活性氧抗菌機(jī)理及其研究進(jìn)展

陳媛媛，唐曉寧?，崔 帥，馬 浩，孫佳慧

1) 昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，昆明 650500 2) 云南工商學(xué)院，昆明 651701

隨著自然環(huán)境保護(hù)力度的加大以及人們健康安全意識(shí)的提高，生活中抗菌劑的使用越來(lái)越廣泛，對(duì)于抗菌材料的設(shè)計(jì)研發(fā)以及抗菌機(jī)理的分析研究也在不斷地取得進(jìn)展.按照作用活性成分不同，抗菌劑分為有機(jī)、無(wú)機(jī)以及有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)合型三類(lèi)抗菌劑.相較于有機(jī)抗菌劑中的陽(yáng)離子吸附型殺菌[1]和無(wú)機(jī)抗菌劑中的直接接觸型殺菌以及離子滲透型殺菌[2]，活性氧抗菌由于具有高效持久、良好的生物相容性和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛重視，其涉及的領(lǐng)域包括生物醫(yī)學(xué)[3]、遺傳學(xué)[4]及環(huán)境保護(hù)[5]等.活性氧主要來(lái)源于催化材料受光激發(fā)的表面高活性反應(yīng)區(qū)域[6-7]，是催化反應(yīng)過(guò)程中光生電子/空穴與O2和H2O 之間的氧化還原反應(yīng)中間產(chǎn)物，具有較高的反應(yīng)活性.其抗菌過(guò)程實(shí)質(zhì)是活性氧與生物分子內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)之間不平衡而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷[8]，例如活性氧與細(xì)胞膜局部反應(yīng)造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，增強(qiáng)了膜滲透性而引起胞內(nèi)物質(zhì)泄露；也可以使DNA 鍵斷裂而破壞基因表達(dá)，以及引發(fā)功能蛋白失活等結(jié)果[9-10]，最終導(dǎo)致了細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制和死亡.近期的主要研究已經(jīng)表明[10-12]，不同構(gòu)造的催化材料對(duì)于活性氧的產(chǎn)量和種類(lèi)具有顯著影響，不同種類(lèi)的活性氧在穩(wěn)定性和抗菌表現(xiàn)上也有明顯的區(qū)別，值得認(rèn)真分析討論.因此本文從活性氧的產(chǎn)生方式、化學(xué)作用以及抗菌機(jī)理等方面進(jìn)行總結(jié)，尤其介紹了主要活性氧物種之間的轉(zhuǎn)化過(guò)程以及抗菌過(guò)程中常用的檢測(cè)分析方法，希望能對(duì)活性氧抗菌機(jī)理的分析和光催化材料的設(shè)計(jì)提供幫助.

1 活性氧

活性氧（Reactive oxygen species，ROS）是由光催化材料表面上的光生電子（e-）和空穴（h+）這一類(lèi)具有高能量的載流子與含氧分子反應(yīng)所生成的氧化還原產(chǎn)物，具有較高的反應(yīng)活性[2,10,12].主要的活性氧種類(lèi)包括以下4 種，分別是超氧陰離子自由基（）、過(guò)氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧（1O2）和羥基自由基（·OH）.除了這四種主要的ROS，還有臭氧（O3）和脂類(lèi)過(guò)氧化RO·（烷氧基）、ROO·（烷過(guò)氧基）、ROOH·（氫過(guò)氧化物）[13]等，其中脂類(lèi)過(guò)氧化物是由亞油酸等不飽和脂肪酸被或·OH 氧化形成.若以氧化還原電勢(shì)（將0.00 V 的標(biāo)準(zhǔn)氫電極參考電勢(shì)作為標(biāo)準(zhǔn)還原電勢(shì)）來(lái)具體度量ROS獲取電子并被還原的能力，則電位越強(qiáng)，ROS 對(duì)電子的親和力越大，氧化性越強(qiáng)[10]，因此電極電位是決定反應(yīng)能否發(fā)生的關(guān)鍵因素之一.表1 列出了活性氧半反應(yīng)及其已知的氧化還原電位[14]以供參考.在生物代謝過(guò)程中，正常濃度的ROS 可作為信號(hào)分子[8]介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳輸，調(diào)控生命活動(dòng)或參與細(xì)胞內(nèi)功能性物質(zhì)的氧化修飾[15].然而，在特殊環(huán)境下（例如，電離輻射），ROS 水平會(huì)急劇增加，引起氧化應(yīng)激[8,10]而導(dǎo)致細(xì)胞死亡.同時(shí)ROS對(duì)有機(jī)污染物也具有降解除污的能力[6,16]，具備高效環(huán)保的特點(diǎn).在當(dāng)今綠色環(huán)保的時(shí)代背景下，ROS作為抗菌去污雙效活性成分，在廢水處理、大氣污染治理、醫(yī)療保健以及食品安全等領(lǐng)域?qū)⒕哂懈鼜V闊的應(yīng)用前景[5,16-17].當(dāng)前的研究表明，ROS 作為重要的化學(xué)反應(yīng)中間體[10]，其鑒定分析、作用機(jī)制和動(dòng)力學(xué)評(píng)估[18]都非常重要.目前檢測(cè)ROS 的手段還無(wú)法完全消除雜質(zhì)的影響，不同種類(lèi)ROS對(duì)細(xì)胞具體作用方面還存在機(jī)理不明確之處.結(jié)合新技術(shù)，利用生物分子學(xué)理論，以ROS 的生成鏈及多種ROS 動(dòng)態(tài)平衡的體系為分析基礎(chǔ)，對(duì)其抗菌機(jī)理的認(rèn)知可以得到更細(xì)致的補(bǔ)充完善.

