昆明裂腹魚CYP1A1基因結(jié)構(gòu)與進(jìn)化分析*

畢映慧，苗貴東，楊申才，呂彤彤，楊 進(jìn)

（興義民族師范學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院，貴州 興義 562400）

昆明裂腹魚已成為我國重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類之一[1]，屬鯉科（Cyprinidae）裂腹魚屬（Schizothorax Hecke），地方名常稱之為細(xì)鱗魚[2]，主要生活在我國的西南部分地區(qū)，貴州省境內(nèi)主要生活在南盤江、北盤江上游的支流中，此外金沙江下游、烏江上游等都有分布。昆明裂腹魚的最適生長水溫范圍在14～18℃之間，為冷水性魚類，由于具有較強(qiáng)的耐低溫能力以及肉味鮮美的優(yōu)點(diǎn)，因此具有開發(fā)養(yǎng)殖前景，已被列入貴州省“十四五”鄉(xiāng)村振興生態(tài)漁業(yè)產(chǎn)業(yè)重要的經(jīng)濟(jì)魚種。然而，昆明裂腹魚存在性成熟時(shí)期較晚（一般雌性魚4齡、雄性魚3齡的個(gè)體性腺才開始逐漸發(fā)育成熟）、繁殖能力較低、生長畸形率較高[3]等困擾產(chǎn)業(yè)發(fā)展的問題。

細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450）由一群基因超家族（super family）編碼的酶蛋白所形成。CYP450在生物體內(nèi)廣泛分布，是微粒體混合功能氧化酶中不可或缺的一族氧化酶。CYP450與雌激素在內(nèi)的外源性以及內(nèi)源性化學(xué)物質(zhì)在生物體內(nèi)的相互轉(zhuǎn)化是依賴于酶來實(shí)現(xiàn)的。在雌激素致癌鏈上，雌激素代謝酶的活性以及功能會(huì)對雌激素與靶細(xì)胞的作用產(chǎn)生直接影響[2]。研究表明CYP450就包括了CYPlAl、CYP1B1以及CYPl9等。細(xì)胞色素P4501A1（Cytochrome P4501A1，CYP1A1）是一種芳香烴羥化酶[4]，是一種重要的體內(nèi)I相代謝解毒酶，能對多種環(huán)境致癌物以及突變物進(jìn)行失活[5]。許多研究表明，CYP1A1是一種重要的激活環(huán)境污染物（多環(huán)芳香碳?xì)浠衔铮┑拿竅6-7]。通過開展發(fā)育調(diào)控及性別控制相關(guān)基因研究，進(jìn)一步研究其功能，為認(rèn)識(shí)昆明裂腹魚的發(fā)育特點(diǎn)及性別控制相關(guān)育種研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

本研究材料昆明裂腹魚個(gè)體取自中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所云南瀕危物種保育中心，通過解剖取雌雄成熟個(gè)體性腺，構(gòu)建了雌雄個(gè)體的全長轉(zhuǎn)錄組文庫，并進(jìn)行高通量測序。取魚鰭，用95%酒精脫水，-20℃保存。通過對昆明裂腹魚全長轉(zhuǎn)錄組文庫數(shù)據(jù)分析與挖掘，獲得昆明裂腹魚CYP1A1基因的全長，設(shè)計(jì)引物，然后通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序方法，驗(yàn)證CYP1A1基因的全長。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 昆明裂腹魚基因組DNA提取

取適量魚鰭組織，采用天根生物海洋動(dòng)物組織基因組提取試劑盒，按照試劑盒方法提取高質(zhì)量基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基因組DNA經(jīng)檢測，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖顯示主條帶清晰，點(diǎn)樣孔干凈無熒光，表明DNA質(zhì)量良好，見圖1。圖1中，M為D2000 Marker。

圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖

2.2 昆明裂腹魚CYP1A1基因的全長測序驗(yàn)證

對獲得昆明裂腹魚CYP1A1基因的全長序列進(jìn)行基因組擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序驗(yàn)證，獲得序列與高通量測序所獲基因序列進(jìn)行比較，高通量測序所獲基因序列的堿基準(zhǔn)確性大于99%，高通量測序所獲基因序列結(jié)果較為可靠（見圖2、圖3）。圖2中，M為D2000 Marker。

圖2 部分引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果

圖3 CYP1A1基因部分引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果

2.3 昆明裂腹魚CYP1A1基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)整理的基因序列，采用美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站上的ORF Finder程序，對測序獲得的mRNA序列進(jìn)行開放閱讀框定位；確定其起始密碼子以及終止密碼子位點(diǎn)；進(jìn)而獲得其CDS序列全長。昆明裂腹魚CYP1A1基因的CDS序列全長為1 498 pb。采用DNASTAR軟件，把CDS序列堿基翻譯成氨基酸序列，得到499個(gè)氨基酸。采用SMART軟件，對昆明裂腹魚CYP1A1基因的CDS序列進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其氨基酸的45～368區(qū)域和382～499區(qū)域?yàn)镻fam（見圖4），跨膜區(qū)可能在9～31區(qū)域（見表1）。

圖4 SMART軟件預(yù)測的CDS序列蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

表1 SMART軟件預(yù)測的昆明裂腹魚蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)（%）

運(yùn)用NCBI網(wǎng)站上的Blast程序，對擴(kuò)增獲得的昆明裂腹魚CYP1A1基因與近源物種的同源性進(jìn)行比對。昆明裂腹魚CYP1A1基因與鯉魚、安水金線鲃、鯽魚、犀角金線鲃、金線鲃、南亞野鯪、草魚、卡特拉魚、黑頭呆魚和斑馬魚等物種的CYP1A1基因的CDS序列區(qū)的同源性比對結(jié)果，見表2。

表2 CYP 1A1基因的CDS序列區(qū)的同源性比對結(jié)果（%）

由表2分析可知，昆明裂腹魚CYP1A1基因與安水金線鲃和犀角金線鲃的同源性相似比率較高，均為92.23%；其次與鯉魚、鯽魚、南亞野鯪、卡特拉魚、草魚和黑頭呆魚的同源性相似比率依次為91.70%、91.63%、89.28%、89.20%、87.16%、84.32%；與斑馬魚的同源性相似比率較低，為82.12%。

CYP1A1基因的氨基酸序列的同源性比對結(jié)果見表3。

表3 CYP1A1基因的氨基酸序列的同源性比對結(jié)果（%）

由表3分析可知，昆明裂腹魚CYP1A1基因的氨基酸序列與鯉魚的氨基酸序列同源性相似比率最高，為90.55%；與安水金線鲃和犀角金線鲃的氨基酸序列同源性相似比率均為90.16%；與南亞野鯪、和黑頭呆魚的氨基酸序列同源性相似比率為86.42%。

可以推測，CDS序列區(qū)和氨基酸序列的同源性比對結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到的基因即為昆明裂腹魚的CYP1A1基因。

運(yùn)用BioEdit軟件，對本次試驗(yàn)擴(kuò)增獲得的CYP1A1基因的CDS序列進(jìn)行堿基組成成分分析。CYP1A1基因的4種堿基組成含量見表4。

表4 昆明裂腹魚CYP1A1基因的CDS序列4種堿基含量

由數(shù)據(jù)分析可知，CDS序列的單鏈蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為455 822.00 KD，雙鏈蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為911 589.00 KD；GC含量為53.60%，AT含量為46.40%。

2.4 昆明裂腹魚CYP1A1基因進(jìn)化分析

從NCBI網(wǎng)站的Ge Ba nk數(shù)據(jù)庫里下載鯉魚、安水金線鲃、鯽魚、犀角金線鲃、金線鲃、卡特拉魚、南亞野鯪、黑頭呆魚、草魚和斑馬魚等同源性物種的CYP1A1基因氨基酸序列。采用MEG A7.0軟件里面P hyrogeny的N eighbor-Joining Tree程序，對該序列構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖5）。

