羊李氏桿菌病的鑒別與檢測(cè)檢疫方法

文│孫娟（山東省聊城市茌平區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）

羊李氏桿菌病又被稱(chēng)為轉(zhuǎn)圈病，該病是由單核細(xì)胞增多性李氏桿菌感染導(dǎo)致的一種傳染性疾病。該病主要通過(guò)呼吸道、消化道、受損皮膚等途徑感染。該病多為散發(fā)，但病死率較高。妊娠期母羊感染后可出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀，羔羊感染后快速死亡。該病對(duì)我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)危害巨大。

一、李氏桿菌生物學(xué)特性

1.血清型。單增李氏桿菌含有特異性表面蛋白、鞭毛抗原和菌體抗原。目前共發(fā)現(xiàn)13種血清型，分別為3a、3b、3c、1/2a、1/2b、l/2e、4a、4b、4e、4d、4ab、4c或7型。其中4b型危害最為嚴(yán)重，占總病例的50%。

2.形態(tài)結(jié)構(gòu)。單增李氏桿菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體形狀呈兩端鈍圓、略彎曲、大小約為0.4～2微米、無(wú)芽孢。22℃時(shí)可形成鞭毛，具有運(yùn)動(dòng)性。隨著溫度升高至37℃時(shí)，鞭毛數(shù)量降低至一根，運(yùn)動(dòng)性能下降。

3.培養(yǎng)。單增李氏桿菌為兼性厭氧菌，生長(zhǎng)環(huán)境為1～45℃，通常在35℃條件下活性最強(qiáng)。20～25℃環(huán)境下穿刺培養(yǎng)2～5天，其可生長(zhǎng)為倒立的傘狀。常溫條件下培養(yǎng)可通過(guò)顯微鏡觀察到細(xì)菌在培養(yǎng)基內(nèi)呈翻轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。單增李氏桿菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較低，可在普通瓊脂培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。培養(yǎng)1～2天后，培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)出輪廓明顯的菌落，菌落多呈藍(lán)灰色透明狀，陽(yáng)光斜射可表現(xiàn)出藍(lán)綠光澤。在血液葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)可形成光滑的圓形菌落，且出現(xiàn)β-溶血環(huán)。液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后可出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，連續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間可觀察到沉淀。

4.生化特性。單增李氏桿菌常溫下可發(fā)酵分解產(chǎn)生葡萄糖、果糖、乳糖等，但無(wú)法發(fā)酵木糖、甘露醇、阿拉伯糖等。硫化氫、甘露醇、賴(lài)氨酸還原試驗(yàn)為陰性，不產(chǎn)生H2S和靛基質(zhì)，馬尿酸鈉、過(guò)氧化氫、甲基紅試驗(yàn)為陽(yáng)性。

5.抗性。單增李氏桿菌對(duì)外界環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)，可在高溫、高滲透壓、酸、堿性環(huán)境下生存。通常1～45℃內(nèi)均可生長(zhǎng)，且在30～37℃環(huán)境下具有較強(qiáng)的活力。同時(shí)，可在-0.1～0.4℃中生存，是一種耐冷的病原菌。另外，該病原菌對(duì)高溫環(huán)境耐受性較強(qiáng)，60℃條件下20分鐘方可滅活。同時(shí)，對(duì)酸耐受性強(qiáng)，pH 5.6～9.4范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)。除此之外，單增李氏桿菌對(duì)鹽具有較強(qiáng)抵抗力，10%氯化鈉條件下可大量生長(zhǎng)。病原菌對(duì)干燥抵抗性強(qiáng)，可在干燥的日糧中長(zhǎng)期存在。但病原菌對(duì)酒精、新潔爾滅等消毒劑以及紫外線較為敏感。

二、鑒別

1.剖檢變化

（1）腦炎型。對(duì)病羊解剖可發(fā)現(xiàn)病羊肝腫大，存在彌散性壞死病灶。胃黏膜、腸系膜淋巴結(jié)、肝、腎、脾等器官炎癥明顯，且多有充血或水腫現(xiàn)象。腦積液增多，腦干質(zhì)地變軟。血液和組織中含有較多的多形核細(xì)胞，血管周?chē)嬖诖罅繅乃涝睢?/p>

（2）子宮型。對(duì)妊娠期病羊解剖可發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)病變明顯，且絨毛上皮出現(xiàn)壞死，頂端分泌大量膿性滲出物。子宮內(nèi)胚胎早期死亡且自溶。淋巴結(jié)、胃腸黏膜、氣管黏膜等有明顯的充血現(xiàn)象，且肝、脾存在大量壞死病灶。