表1 相關(guān)分子和活性物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位Table 1 Standard redox potential of related molecules and active substances

2 光催化抗菌材料中ROS 的產(chǎn)生

光催化材料表面活性位點(diǎn)區(qū)域能夠捕獲O2和H2O 分子，經(jīng)過(guò)催化氧化可以產(chǎn)生足夠數(shù)量的ROS[10,12]，這是光催化材料抗菌過(guò)程中ROS 主要的產(chǎn)生來(lái)源.另外，生物體內(nèi)本身也會(huì)產(chǎn)生少量ROS，例如真核細(xì)胞中線粒體的能量轉(zhuǎn)化，人體內(nèi)吞噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答等[19].在生理濃度下，ROS 在細(xì)胞內(nèi)作為信使[20]有效調(diào)節(jié)信號(hào)通路或?qū)垢腥荆^(guò)量ROS 產(chǎn)生會(huì)使細(xì)胞抗氧化防御活性不足，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡[8]，此結(jié)果即為氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而造成細(xì)胞生理功能紊亂使細(xì)菌死亡.

2.1 光催化抗菌材料

光催化抗菌材料按成分不同將其劃分為有機(jī)光催化材料、無(wú)機(jī)光催化材料和有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)合光催化材料三大類(lèi)，其中有機(jī)光催化抗菌材料一般通過(guò)電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生ROS[12]，即自身（1PS）形成三重電子激發(fā)態(tài)（3PS*）.3PS*通過(guò)電子或氫原子的轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成、H2O2和·OH 等ROS，或通過(guò)能量轉(zhuǎn)移到分子氧（3O2）產(chǎn)生1O2，例如金屬有機(jī)骨架材料（MOFs）[21]和共價(jià)有機(jī)骨架材料（COFs）[22].有機(jī)光催化抗菌材料具有特殊的生物靶向功能，生效快、能力強(qiáng)，但抗菌有效期短、熱穩(wěn)定性差且安全性[23]需進(jìn)一步探索研究.目前所報(bào)道的無(wú)機(jī)光催化抗菌材料是以Ti、Zn、Cu、Bi、W、Mo、In 為主的氧化物和硫化物及其多元金屬?gòu)?fù)合材料，均屬于半導(dǎo)體光催化材料.按材料所含載流子濃度的差異分為p 型半導(dǎo)體和n 型半導(dǎo)體，n 型半導(dǎo)體中自由電子濃度遠(yuǎn)大于空穴的濃度，如TiO2[6,9,24]、BiVO4[16,25]和ZnO[26-27]，反之為n 型半導(dǎo)體，如CuO[28-29]和Cu2O[30]等.無(wú)機(jī)光催化抗菌材料成本低、效果顯著、有效期長(zhǎng)且無(wú)耐藥性[2]，但是單一成分的無(wú)機(jī)光催化抗菌材料也存在諸多問(wèn)題，如可見(jiàn)光區(qū)域的窄吸收、帶隙能高、光生載流子分離效率低及復(fù)合率高，使其光催化活性受到影響[18]，因此選取合適帶隙能值的半導(dǎo)體材料用以構(gòu)造異質(zhì)結(jié)[6,27]，合成復(fù)合材料成為提高無(wú)機(jī)抗菌材料光催化活性的有效手段之一.