圖5 CYP1A1基因氨基酸序列的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 昆明裂腹魚CYP1A1基因蛋白質(zhì)預(yù)測與分析

2.5.1 昆明裂腹魚CYP1A1基因蛋白質(zhì)疏水性分析

運(yùn)用ExPASy在線平臺(tái)上的ProtScale程序，對擴(kuò)增得到的CYP1A1基因的蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水性分析，將蛋白質(zhì)序列提交到該程序，由程序給出CYP1A1基因的疏水性圖譜（見第29頁圖6），從而對其進(jìn)行分析。

分析圖6疏水性圖譜可知，最小值為-3.144，位于序列214位置上；最大值為3.478，位于序列472位置；昆明裂腹魚CYP1A1基因序列的N-端的5～32位置區(qū)域、192～208位置區(qū)域、322～341位置區(qū)域和465～479位置區(qū)域表現(xiàn)為明顯的疏水性，在其序列N-端的209～218位置區(qū)域表現(xiàn)為存在明顯的親水性，由此預(yù)測其信號肽可能存在于疏水性區(qū)域內(nèi)。

圖6 CYP 1A1基因的疏水性圖譜

通過ExPASy在線平臺(tái)上的ProtParam程序可知，昆明裂腹魚CYP1A1基因的氨基酸序列的平均親水性為-0.078；理論等電點(diǎn)（pI）為6.44，氨基酸的相對分子質(zhì)量為55 867.48 Da，原子組成為C（2505）、H（3965）、N（671）、O（728）、S（23）；分子式為C2505H3965N671O728S23。該序列的N-端是甲硫氨酸（Met）。由于其不穩(wěn)定指數(shù)（II）為35.37，因此將其蛋白質(zhì)歸類為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.5.2 昆明裂腹魚CYP1A1基因信號肽分析

基于對昆明裂腹魚CYP1A1基因蛋白質(zhì)的疏水性分析，其蛋白質(zhì)序列可能存在信號肽，將CYP1A1基因的氨基酸序列上傳到SignaIP 3.0在線服務(wù)器，通過隱馬可夫模型（HMM），預(yù)測該序列中是否含有信號肽，見圖7。運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法（NN）程序，預(yù)測該序列中的信號肽位點(diǎn)（見圖8）。

圖7 預(yù)測CYP1A1基因的氨基酸序列中是否含有信號肽

圖8 預(yù)測CYP 1A1基因的氨基酸序列中的信號肽位點(diǎn)

信號肽分析主要涉及3個(gè)參數(shù)值，分別為C、S和Y。程序會(huì)給出一個(gè)相對應(yīng)的數(shù)據(jù)，并能夠?qū)κ欠窈行盘栯淖龀雠袛?。根?jù)SignaIP3.0服務(wù)器呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)（見表5），可對其進(jìn)行分析。

表5 昆明裂腹魚CYP1A1基因信號肽預(yù)測結(jié)果測量參數(shù)

由表5的預(yù)測結(jié)果表明，最可能的裂解位點(diǎn)在33和34之間MRL-MR，可能存在信號肽的概率為0.081；信號錨定概率為0.869；該序列最大切割位點(diǎn)概率為0.050；位點(diǎn)在15和16之間。根據(jù)數(shù)據(jù)并結(jié)合圖形分析可知，昆明裂腹魚CYP1A1基因的蛋白質(zhì)的N-端存在1個(gè)信號肽，位點(diǎn)在33和34之間MRL-MR。

2.5.3 昆明裂腹魚CYP1A1基因跨膜區(qū)分析

將昆明裂腹魚CYP1A1基因的氨基酸序列提交到ExPASy在線平臺(tái)上的TMPRED程序，讓其對該序列進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測，見圖9。

圖9 預(yù)測CYP1A1基因的跨膜區(qū)

