激素含量，不同內(nèi)源激素含量于植物生長(zhǎng)的關(guān)系更加緊密。對(duì)嫁接愈合整個(gè)過(guò)程砧木和接穗中IAA、ABA、GA3的含量進(jìn)行相關(guān)性分析，由表1可知，砧木中IAA與GA3、GA3與IAA/ABA都存在顯著正相關(guān)關(guān)系。相關(guān)系數(shù)分別為0.828和0.757，因此認(rèn)為它們之間存在相互調(diào)控的作用。同時(shí)，IAA與IAA/ABA、IAA與GA3/ABA、GA3與GA3/ABA，以及IAA/ABA與GA3/ABA都存在極為顯著正相關(guān)關(guān)系。相關(guān)系數(shù)分別為0.953，0.835，0.924，0.878。由表2可知，接穗中，IAA與ABA、IAA與IAA/ABA都存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.884和0.951；另外，ABA與IAA/ABA、GA3/ABA與GA3/IAA都存在顯著正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明IAA能夠正反饋調(diào)節(jié)IAA的生物合成與積累。

表1 嫁接愈合過(guò)程中砧木內(nèi)源激素的相關(guān)分析

表2 嫁接愈合過(guò)程中接穗內(nèi)源激素的相關(guān)分析

3 討論

3.1 嫁接愈合過(guò)程中內(nèi)源激素的探討

嫁接愈合的時(shí)間會(huì)隨著種類、樹齡、嫁接時(shí)期及部位不同而存在一定差異；不同研究者對(duì)嫁接愈合階段的劃分不同，但愈合過(guò)程都會(huì)經(jīng)歷隔離層形成、愈傷組織形成、形成層分化及維管輸導(dǎo)組織形成等階段，兗攀等[19]。植物激素是嫁接體發(fā)育的控制因子之一[20]。落葉喬木千年桐的研究表明，嫁接口愈合過(guò)程經(jīng)歷了5個(gè)階段，分別是隔離層形成期、愈傷組織分化形成期、愈傷組織連接期、形成層分化連接期和維管組織分化形成期[21]。嫁接當(dāng)天，砧木和接穗都處于峰值，推測(cè)是由于嫁接后的機(jī)械損傷短暫性的引起積累，之后隨著嫁接口的劇烈反應(yīng)，連續(xù)4 d呈現(xiàn)急劇下降趨勢(shì)，砧穂IAA含量都在第4天達(dá)到谷值，此時(shí)對(duì)應(yīng)上隔離層形成時(shí)期。砧木和接穗IAA含量在嫁接后18 d和32 d處于峰值；ABA含量在砧木中嫁接后4、18和32 d處于峰值，在接穗中11、18和32 d處于峰值，且第32天含量最高。GA3含量在砧木中嫁接后11 d和25 d處于峰值，且第25天含量最高；在接穗中呈波動(dòng)性上升，且第32天含量最高。無(wú)患子嫁接愈合過(guò)程中3種激素的動(dòng)態(tài)變化呈現(xiàn)出“V”形。嫁接后32 d IAA和GA3含量均達(dá)到最大值，有利于形成維管組織。這與盧善發(fā)的研究結(jié)果相似[20]。嫁接后4 d內(nèi)ABA含量逐漸下降，這與IAA的變化趨勢(shì)基本一致。且之后的關(guān)鍵時(shí)期，IAA和ABA激素含量呈動(dòng)態(tài)上升，推測(cè)ABA也可能對(duì)嫁接愈合作出了貢獻(xiàn)[22]。圖1～圖3所呈現(xiàn)的變化特點(diǎn)證實(shí)了砧木和接穗IAA、ABA、GA3的含量變化都會(huì)影響無(wú)患子嫁接愈合的進(jìn)程。