如圖1 所示，光催化劑異質(zhì)結(jié)構(gòu)一般分為三大類(lèi)：p-n 型、肖特基結(jié)和Z 型異質(zhì)結(jié)構(gòu)[31].簡(jiǎn)而言之，p-n 型異質(zhì)結(jié)包括兩種機(jī)制，分別為I 型（圖1 (a)）和Ⅱ型（圖1 (b)），I 型異質(zhì)結(jié)因其光催化效果不佳已被II 型異質(zhì)結(jié)所取代，II 型異質(zhì)結(jié)利用兩材料之間的能級(jí)差分離光生電荷，抑制它們之間的重組；肖特基結(jié)（圖1 (c)）是半導(dǎo)體-金屬接觸結(jié)構(gòu)，可以有效地減少電荷載流子的重組，促進(jìn)材料對(duì)光的吸收.最后，Z 型異質(zhì)結(jié)的電荷轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（圖1 (d)）是由光催化還原系統(tǒng)、光催化氧化系統(tǒng)以及中間電子傳遞體組成[31]，通過(guò)氧化還原介質(zhì)或固態(tài)電子介質(zhì)捕獲并犧牲兩半導(dǎo)體之間的少量載流子，以獲得大量具有高氧化/還原電位的電荷載體.與傳統(tǒng)的光催化劑相比，Z 型異質(zhì)結(jié)光催化劑的電荷載流子遷移路徑更短，載流子分離效率更高，氧化還原能力更強(qiáng)[32]，因此Z 型異質(zhì)結(jié)機(jī)制被研究者認(rèn)為是高效光催化應(yīng)用中最富有價(jià)值的研究策略.無(wú)機(jī)光催化材料的抗菌機(jī)制基礎(chǔ)來(lái)自于活性物質(zhì)ROS[33]，所以本文以下部分主要討論無(wú)機(jī)光催化材料中ROS 的產(chǎn)生機(jī)制.

圖1 異質(zhì)結(jié)中載流子遷移途徑.(a) Ⅰ型;(b) Ⅱ型;(c) 肖特基結(jié);(d) Z 型異質(zhì)結(jié)Fig. 1 Carrier migration path in heterojunctions: (a) type Ⅰ;(b) type Ⅱ;(c) Schottky junction;(d) Z-scheme

2.2 ROS 產(chǎn)生

無(wú)機(jī)光催化材料產(chǎn)生ROS 的一般機(jī)理如圖2所示，光催化材料吸收光能，在固體表面產(chǎn)生光生電子（e-）和光生空穴（h+），即當(dāng)入射光能量大于光催化材料自身帶隙時(shí)，電子空穴發(fā)生分離，電子從價(jià)帶被激發(fā)到導(dǎo)帶，空穴則留在價(jià)帶，此時(shí)導(dǎo)帶上的電子和價(jià)帶上的空穴分別具有強(qiáng)還原性和強(qiáng)氧化性，這些載流子與含氧分子接觸后通過(guò)氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生ROS[10].在實(shí)際條件下，H2O 和O2是光催化過(guò)程中重要的反應(yīng)物種，O2與光生電子的還原反應(yīng)以及H2O 與光生空穴的氧化反應(yīng)同時(shí)發(fā)生[34].不同種類(lèi)的ROS 之間還會(huì)相互轉(zhuǎn)化[4]，例如的歧化反應(yīng)，·OH 的二聚反應(yīng)以及Haber-Weiss 反應(yīng)等，相關(guān)反應(yīng)匯總?cè)绫? 所示.在光催化抗菌中，抗菌效率受所使用的半導(dǎo)體的種類(lèi)[6,10,16]、微晶結(jié)構(gòu)及尺寸[29,35]、所采用的菌液條件[27]和光照條件等多種因素的影響.鑒于光催化材料表面載流子的遷移及與吸附物質(zhì)的多重反應(yīng)，結(jié)合以上影響因素可以?xún)?yōu)化催化材料設(shè)計(jì)方案使材料達(dá)到最佳效果.另外，缺陷是影響光催化材料性能的重要因素，氧空位（OV）[36]是最常見(jiàn)的陰離子空位點(diǎn)缺陷，適當(dāng)增加氧空位可以有效調(diào)節(jié)載流子的傳輸，增加載流子的濃度，提供豐富的氧吸附位點(diǎn)[6,18].在催化反應(yīng)過(guò)程中，氧空位可以作為電子供體來(lái)提高氧活化能[37]，有利于等ROS 的生成，對(duì)提高催化氧化還原效率具有重要意義.例如Lyu 等[7]制備了富含表面氧空位（SOV）的碳包覆TiO2材料，O2通過(guò)碳層完成吸附—活化—解離的過(guò)程，產(chǎn)生和1O2.Zhou 等[38]研究了無(wú)光環(huán)境中ZnO 納米材料的{2110}晶面存在氧空位并產(chǎn)生ROS 的過(guò)程，同時(shí)證實(shí)0.5 g·L-1的{2110}-ZnO 在黑暗條件下表現(xiàn)出約為99.99%的抗菌率.由于氧空位對(duì)半導(dǎo)體材料，尤其是金屬氧化物的物理和化學(xué)特性具有顯著影響，如電阻阻抗、超導(dǎo)性能、光電化學(xué)特性等[6,39]，因此在材料中應(yīng)該盡量通過(guò)溫和、簡(jiǎn)便的方法引入氧空位缺陷，同時(shí)注意調(diào)控引入位置及氧空位濃度[7]，細(xì)致研究材料中氧空位缺陷對(duì)其他功能的影響[36]，以避免對(duì)結(jié)果產(chǎn)生誤導(dǎo)，但目前尚未有此類(lèi)文章報(bào)道.