由圖9分析表明，該序列的N-端有2個(gè)強(qiáng)跨膜螺旋，由內(nèi)到外的螺旋有4個(gè)，分別位于14～34位置區(qū)域、194～210位置區(qū)域、319～339位置區(qū)域以及368～388位置區(qū)域；由外到內(nèi)的螺旋有2個(gè)，見第30頁表6。因此，該基因有2個(gè)跨膜區(qū)，并且能夠預(yù)測跨膜區(qū)的長度為17到33之間。

表6 CYP1A1基因的氨基酸序列的強(qiáng)跨膜螺旋區(qū)

2.5.4 昆明裂腹魚CYP1A1基因磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)

采用NetPhos3.1服務(wù)器，在線對擴(kuò)增的昆明裂腹魚CYP1A1基因進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測，見第30頁圖10。

圖10 預(yù)測CYP 1A1基因的磷酸化位點(diǎn)

蛋白質(zhì)的磷酸化主要是指氨基酸殘基被磷酸化后能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性發(fā)生改變的過程。由圖10分析結(jié)果顯示，昆明裂腹魚CYP1A1基因中，共發(fā)現(xiàn)27個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中，蘇氨酸（Thr）為7個(gè)，絲氨酸（Ser）為17個(gè)，酪氨酸（Tyr）為3個(gè)。

利用NetNGlyc1.0及NetOGlyc3.1服務(wù)器，分別對擴(kuò)增的昆明裂腹魚CYP1A1蛋白質(zhì)進(jìn)行N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測和O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測。N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測見圖11。

圖11 預(yù)測CYP 1A1基因的N-糖基化位點(diǎn)

由圖11分析結(jié)果顯示，昆明裂腹魚CYP1A1蛋白質(zhì)序列有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，位于224位置上，該蛋白質(zhì)序列暴露N-糖基化機(jī)制，因此能被糖基化。O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測見圖12。由圖12分析結(jié)果可知，昆明裂腹魚CYP1A1基因的O-糖基化位點(diǎn)有3個(gè)，見表7。分別位于15位置、198位置和391位置。O-糖基化發(fā)生在絲氨酸（Ser）上。

圖12 預(yù)測CYP 1A1基因的O-糖基化位點(diǎn)

表7 昆明裂腹魚CYP1A1基因O-糖基化位點(diǎn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.5.5 CYP1A1基因二級結(jié)構(gòu)分析

運(yùn)用SOPMA在線服務(wù)器，對擴(kuò)增的昆明裂腹魚CYP1A1基因進(jìn)行預(yù)測，見圖13。

圖13 CYP1A1基因的二級結(jié)構(gòu)

由圖13分析顯示，昆明裂腹魚CYP1A1基因主要以α-螺旋（Alpha helix）為主;無規(guī)則卷曲（Random coil）次之;β-折疊（Beta bridge）最少。昆明裂腹魚CYP1A1基因的無規(guī)則卷曲區(qū)域、α-螺旋區(qū)域、β-折疊區(qū)域分別占36.87%、45.89%、5.01%。

2.5.6 CYP1A1基因三級結(jié)構(gòu)分析

運(yùn)用同源建模的方法，將昆明裂腹魚CYP1A1基因的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL在線服務(wù)器，對該序列進(jìn)行建模，見第31頁圖14。分析可知，建模以4i8v.1.A序列作為模板，與目標(biāo)序列之間的一致度為56.99%，遠(yuǎn)大于30%，滿足同源建模的基本條件。

圖14 昆明裂腹魚CYP1A1基因的氨基酸序列的同源建模

基于可信度（GMQE）范圍為0～1，QMEAN區(qū)間為0～1，由數(shù)據(jù)分析可知，待測蛋白質(zhì)的GMQE值為0.76，QMEAN值為-1.10。因此，可根據(jù)模板蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，預(yù)測待測蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，見圖15。在圖15中，圖像由彩虹著色N→C端;尺寸如下：x=64.745?，y=47.352?，z=72.452?。