IAA通過(guò)影響維管束橋形成時(shí)間和數(shù)目以及連接砧木和接穗的管狀分子數(shù)目影響嫁接體發(fā)育[22-24]。在嫁接后的初期觀察到砧木與接穗之間IAA差異較大，之后隨著時(shí)間推移，直至32 d砧木與接穗的含量差異才越來(lái)越小。高含量的IAA會(huì)增加次生木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞的數(shù)量，大量使用同時(shí)誘導(dǎo)韌皮部和木質(zhì)部出現(xiàn)。本試驗(yàn)中，雖然砧木和接穗IAA含量存在差異，但上下部IAA含量的積累和消耗反應(yīng)是相似的。ABA在嫁接愈合的全程都發(fā)揮著作用，砧木和接穗整體的起伏變化相似，相對(duì)于IAA來(lái)說(shuō)ABA的表達(dá)量不高，后期高水平ABA 有利于由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化[25]，符合后期ABA波動(dòng)上升的趨勢(shì)。研究表明GA3能促進(jìn)植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和防止植物器官脫落[26]。GA3能通過(guò)調(diào)節(jié)周質(zhì)維管的排列，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式[27]。這驗(yàn)證了嫁接后期GA3含量達(dá)到升高，在第32天達(dá)到峰值。此時(shí)該嫁接體處于維管束分化階段。

3.2 嫁接愈合過(guò)程中內(nèi)源激素含量相關(guān)性的探討

植物內(nèi)源激素對(duì)生理現(xiàn)象的影響，不僅表現(xiàn)在其絕對(duì)含量的高低，而且與各種激素間的相對(duì)比值密切相關(guān)，各激素間相克相成，并不是單一激素起作用，而是多種激素共同作用的結(jié)果，特別是促進(jìn)與抑制生長(zhǎng)激素的平衡對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生重要作用[28]。該試驗(yàn)對(duì)無(wú)患子嫁接愈合中砧木和接穗中的3種激素IAA、ABA和GA3進(jìn)行相關(guān)性分析，砧木中：發(fā)現(xiàn)三種激素都存在相關(guān)性，但是IAA與GA3相關(guān)性更強(qiáng)，研究表明，GA3能促進(jìn)IAA的合成，同時(shí)施加外源GA3能夠增加內(nèi)源IAA含量同時(shí)降低ABA的含量。嫁接后的維管束重新連接及細(xì)胞分裂重接都離不開GA3激素的影響[29]。接穗中：3種激素中相關(guān)性更強(qiáng)的是IAA與ABA。IAA主要是促生長(zhǎng)功能，而ABA作為一種抗逆境的激素，在嫁接初期發(fā)生機(jī)械損傷后，會(huì)消耗一些ABA抵抗逆境。之后隨著嫁接愈合ABA的消耗量變少，逐漸產(chǎn)生積累。對(duì)3個(gè)激素之間比值進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，IAA/ABA、GA3/ABA以及GA3/IAA之間存在很明顯的相關(guān)性，說(shuō)明它們顯著影響著嫁接愈合的過(guò)程。不同激素之間的協(xié)同和拮抗作用機(jī)理在此表現(xiàn)的淋漓盡致。砧木和接穗IAA/ABA的比值變化趨勢(shì)基本一致，其中IAA的降低和ABA的升高正體現(xiàn)了拮抗作用。GA3/ABA比值在砧木和接穗中呈現(xiàn)了動(dòng)態(tài)平衡的特點(diǎn)。而GA3與IAA變化特點(diǎn)與前面幾組都不同，砧木和接穗變化趨勢(shì)基本一致，都是波動(dòng)性上升后下降，這個(gè)特點(diǎn)凸顯了2種激素的協(xié)同作用。筆者的研究只針對(duì)無(wú)患子嫁接體愈合砧、穗部位的3種內(nèi)源激素IAA、ABA和GA3，通過(guò)對(duì)它們的動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)進(jìn)行分析。

4 結(jié)論

在嫁接愈合的關(guān)鍵階段，選擇適當(dāng)適量的內(nèi)源激素有利于提高嫁接的成功。一方面可選用高濃度的激素GA3對(duì)嫁接體進(jìn)行處理；另一方面，也可選用高濃度的IAA。最后注意嫁接后的養(yǎng)護(hù)管理。