圖2 光催化氧化水和還原氧氣逐步生成活性氧[34]Fig. 2 Photocatalytic oxidation of water and reducing oxygen gradually generate active oxygen[34]

表2 ROS 反應(yīng)鏈匯總Table 2 ROS reaction chain summary

3 ROS 抗菌機(jī)理

3.1 活性氧(ROS)產(chǎn)生及作用機(jī)理

活性氧（ROS）抗菌是指過(guò)高濃度的活性氧打破細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御機(jī)制，與細(xì)菌內(nèi)的遺傳物質(zhì)、酶、蛋白質(zhì)等物質(zhì)反應(yīng)造成氧化損傷，或與細(xì)胞膜（壁）的結(jié)構(gòu)成分反應(yīng)，造成細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，使細(xì)菌受損死亡[2,10,13].和H2O2可以被細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)源性抗氧化劑（酶促和非酶促）分解[13]，因此兩者的反應(yīng)活性略低于·OH 和1O2.ROS雖具有高度的反應(yīng)活性，但受環(huán)境和自身結(jié)構(gòu)的影響很難長(zhǎng)時(shí)間存在[8]，因此在水生系統(tǒng)中的ROS壽命短且濃度通常較低.除相對(duì)穩(wěn)定的H2O2外，其余ROS 只能在亞毫秒級(jí)的時(shí)間范圍內(nèi)被檢測(cè)到（表3）[40]，但其在光催化抗菌過(guò)程中卻發(fā)揮著重要作用.因此探究ROS 的產(chǎn)生過(guò)程及作用機(jī)理顯得尤為重要.

表3 四種ROS 性質(zhì)表Table 3 Four types of ROS properties

3.1.1 ·OH 的產(chǎn)生及其作用

·OH 是一種具有高氧化能力的非選擇性氧化劑[34]，可以快速氧化大多數(shù)有機(jī)化合物，因此通常被認(rèn)為是最有效的氧化劑，其生成過(guò)程對(duì)于討論光催化氧化反應(yīng)非常重要.首先在催化劑有效反應(yīng)區(qū)內(nèi)，由活性位點(diǎn)捕獲H2O 所產(chǎn)生的表面羥基是生成·OH 的關(guān)鍵中間體，其次表面羥基因官能團(tuán)配位數(shù)的不同被分為橋接羥基自由基和末端羥基自由基[41]，其中橋接氧離子的質(zhì)子化以及溶液的pH 值影響兩種羥基的生成速率和產(chǎn)量[34].最后所有表面羥基被催化劑價(jià)帶上的光生空穴所氧化為·OH，如公式(13)所示.此外H2O2的單電子還原或H2O2和的哈伯-韋斯（Haber-Weiss）反應(yīng)也可以轉(zhuǎn)化為·OH，如表2 中反應(yīng)公式(4)和(12)所示.

·OH 不能直接透過(guò)細(xì)胞膜[41]，因此其主要作用于細(xì)胞表面，與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁表面的結(jié)構(gòu)成分發(fā)生氧化反應(yīng)，例如·OH 作為氧化劑與細(xì)胞膜脂質(zhì)中的碳=碳雙鍵反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)氧化物和氫過(guò)氧化物[42]，導(dǎo)致可溶性金屬離子或氧化性分子可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)而加劇 ROS 介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化，最終使細(xì)胞死亡.·OH 甚至還可以作用于真菌細(xì)胞壁，通過(guò)取代表面成分中的H 原子使其裂解并將糖苷鍵轉(zhuǎn)變?yōu)轷ユI.這種現(xiàn)象破壞了真菌細(xì)胞壁的完整性，并使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)松動(dòng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)通過(guò)細(xì)胞邊界流出，Basu 等[43]通過(guò)觀察MoS2納米材料處理的鏈格孢菌的電鏡照片發(fā)現(xiàn)菌絲產(chǎn)生嚴(yán)重變形.

3.1.3 H2O2的產(chǎn)生及其作用

H2O2的產(chǎn)生主要來(lái)源于O2的兩電子還原和H2O 的氧化[18]（公式(8)）.從還原為H2O2有兩種途徑，除導(dǎo)帶電子對(duì)的還原（公式（1）～（3）），還有超氧化物歧化酶（SOD）作用下的歧化，如公式（14）所示，H2O2后續(xù)反應(yīng)如在過(guò)氧化氫酶（CAT）作用下的歧化分解產(chǎn)生O2（公式（15））.

H2O2因其穩(wěn)定的熱力學(xué)狀態(tài)，壽命較長(zhǎng)并能穩(wěn)定發(fā)揮氧化作用[8,40]，是光催化抗菌材料長(zhǎng)期保持殺菌活性的主要物質(zhì).H2O2作為一種擴(kuò)散型小分子，可以跨過(guò)細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞深處與多種蛋白質(zhì)或酶反應(yīng)，阻礙細(xì)胞的正常生理功能致細(xì)胞死亡[18].另外，進(jìn)入細(xì)胞后的部分H2O2經(jīng)過(guò)酶分解產(chǎn)生·OH，具有更強(qiáng)氧化性的·OH 將會(huì)激發(fā)一系列的氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，攻擊膜結(jié)構(gòu)，加重細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，同時(shí)使更多的自由基能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，增強(qiáng)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的損傷程度.

