寬葉羌活和青海當歸葉綠體全基因組序列比較分析和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

谷 威 ，趙志敏 ，馬永貴 ，2*

（1.青海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，青海 西寧 810008；2.青海師范大學(xué) 青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，青海 西寧 810008）

羌活（Notopterygium incisum）為傘形科植物羌活或?qū)捜~羌活（Notopterygium franchetii）的干燥根莖及根，羌活屬植物是分布在青藏高原及其鄰近地區(qū)的中國特有多年生草本植物［1］。藥理研究表明，羌活具有抗炎、抗菌、抗氧化等活性，且對心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)有顯著影響［2］。青海當歸（Angelica nitida）產(chǎn)于青海東南部、甘肅南部及四川北部，生長于海拔2 600～4 000 m的高山灌從、草甸、山谷等，是青藏高原特有種。作為中藥材，青海當歸根部代替當歸治血虛、月經(jīng)不調(diào)、頭痛及關(guān)節(jié)炎，花常用于民間治頭痛。

葉綠體基因組由一個環(huán)狀DNA分子多個拷貝組成［3］，植物的葉綠體基因組具有四分體結(jié)構(gòu)，包括一個大的單拷貝區(qū)域（Large single copy， LSC）、一個小的單拷貝區(qū)域（Small single copy， SSC）和一對反向重復(fù)序列（Inverted repeat， IR）［4］。在植物細胞中，相較于核基因組在基因的數(shù)量、大小、排序等方面存在較大差異，葉綠體基因組基因的數(shù)目、順序相對保守且不易發(fā)生重組，保留了進化過程中的很多遺傳信息，這使其在研究不同物種系統(tǒng)發(fā)育進化方面成為強有力的工具之一［5］。近年來，關(guān)于寬葉羌活、青海當歸的研究相對集中于化學(xué)成分及藥理活性的挖掘，而對其系統(tǒng)進化方面的研究相對較少，因此對兩種青藏高原特有藥用植物寬葉羌活和青海當歸的葉綠體基因組進行研究，可有效補充植物界葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫，而對兩種植物的基因組進行比較分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，也有利于研究不同生物類群間的親緣關(guān)系與進化命運，以期為研究植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

寬葉羌活和青海當歸于2019年7月采于青海果洛藏族自治州班瑪縣的瑪可河林場（東經(jīng)：100°57′48.132″，北緯：32°50′13.4142″），用液氮將采集的新鮮葉片保存，回到實驗室后保存于-80℃超低溫冰箱中待用。

1.2 DNA提取、測序

寬葉羌活及青海當歸用改良的CTAB法分離，用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop分光光度計檢測已提取DNA的濃度、純度，合格DNA經(jīng)超聲波片段化后進行PCR擴增，擴增后形成測序文庫，用Illumina Novaseq平臺（設(shè)置150 bp測序讀長）進行測序［7］。

1.3 葉綠體基因組組裝、注釋及提交

測序后得到原始數(shù)據(jù)，過濾低質(zhì)量值數(shù)據(jù)，使用MITObim軟件［8］將其組裝，之后再用Dual Organellar GenoMe Annotator（DOGMA，http：//dogma.ccbb.utexas.edu/）對 其 注釋［9］，接 著 用 OGDRAW 軟 件（http：//ogdraw.mpimp-golm.mpg.de/）繪制葉綠體基因組圖譜，將注釋后的序列信息提交至NCBI葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫得到：寬葉羌活（GenBank 登錄號MW820162），青 海 當 歸（GenBank 登 錄 號MW820164）［10］。

1.4 SSR分析

寬葉羌活和青海當歸葉綠體全基因組的簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeats， SSR）分析，使用MISA1.0軟件，將參數(shù)設(shè)置成：單核苷酸為8，二核苷酸和三核苷酸都為4，四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸都為 3［11］。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