圖15 昆明裂腹魚CYP 1A1基因的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

分析可知，旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體離群值（Rotamer Outliers）為2.72%;C-Beta偏差（C-Beta Deviations）有5個(gè)，分別位于A366 SER，A299 LEU，A336 VAL，A122 ASP，A324 PHE;非脯氨酸順式肽鍵（Cis Non-Proline）有1個(gè)，位于A438 THR-A439 ASP。昆明裂腹魚CYP1A1基因的各氨基酸殘?jiān)|(zhì)量見圖16。分析顯示，昆明裂腹魚CYP1A1基因的N-端是甘氨酸（Gly），C-端是甲硫氨酸（Met）;缺失突變位點(diǎn)有1個(gè)，位于SER 386;半胱氨酸（Cys）位點(diǎn)有6個(gè)，分別位于序列162位置、204位置、207位置、294位置、406位置和458位置上。

圖16 昆明裂腹魚CYP1A1基因的各氨基酸殘?jiān)|(zhì)量

3 分析與討論

采用NCBI網(wǎng)站上的ORF Finder程序，對測序獲得的mR NA序列進(jìn)行開放閱讀框位置定位；確定其序列的起始密碼子以及終止密碼子的位置；從而確定試驗(yàn)擴(kuò)增CYP1A1基因的CDS序列全長為1 498 bp，通過DNAS T A R軟件，對該序列進(jìn)行翻譯，可得出該序列共編碼299個(gè)氨基酸。從NCBI網(wǎng)站的Ge Ba nk數(shù)據(jù)庫中，獲取鯉魚、安水金線鲃、鯽魚、犀角金線鲃、金線鲃和黑頭呆魚等物種的CYP1A1基因的CDS序列。利用Blast程序，對這些物種的CYP1A1基因進(jìn)行全CDS序列比對，通過比對發(fā)現(xiàn)昆明裂腹魚與安水金線鲃和犀角金線鲃的堿基同源性相似比率達(dá)到92.23%，與鯉魚的堿基同源性相似比率達(dá)到91.70%。比對結(jié)果表明，昆明裂腹魚與安水金線鲃以及犀角金線鲃的氨基酸同源性相似比率達(dá)到90.16%，與鯉魚的氨基酸同源性相似比率達(dá)到90.55%，根據(jù)CDS序列和氨基酸序列同源性比對結(jié)果分析，進(jìn)而可以確定擴(kuò)增獲得的基因序列即為昆明裂腹魚的CYP1A1基因序列。利用SMART軟件，對昆明裂腹魚CYP1A1基因的CDS序列進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其氨基酸的45～368位置區(qū)域和382～499位置區(qū)域?yàn)镻fam（P450），進(jìn)一步證實(shí)了擴(kuò)增獲得的基因序列就是昆明裂腹魚的CYP1A1基因序列。同源性比對結(jié)果分析表明，昆明裂腹魚與鯉科魚類和高原冷水魚類的CYP1A1基因同源性相似比率高，這與其均屬于冷水魚類和具有相似的棲息環(huán)境是一致的。

昆明裂腹魚的CYP1A1基因的氨基酸序列與其他多種魚類的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，昆明裂腹魚與金線鲃、犀角金線鲃以及安水金線鲃的親緣關(guān)系較為相近;與斑馬魚的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過分析可知，安水金線鲃是金線鲃屬的一個(gè)新種[8]；金線鲃屬于鯉形目鯉科[9];犀角金線鲃是云南鯉科魚類的一個(gè)新種[10]。這些物種與昆明裂腹魚均屬于鯉科冷水性魚類，主要分布于我國西南地區(qū)高原河流與湖泊內(nèi)。斑馬魚是鯉形目鯉科，是一種常見的熱帶魚，主要分布于印度、孟加拉國以及巴基斯坦等南亞國家[11]。不同的地理分布以及生存環(huán)境可能是導(dǎo)致其親緣關(guān)系之間遠(yuǎn)近不同的一個(gè)原因。