3.1.41O2的產(chǎn)生及其作用

1O2的產(chǎn)生涉及三個(gè)過(guò)程[12]，常規(guī)三線態(tài)分子氧在光催化材料表面的活性吸附、單電子還原、失電子氧化，而高活性的1O2后續(xù)會(huì)在催化劑表面淬滅繼而發(fā)生解離還原成分子氧，因此光生載流子的氧化還原能力是本過(guò)程的控速步驟[47].

1O2是氧分子吸收能量后的激發(fā)態(tài)，其最外層有一個(gè)空軌道，易得電子并與其他物質(zhì)結(jié)合生成穩(wěn)定的化學(xué)鍵.1O2攻擊色氨酸、組氨酸和酪氨酸等各類(lèi)氨基酸以及核糖堿基造成蛋白質(zhì)和DNA（RNA）的不可逆氧化損傷[48].例如為研究ROS 對(duì)遺傳性物質(zhì)的作用，鳥(niǎo)嘌呤[49]中的2’-脫氧鳥(niǎo)苷被1O2從正反兩個(gè)方向攻擊，經(jīng)過(guò)一系列的反應(yīng)之后形成一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體：螺環(huán)亞胺基二乙內(nèi)酰脲dSp，并且H2O 參加了反應(yīng)中的氫質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程，降低中間產(chǎn)物的反應(yīng)活化能，有利于反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行.石婧明用量子化學(xué)的方法具體研究了1O2氧化2’-脫氧鳥(niǎo)苷的過(guò)程和機(jī)理，從活化能、頻率分析和NBO 電荷計(jì)算等多方面確定了此氧化反應(yīng)進(jìn)行的最優(yōu)路徑和機(jī)理的合理性[50].

通過(guò)以上的分析，可以看出主要的四種ROS可以同時(shí)存在，并且可以相互轉(zhuǎn)化，以TiO2為例，其整體反應(yīng)過(guò)程如圖3 所示，因此ROS 的抗菌作用機(jī)理其實(shí)是一種協(xié)同作用機(jī)制.各種ROS 在催化體系中存在一種動(dòng)態(tài)的平衡，使得細(xì)胞在多種ROS 的綜合作用下，產(chǎn)生強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激，細(xì)胞器與細(xì)胞功能物質(zhì)均會(huì)受到不同程度的攻擊和損害，最終導(dǎo)致了細(xì)胞的衰弱與凋亡.為了能夠分辨不同種類(lèi)ROS 的具體產(chǎn)生機(jī)理和抗菌作用機(jī)制，就需要較為精確的檢測(cè)手段來(lái)證明各種ROS 的存在證據(jù)和作用表現(xiàn).

圖3 ROS 在TiO2 表面上的光催化產(chǎn)生過(guò)程Fig. 3 Photocatalytic generation processes of ROS on TiO2 material surfaces

3.2 抗菌過(guò)程中活性氧檢測(cè)方法

ROS 檢測(cè)方法大致分為直接方法和間接方法兩類(lèi)[40]，直接方法為電子自旋共振（Electron spin resonance，ESR）檢測(cè)方法，是利用不成對(duì)電子在磁場(chǎng)中產(chǎn)生能級(jí)分裂或躍遷展現(xiàn)出順磁性的特點(diǎn)檢測(cè)ROS[51]，該方法僅利用自由基的順磁性特征，具有靈敏度高、時(shí)間快速、無(wú)損檢測(cè)、定量分析等優(yōu)勢(shì)，非常適合于檢測(cè)環(huán)境壽命短的活性氧自由基.此外借助冷凍技術(shù)有助于延緩自由基的淬滅過(guò)程，研究者在氣相低溫（77 K 或4 K）條件下，可以通過(guò)ESR 直接觀察到·OH 和[24,52]，1O2本身雖電子均已配對(duì)，但其軌道角動(dòng)量引起的順磁特性也會(huì)導(dǎo)致ESR 信號(hào)變化，因此也可以被ESR 檢測(cè)到[51].