從NCBI的葉綠體數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/bro-wse/）下載傘形科：當歸屬福參（Angelica morii，MT921982-1），當歸屬東當歸（Angelica acutiloba， KX352468-1），當歸屬大葉當歸（Angelica megaphylla， MT921962-1），當歸屬狹葉當歸（Angelica anomala， MT921977-1），當歸屬白芷（Angelica dahurica， MT921980-1），芹屬旱芹（Apium graveolens， NC041087-1），明 黨 參 屬 明 黨 參（Changium smyrnioides， MN092718-1），川明參屬川明參（Chuanminshen violaceum， KU921430-2），糙果芹屬細葉糙果芹（Trachyspermum ammi， NC047246-1），柴 胡 屬 小 柴 胡（Bupleurum hamiltonii，MW262986-1），以十字花科南芥屬硬毛南芥（Arabis hirsuta， AP009369-1）作為外類群，采用 MAFFT［12］軟件進行多序列對比，然后用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）對系統(tǒng)進化關(guān)系進行分析［13］，用PhyloSuite軟件生成系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征

寬葉羌活和青海當歸同屬傘形科，葉綠體基因組的序列長度，結(jié)構(gòu)都是相似的，如圖1所示，兩種植物都具有典型的四段式結(jié)構(gòu)，由大單拷貝區(qū)、小單拷貝區(qū)、以及兩個反向互補重復(fù)區(qū)組成。由表1可看出兩種植物葉綠體基因組大小相差約5 kb，當歸IR區(qū)序列長度較長（17 435bp），且LSC區(qū)較短（94 491bp），二者的葉綠體基因組長度在LSC區(qū)存在較大差異，GC含量差異較小。

表1 葉綠體基因組堿基組成Tab.1 Base composition of chloroplast genome

圖1 葉綠體基因組圖譜Fig.1 Chloroplast genome map

2.2 葉綠體基因組功能及分類

葉綠體基因組主要包含光合作用相關(guān)基因、遺傳表達相關(guān)基因以及其他基因（表2），寬葉羌活和青海當歸共有基因123、127個，其中蛋白編碼基因80、83個，tRNA基因35、36個，rRNA基因8、8個，其中寬葉羌活相對于青海當歸少了光系統(tǒng)II中的psbA基因及核糖體大亞基中的rpl16基因。

表2 葉綠體基因組基因信息分類Tab.2 Classification of chloroplast genome gene information

2.3 SSR分析

寬葉羌活、青海當歸葉綠體基因組中共有208、219個SSR位點（表3），其中絕大部分SSR是單核苷酸重復(fù)，其次是二核苷酸重復(fù)，兩種植物均有少量三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)及五核苷酸重復(fù)，其中青海當歸中檢測到一個六核苷酸重復(fù)序列。如表所示，兩種植物SSR中的重復(fù)單元最多的都是A/T，其次是AT/AT、AG/CT、C/G等。

表3 葉綠體基因組中SSR類型及數(shù)量Tab.3 Types and numbers of SSRs in chloroplast genome

2.4 IR區(qū)邊界分析

從NCBI上下載傘形科羌活屬羌活（N. incisum，MW820162）的葉綠體基因組序列，將其與寬葉羌活、青海當歸比較：從圖2結(jié)果看出三種植物的基因ycf1均橫跨了IRa區(qū)和SSC區(qū)，位于SSC區(qū)的片段長度從3 506bp（N. incisum）到3 601bp（A. nitida）不等。在青海當歸和羌活中ndhF基因僅存在于SSC區(qū)一側(cè)。

圖2 葉綠體基因組IR區(qū)邊界比較Fig.2 Comparison of IR region boundaries of chloroplast genome

2.5 親緣關(guān)系分析

此次親緣關(guān)系分析選取了在分類上與寬葉羌活、青海當歸同為傘形科的10個物種：細葉糙果芹、旱芹、明黨參、川明參、小柴胡、福參、東當歸、大葉當歸、狹葉當歸、白芷，不同科的1個物種硬毛南芥，且以硬毛南芥葉綠體基因組作為外類群。從圖3結(jié)果可看出，物種間科間關(guān)系明確，12個傘形科植物與十字花科植物硬毛南芥分屬兩支，青海當歸與東當歸、大葉當歸、白芷、狹葉當歸、福參同為當歸屬且聚成一支，自展值為100。寬葉羌活屬羌活屬，與當歸屬植物間支持率不高。當歸屬植物、寬葉羌活、旱芹、細葉糙果芹與川明參、明黨參構(gòu)成姐妹關(guān)系。