（3）敗血型。對(duì)病羊解剖可發(fā)現(xiàn)病羊脾腫大，存在大量粟狀壞死病灶。同時(shí)伴有鼻炎、出血性結(jié)膜炎、腦膜充血。

2.實(shí)驗(yàn)室檢查

（1）鏡檢。無(wú)菌條件下采集病死羊肝進(jìn)行涂片，隨后進(jìn)行染色、鏡檢可發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體兩端鈍圓，單個(gè)或成對(duì)相連，無(wú)莢膜和芽孢。

（2）分離培養(yǎng)。無(wú)菌條件下采集病死羊肝組織樣本，將其按照1∶5的比例與生理鹽水進(jìn)行混合，隨后研磨并將其分別接種于血液瓊脂培養(yǎng)基和肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。其中血液瓊脂培養(yǎng)基分別放置于37℃、厭氧和有氧條件下培養(yǎng)1～3天。培養(yǎng)結(jié)束后可發(fā)現(xiàn)肉湯變渾濁，無(wú)氣泡產(chǎn)生。血液瓊脂培氧基上生長(zhǎng)出大量圓形透明菌落，菌落表面光滑，周?chē)腥苎h(huán)。透光檢查發(fā)現(xiàn)菌落為藍(lán)灰色，進(jìn)一步培養(yǎng)后，藍(lán)灰色菌落逐漸變?yōu)榛野咨该鞒潭冉档?。挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并將其分別接種于0.05%和0.1%的亞蹄酸鉀血液瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，放置于37℃條件下培養(yǎng)1～3天，可發(fā)現(xiàn)0.05%濃度的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出大量灰白色菌落，且菌落經(jīng)過(guò)72小時(shí)顏色變?yōu)榧t色。0.1%濃度的培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)大量黑色菌落。若將可疑菌落接種于血清葡萄糖甘油肉湯和10%氯化鈉的血清葡萄糖甘油瓊脂內(nèi)，置于37℃條件下培養(yǎng)1～3天，可發(fā)現(xiàn)前者混濁，底部出現(xiàn)沉淀物。培養(yǎng)初期震蕩培養(yǎng)基，沉淀物呈螺旋狀上升，培養(yǎng)后期震蕩沉淀成顆粒狀。后者培養(yǎng)基內(nèi)會(huì)出現(xiàn)大量圓形透明菌落，菌落表面光滑呈藍(lán)色。培養(yǎng)后期發(fā)現(xiàn)菌落逐漸變?yōu)椴煌该鞯幕野咨?/p>

（3）運(yùn)動(dòng)性檢查。運(yùn)動(dòng)性檢查也是鑒別單增李氏桿菌的重要方式之一。取血清葡萄糖甘油肉湯純培養(yǎng)物在半固體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行穿刺接種，并放置于20℃條件下培養(yǎng)三天。鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體可移動(dòng)，且沿穿刺線生長(zhǎng)至兩側(cè)呈倒立傘狀?；蚍胖糜?7℃條件下培養(yǎng)三天，發(fā)現(xiàn)其菌體運(yùn)動(dòng)性能減弱甚至消失。菌體沿穿刺線稍向兩側(cè)生長(zhǎng)。

三、檢測(cè)方法

單增李氏桿菌對(duì)外界環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力，是目前世界上危害最為嚴(yán)重的病原菌之一，一旦污染日糧會(huì)給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的損失。近年來(lái)隨著疫情的不斷發(fā)生，單增李氏桿菌檢測(cè)逐漸引起重視。其檢測(cè)方法也不斷向快捷、靈敏、準(zhǔn)確方向發(fā)展。目前該病原體的檢測(cè)方式主要分為傳統(tǒng)檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)以及免疫學(xué)檢測(cè)三種。

1.傳統(tǒng)檢測(cè)。單增李氏桿菌傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要是將疑似病例采集的樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)。隨后將培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行生化反應(yīng)分析，并在顯微鏡下觀察其運(yùn)動(dòng)，同時(shí)進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)，最后再進(jìn)行血清型分析鑒定。傳統(tǒng)檢測(cè)方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，可定性、定量檢測(cè)且檢測(cè)成本較低，但檢測(cè)過(guò)程較慢，影響檢測(cè)結(jié)果的因素較多。