由于每種ROS 都可以吸收光能，在特定的波長(zhǎng)下可以觀察到吸收特征峰，同時(shí)，吸收峰的觀測(cè)也受到自由基的最大吸收波長(zhǎng)和摩爾吸收系數(shù)的影響（表3），摩爾吸收系數(shù)越小，對(duì)自由基進(jìn)行光吸收的直接檢測(cè)就越困難.1O2吸收光能后所產(chǎn)生的光輻射屬于磷光發(fā)光過(guò)程，因此磷光發(fā)光法成為直接檢測(cè)1O2的一種獨(dú)特方法，是常用檢測(cè)1O2存在的手段之一.1O2失活轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的基態(tài)氧有兩種能量釋放方式[53]：1O2→ O2+hv（發(fā)光波長(zhǎng)為1268 nm）；21O2→ 2O2+hv（發(fā)光波長(zhǎng)分別為634 nm 和703 nm）.近紅外區(qū)1268 nm 處的磷光發(fā)光法被普遍認(rèn)為是檢測(cè)1O2最直接最可靠的方法，且發(fā)光強(qiáng)度與1O2的量成正比[12].除此之外，此種技術(shù)還可以確定1O2的產(chǎn)率、壽命和失活速率常數(shù)等參數(shù)[40].為了延緩自由基的淬滅，通常溶劑環(huán)境用D2O 代替H2O，可將其壽命提高到76 μs[40].時(shí)間分辨磷光法、空間分辨磷光法及近紅外區(qū)半導(dǎo)體二極管法等[53-54]技術(shù)都提高了傳統(tǒng)磷光法的檢測(cè)靈敏度，但當(dāng)1O2微量（1 μg）時(shí)無(wú)法滿(mǎn)足前兩種方法定量分析要求[34]，檢測(cè)下限還需要提高.

由于抗菌系統(tǒng)多為溶液環(huán)境，在此條件下ROS壽命短且濃度通常較低[8]，除相對(duì)穩(wěn)定的H2O2外，其余ROS 只能在毫秒級(jí)以下的時(shí)間直接觀察到，研究人員提出了使用探針?lè)肿硬东@自由基以產(chǎn)生較穩(wěn)定分析物的間接方法[55].相較之下，ESR 檢測(cè)成本稍高，不適用于大批量檢測(cè)樣品，磷光發(fā)光法也只適合檢測(cè)1O2，因此在抗菌領(lǐng)域當(dāng)中直接檢測(cè)還存在一定的限制，間接方法則較大程度上解決了這些問(wèn)題.間接方法通常涉及特定ROS 與探針?lè)肿拥姆磻?yīng)，以產(chǎn)生更穩(wěn)定、壽命更長(zhǎng)的分析物，這樣的反應(yīng)一般以特定的化學(xué)衍生化技術(shù)（例如，用氮氧化物或其他自旋試劑捕獲自由基）或者競(jìng)爭(zhēng)動(dòng)力學(xué)為測(cè)試基礎(chǔ)[40].考慮到實(shí)驗(yàn)室條件下檢測(cè)的可行性、必要儀器和探針?lè)肿映杀镜纫蛩?，通常使用光譜檢測(cè)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如吸光光度法（UV/ Vis），熒光法（FL）、化學(xué)發(fā)光法（CL）和電子自旋共振法（ESR）等.由于引入了額外的化學(xué)反應(yīng)，這些間接技術(shù)有可能擾亂觀察到的系統(tǒng).除此之外，大部分光譜檢測(cè)策略雖然操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、反應(yīng)迅速，是實(shí)驗(yàn)室通用檢測(cè)手段，但在外部光源條件下從采樣到檢測(cè)活性氧與探針?lè)肿拥姆€(wěn)定產(chǎn)物還需要一定的時(shí)間，無(wú)法反映實(shí)時(shí)ROS 產(chǎn)生，因此還需要穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析、停止流方法、時(shí)間分辨激光光譜、快速光解和脈沖輻射分解等方法兼并分析[56].而化學(xué)發(fā)光法（CL）是借助化學(xué)反應(yīng)能量驅(qū)動(dòng)，檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)過(guò)程中產(chǎn)生的能量發(fā)射，不需要額外的光能，規(guī)避了大部分問(wèn)題，因此CL 過(guò)程被認(rèn)為是最靈敏的檢測(cè)方法之一[34].但不可避免的是，在使用CL 探針時(shí)，也會(huì)受到溶液酸堿性和其他氧化劑的影響，例如魯米諾（Luminol）探針只適合在堿性環(huán)境下檢測(cè)ROS，且溶解的O2和H2O2也可以氧化Luminol 產(chǎn)生CL 信 號(hào)[57]；MCLA 探針（6-(4-methoxyphenyl)-2-methyl-3,7-dihydroimidazo-[1,2-a]pyrazin-3-one hydrochloride）雖選擇性?xún)?yōu)于Luminol 探針，但檢測(cè)的同時(shí)1O2也會(huì)氧化MCLA[55]，即便CL 系列探針基本是在中性使用的，但pH 值和其他高反應(yīng)活性離子仍然是多數(shù)探針?lè)肿拥年P(guān)鍵影響因素.目前可以通過(guò)使用萃取、自由基清除劑或色譜法，在分析之前盡量消除其他活性物質(zhì)的干擾以獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)分析結(jié)果[56].表4 匯總了四種ROS 的常用探針?lè)肿拥拈g接檢測(cè)方法，包括使用探針?lè)肿臃磻?yīng)原理及其產(chǎn)物（含產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)條件）、產(chǎn)物的相應(yīng)檢測(cè)數(shù)據(jù)、檢測(cè)方法類(lèi)別、檢測(cè)限、影響因素和該方法的參考文獻(xiàn)，供大家參考.