運(yùn)用ExPASy在線平臺(tái)上的相應(yīng)程序，對擴(kuò)增獲得的昆明裂腹魚CYP1A1基因的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行疏水性預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其序列有4個(gè)明顯的疏水性區(qū)域，進(jìn)而推測在疏水性區(qū)域內(nèi)可能存在信號肽。運(yùn)用ExPASy在線平臺(tái)上的ProtParam程序分析表明，該序列的氨基酸平均親水性為-0.078，理論等電點(diǎn)為6.44?；谑杷灶A(yù)測可能存在信號肽，通過SignaIP3.0在線服務(wù)器，運(yùn)用隱馬可夫模型（HMM）預(yù)測其序列中是否含有信號肽;運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法（NN）程序預(yù)測信號肽位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)，昆明裂腹魚CYP1A1基因的蛋白質(zhì)序列的N-端存在1個(gè)信號肽，信號肽位點(diǎn)為33和34之間MRL-MR。在跨膜區(qū)預(yù)測的分析中，發(fā)現(xiàn)序列的N-端有2個(gè)強(qiáng)跨膜螺旋，因此，預(yù)測昆明裂腹魚CYP1A1基因有2個(gè)跨膜區(qū)。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程主要有糖基化以及磷酸化等，蛋白質(zhì)的磷酸化是生物界最普遍同時(shí)也是比較重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾。在磷酸化調(diào)節(jié)的過程中，細(xì)胞的形態(tài)和功能都會(huì)隨著磷酸化狀態(tài)發(fā)生改變[12]。本次試驗(yàn)擴(kuò)增獲得的昆明裂腹魚CYP1A1基因蛋白質(zhì)翻譯后修飾主要是磷酸化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)。有27個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中，蘇氨酸（Thr）有7個(gè)，絲氨酸（Ser）有17個(gè)，酪氨酸（Tyr）有3個(gè)。有3個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，分別位于15位置、198位置和391位置上。昆明裂腹魚CYP1A1基因的蛋白質(zhì)序列只有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，位于該序列的224位置上。

本次試驗(yàn)擴(kuò)增獲取的昆明裂腹魚CYP1A1基因蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，占45.89%;無規(guī)則卷曲次之，占36.87%。采用同源建模的方法，將昆明裂腹魚CYP1A1基因的蛋白質(zhì)序列提交到SIWSS-MODEL程序，得到與模板蛋白質(zhì)序列較高的一致度，為56.99%，遠(yuǎn)大于30%，可用于預(yù)測待測蛋白質(zhì)序列的三維結(jié)構(gòu)。由SIWSS-MODEL程序計(jì)算的數(shù)據(jù)分析顯示，擴(kuò)增獲得的昆明裂腹魚CYP1A1基因在保守區(qū)域內(nèi)存在6個(gè)半光氨酸（Cys）;在保守區(qū)域內(nèi)有3個(gè)二硫鍵，其二硫鍵主要是以相鄰的2個(gè)Cys依次構(gòu)成的亞域。昆明裂腹魚CYP1A1基因的蛋白質(zhì)氨基酸序列的穩(wěn)定CYP1A1球狀結(jié)構(gòu)是通過二硫鍵折疊而形成的，維持了CYP1A1的高級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征具備典型的魚類CYP1A1基因的高級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[13]。

4 結(jié)論

通過構(gòu)建昆明裂腹魚全長轉(zhuǎn)錄組文庫獲得全長基因的結(jié)果是可靠的，通過引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序獲得序列分析，昆明裂腹魚CYP1A1基因的堿基和氨基酸水平分析結(jié)果表明，昆明裂腹魚與高原區(qū)抗寒魚類和多倍體鯉科魚類的同源性相似比率較高，與鯉科魚類斑馬魚同源性相似比率較低，表明基因與低溫魚類及多倍體高原魚類有相似的進(jìn)化方向；其蛋白質(zhì)預(yù)測結(jié)果表明，該基因能夠形成穩(wěn)定蛋白，與鯉科魚類CYP1A1同源性相似比率較高，具備維持其生物學(xué)特性的完整的蛋白質(zhì)空間構(gòu)型，該研究為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)CYP1A1基因功能及在昆明裂腹魚性別發(fā)育及控制及發(fā)育中的作用研究奠定了一定基礎(chǔ)。