圖3 基于寬葉羌活、青海當歸和11個物種葉綠體全基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Construction of phylogenetic tree of N. forbesii、A.nitida and 11 species based on chloroplast genome

3 討 論

本研究對寬葉羌活和青海當歸葉綠體全基因組進行分析，結(jié)果顯示，兩種植物均具有被子植物葉綠體基因組典型的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，兩種植物葉綠體基因組編碼的基因類別、數(shù)量高度相似，同時具有高度相似的G/C含量，其中，IR區(qū)序列的G/C含量最高，G/C含量從高到低依次為IR＞LSC＞SSC，研究表明，多種植物普遍存在IR區(qū)G/C含量最高的現(xiàn)象［14］，這與本文研究結(jié)果相一致。兩種傘形科植物寬葉羌活和青海當歸分別注釋得到123、127個基因，大多數(shù)為參與光合作用過程的基因及起轉(zhuǎn)錄翻譯作用的基因，這與多數(shù)植物葉綠體基因組中基因功能一致［15］。兩種植物葉綠體基因組中的簡單重復(fù)序列，由1～6個核苷酸組成［16］，SSRs大部分為單核苷酸，其中多為A/T，在青海當歸中發(fā)現(xiàn)六核苷酸重復(fù)序列，而寬葉羌活沒有，這與其它當歸屬植物一致［17］，SSR 的鑒定可以為兩種青藏高原特有植物的遺傳多樣性提供基礎(chǔ)研究。被子植物葉綠體基因組具有典型的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，這使得其存在4個邊界，即LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa和IRa/LSC。在進化過程中，IR區(qū)常發(fā)生收縮或擴張現(xiàn)象，這也是造成被子植物不同類群葉綠體基因組長度差異的一個重要原因［18］，三種植物IRa/SSC區(qū)ycf1基因和IRb/SSC區(qū)ycf1假基因向SSC區(qū)擴張，大多數(shù)其他基因的位置與它們在其他葉綠體基因組中的位置相似［19，20］。為進一步確定傘形科在被子植物中的進化地位和親緣關(guān)系，選取NCBI已公布的13種植物，以硬毛南芥作為外類群進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果顯示各分支節(jié)點支持率較高，小柴胡位于進化樹的基部，屬傘形科中較為原始的類群，川明參

和明黨參單獨聚在一起，當歸與當歸屬其余5個物種親緣關(guān)系較近，且支持率較高，包括青海當歸在內(nèi)的當歸屬植物與寬葉羌活支持率不高，說明各植物科間關(guān)系明確。利用傘形科在內(nèi)的13種植物葉綠體全基因組序列數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，為傘形科植物近緣物種間的親緣關(guān)系提供更多的系統(tǒng)發(fā)育數(shù)據(jù)。

4 總結(jié)

青海地處青藏高原，地形復(fù)雜多變，氣候差異大，然而，獨特的水熱條件使得青海藥用植物的藥效優(yōu)于其他地方，如羌活、黨參、柴胡、蟲草貝母等［21］。近些年隨著國際市場對中藥重視程度的提高，對于以當歸為基礎(chǔ)的復(fù)方制劑的研究日益增多，研究表明，當歸具有增強人體免疫力、保護血管內(nèi)皮、改善血液循環(huán)系統(tǒng)等療效［22］，而青海當歸在其原產(chǎn)地均作為當歸入藥［23］。寬葉羌活有較為悠久的開發(fā)歷史，通常作為我國特有藥用物種，且在保健品、藥膳、茶飲等方面有著出色的表現(xiàn)力［24］。對藥用植物的葉綠體基因組研究，有利于對物種遺傳背景，藥品鑒定及物種保護等方面進一步研究。而寬葉羌活和青海當歸這兩種傘形科植物，均有其潛在藥用價值，對其研究可補充植物界葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫以及研究傘形科內(nèi)部屬間關(guān)系。