表4 常用探針?lè)肿拥拈g接檢測(cè)方法Table 4 Indirect detection methods of commonly used probe molecules

選擇ROS 分析方法時(shí)應(yīng)著重考慮該方法的敏感性、該方法對(duì)目標(biāo)分析物的選擇性和特異性，以及該方法允許以足夠快的時(shí)間分辨率進(jìn)行測(cè)量的能力[40].不同方法之間的特異性差異很大，在進(jìn)行ROS 鑒定或定量分析時(shí)應(yīng)慎重選擇，爭(zhēng)取在有限的條件下使用相對(duì)合理的檢測(cè)方法得到較精確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

3.3 ROS 催化活性的影響因素和優(yōu)化措施

ROS 是光催化抗菌過(guò)程中最關(guān)鍵的反應(yīng)物質(zhì)，研究表明ROS 的產(chǎn)量與細(xì)菌存活率之間存在線性相關(guān)性（R2=0.84）[68]，此外ROS 的反應(yīng)活性也很大程度上決定著光催化材料的抗菌效果.研究發(fā)現(xiàn)，ROS 的產(chǎn)量和活性取決于光催化材料的基本種類(lèi)[2,30,35]、能帶結(jié)構(gòu)[27,29,69]、反應(yīng)介質(zhì)pH[70]、環(huán)境溫度[28]、摻雜元素[9,71]以及表面修飾[36,38]等因素.首先，ROS 生成類(lèi)型取決于半導(dǎo)體的禁帶寬度值（Energy band）和ROS 生成反應(yīng)的氧化還原電位（Eh，具體數(shù)值參考表1）[14].當(dāng)光催化材料正電位的價(jià)帶（Ev）頂或負(fù)電位導(dǎo)帶（Ec）底相對(duì)電位值超過(guò)相應(yīng)的ROS 生成電位[10]，即可產(chǎn)生對(duì)應(yīng)ROS 物種.例如銳鈦礦型TiO2（A-TiO2）、ZnO 和ZnS 納米顆粒可產(chǎn)生三種類(lèi)型ROS（1O2、OH、），金紅石型TiO2（R-TiO2）、CuO、In2S3等只產(chǎn)生一種或兩種ROS，而B(niǎo)i2S3不能產(chǎn)生ROS[72]，如圖4 所示.

圖4 與超氧物、單線態(tài)氧和羥基自由基的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位相比，典型半導(dǎo)體材料的禁帶寬度值及帶邊位置Fig. 4 Compared with the standard redox potential of superoxide,singlet oxygen,and the hydroxyl radical,the energy band and band edge position of typecial semiconductors.

其次，光催化材料的結(jié)構(gòu)特征，例如尺寸、形貌、晶面暴露率等均對(duì)ROS 的產(chǎn)量和活性有一定影響[10,18].通過(guò)形態(tài)調(diào)整技術(shù)獲得小尺寸大比表面積的材料，能夠更容易滲透到細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)菌底物結(jié)合，產(chǎn)生更多的表面活性位點(diǎn)提高載流子分離能力，達(dá)到良好的抗菌效果.例如Wen 等[35]制備的1.1 nm 的WO3-x納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)均表現(xiàn)出顯著的膜透過(guò)性和高毒性ROS 的產(chǎn)生.2D 超薄（厚度＜10 nm）銳鈦礦型TiO2研究發(fā)現(xiàn)其{001}面暴露率高達(dá)90%以上[73]，光照短時(shí)間內(nèi)就可以檢測(cè)出大量ROS，使得此類(lèi)光催化抗菌材料見(jiàn)效較快.

第三，環(huán)境條件作為外在因素對(duì)ROS 活性也起著重要的調(diào)節(jié)作用，尤其是對(duì)反應(yīng)介質(zhì)的pH 值和溫度研究較多[28,70].生物體內(nèi)源ROS 活性在極端pH 值和高溫下受到明顯抑制，但光催化材料產(chǎn)生的外源性ROS 對(duì)惡劣條件表現(xiàn)出優(yōu)異的抗性[74].例如，CuO 納米棒[28]和銅摻雜磷酸鹽玻璃（Cu-PBG）納米球[75]在較寬的pH 范圍（3.0～7.0）及溫度范圍（25～60 ℃）內(nèi)均有ROS 的產(chǎn)生，在醫(yī)學(xué)生理?xiàng)l件（pH 值為6，環(huán)境溫度是37 ℃）下也可以保持對(duì)大腸桿菌良好的殺菌效果.

最后，通過(guò)表面修飾手段[26,29,71]對(duì)光催化材料本體表面物理和化學(xué)性質(zhì)實(shí)現(xiàn)有目的性的改變，以增強(qiáng)ROS 產(chǎn)生和殺菌作用，例如表面異質(zhì)結(jié)、表面缺陷控制和表面摻雜等手段.前兩種手段已在前文講述，而表面摻雜元素（金屬/非金屬）是以調(diào)整材料固有的晶體和電子結(jié)構(gòu)從而達(dá)到優(yōu)化氧化還原能力[71,76].對(duì)于金屬含氧光催化劑而言，構(gòu)建異質(zhì)結(jié)構(gòu)和負(fù)載貴金屬是提高其活性的兩種最佳策略[18].例如Liang 等[77]制備的TiO2-ZnO/Au復(fù)合材料優(yōu)異的光催化產(chǎn)氫性能（1068 μmol.g-1，可見(jiàn)光照射4 h）和抗菌性能（達(dá)到98.2%），Au 和p-n異質(zhì)結(jié)在此過(guò)程中起協(xié)同作用.

根據(jù)上述影響ROS 產(chǎn)量和活性的條件，可以從以下幾個(gè)方面提高催化材料ROS 的作用效果：（1）根據(jù)ROS 氧化還原電位和材料能帶結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)復(fù)合材料，有目的性地制備新型材料；（2）建立一套統(tǒng)一完整的ROS 活性評(píng)價(jià)體系，方便不同材料不同條件下的對(duì)比分析；（3）根據(jù)實(shí)際使用條件和目標(biāo)要求，合理改性催化材料，避免過(guò)度修飾，同時(shí)注意綠色環(huán)保和可循環(huán)處理等要求.

4 總結(jié)與展望

綜上所述，活性氧（ROS）抗菌在光催化抗菌過(guò)程中具有顯著的直接作用與多重功效，例如高效、安全、廣譜等特點(diǎn)，在很多領(lǐng)域顯示出強(qiáng)大的實(shí)際應(yīng)用前景.但對(duì)于活性氧的研究中還存在些許亟待解決的問(wèn)題，值得深思.首先在機(jī)理方面，活性氧自由基在介質(zhì)中以多種類(lèi)、多狀態(tài)（例如活性氧中間體等）相互轉(zhuǎn)化并達(dá)到一種穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡，廣泛分布在細(xì)胞內(nèi)外的各個(gè)區(qū)域，協(xié)同作用于細(xì)胞氧化損傷，所以單獨(dú)認(rèn)定哪一類(lèi)活性氧自由基在抗菌過(guò)程中起到最主要作用具有一定的局限性.雖然活性氧抗菌已是普遍認(rèn)可的一種重要機(jī)制，活性氧產(chǎn)生的數(shù)量和種類(lèi)對(duì)細(xì)菌活動(dòng)有至關(guān)重要的影響，但是活性氧與細(xì)菌生物體之間的詳細(xì)作用關(guān)系也缺乏細(xì)致研究，不同種類(lèi)的活性氧自由基對(duì)細(xì)菌生物之間所產(chǎn)生的具體影響還不夠明確，需要在生物學(xué)的基礎(chǔ)上給予更深入的研究.

其次在檢測(cè)方面，雖然在目前技術(shù)下可以做到ROS 質(zhì)和量的整體研究，但在活體細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行屏蔽劑清除實(shí)驗(yàn)時(shí)，破壞體系平衡后難免會(huì)對(duì)被檢測(cè)的活性氧造成一定的影響，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析.此外，大部分活性氧自由基都存在濃度低、有效存在時(shí)間短的問(wèn)題，目前檢測(cè)手段還不足以支持對(duì)整個(gè)活性氧自由基的活體進(jìn)行原位示蹤，觀察記錄其動(dòng)態(tài)衰減過(guò)程.因此改進(jìn)或創(chuàng)建用于檢測(cè)瞬態(tài)和痕量系統(tǒng)中活性氧的探針對(duì)于優(yōu)化定性和定量分析方法十分重要.

活性氧具有廣譜抗菌、無(wú)耐藥性限制的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)兼具降解有機(jī)污染物的性能，使得光催化抗菌材料具備自?xún)裟芰Γ@種安全、持久、穩(wěn)定的特點(diǎn)使得光催化材料在未來(lái)有很大的發(fā)展空間.但是此類(lèi)材料的活性氧氧化特性對(duì)于有機(jī)物基底的材料是存在氧化腐蝕風(fēng)險(xiǎn)的，不能與有機(jī)物長(zhǎng)期穩(wěn)定共存；此外，在衛(wèi)生醫(yī)療領(lǐng)域，催化材料的材質(zhì)甄別尤為嚴(yán)格和重要，含金屬元素的催化材料需要大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，層層實(shí)驗(yàn)把關(guān)才可以在特定生物環(huán)境中推廣使用.因此，光催化抗菌材料的設(shè)計(jì)應(yīng)用需要在活性氧產(chǎn)生機(jī)理層面上出發(fā)，根據(jù)使用環(huán)境的要求和適度抗菌的目的綜合考慮，合理構(gòu)建材料的構(gòu)造和負(fù)載形式.