傳統(tǒng)檢測(cè)方法中美國(guó)食品藥品管理局的增菌法和冷增菌法是目前國(guó)際上公認(rèn)的有效檢測(cè)方法之一。增菌法適用于分離乳汁中的病原菌，將樣品接種在含放線菌酮的肉湯內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，隨后通過(guò)劃線法分離細(xì)菌，細(xì)菌在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)一段時(shí)間形成菌落后，提取可疑菌落進(jìn)行生化反應(yīng)和血清型鑒定。冷增菌法是將采集的樣本置于4℃條件下培養(yǎng)，每7天進(jìn)行一次細(xì)菌分離，連續(xù)分離培養(yǎng)兩個(gè)月。最后，進(jìn)行病原菌生化反應(yīng)和血清型鑒定。

我國(guó)單增李氏桿菌檢測(cè)起步晚，目前檢測(cè)方法包括國(guó)標(biāo)法和小鼠毒力試驗(yàn)兩種。上述方法均需增菌和分離提純，其中小鼠毒力試驗(yàn)法操作簡(jiǎn)單、快速。

2.免疫學(xué)檢測(cè)。該方法檢測(cè)原理是依據(jù)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)采集少量樣品即可精確檢測(cè)出抗原，且檢測(cè)結(jié)果不受基質(zhì)的影響。免疫學(xué)檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫技術(shù)、免疫磁珠分離技術(shù)等。免疫學(xué)檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單靈敏性高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)結(jié)果易于判斷。

（1）膠體金免疫技術(shù)。該方法是使用膠體金作為標(biāo)記物的一種免疫標(biāo)記技術(shù)，主要分為快速免疫層析法和快速斑點(diǎn)金滲濾法。其中快速免疫層析法對(duì)李氏桿菌檢測(cè)靈敏度高達(dá)85%以上。通常可使用檸檬酸鈉制備膠體金標(biāo)記單增李氏桿菌抗體免疫層析檢測(cè)板。

（2）酶聯(lián)免疫吸附法。酶聯(lián)免疫吸附法是目前應(yīng)用最為廣泛的一種免疫學(xué)檢測(cè)方法，該方法主要針對(duì)鞭毛抗原。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)李氏桿菌通常2～3小時(shí)可出檢測(cè)結(jié)果，PCR聯(lián)合酶聯(lián)免疫吸附法可在5小時(shí)內(nèi)檢測(cè)出10個(gè)單增李氏桿菌菌落。酶聯(lián)免疫吸附法操作簡(jiǎn)便、易被標(biāo)準(zhǔn)化。

（3）免疫磁珠分離技術(shù)。本檢測(cè)技術(shù)主要依據(jù)抗原抗體結(jié)合的特異性?？乖c抗體結(jié)合后利用磁性進(jìn)行分離，從而獲得對(duì)富集于微粒上的單增李氏桿菌，為后續(xù)檢測(cè)提供便利。

3.分子生物學(xué)檢測(cè)。常用的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、免疫磁珠分離與PCR結(jié)合法、基因芯片技術(shù)等。

（1）PCR。PCR檢測(cè)法在單增李氏桿菌檢測(cè)上廣泛應(yīng)用，檢測(cè)人員可使用傳統(tǒng)的分離鑒定方法以及PCR方法，從而對(duì)病原菌進(jìn)行檢測(cè)比較。與常規(guī)檢測(cè)法相比，PCR檢測(cè)法要求較低。另外，PCR檢測(cè)法還可與其他檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，從而有效提高檢測(cè)靈敏度和特異性，例如高速離心等，同時(shí)也可有效降低檢測(cè)量。

（2）免疫磁珠分離與PCR結(jié)合法。免疫磁珠分離與PCR結(jié)合法以核酸探針技術(shù)為基礎(chǔ)，核酸探針技術(shù)的應(yīng)用是單增李氏桿菌分子水平檢測(cè)的標(biāo)志技術(shù)。可通過(guò)利用32P標(biāo)記探針，從而進(jìn)行斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)。由于其僅與單核李氏桿菌發(fā)生反應(yīng)，因此具有良好的特異性。另外以RNA作為靶點(diǎn)研發(fā)的新型探針試劑盒，可大大縮短檢測(cè)時(shí)間提高檢測(cè)效果。免疫磁珠分離與PCR結(jié)合法特異性強(qiáng)，但對(duì)檢測(cè)人員要求較高，操作復(fù)雜，因此實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)用范圍較窄。

（3）基因芯片技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)是一種革命性技術(shù)，該技術(shù)基于基因表達(dá)和基因功能的研究，又被稱(chēng)為DNA芯片技術(shù)。目前該技術(shù)可檢測(cè)6種李氏桿菌，其中單增李氏桿菌檢測(cè)限為200國(guó)際單位/克?；蛐酒夹g(shù)具有高融通、速度快、誤差小等特點(diǎn)。但實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中仍需將病原菌進(jìn)行純化富集處理，從而進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度和特異性，富集處理后還需進(jìn)行PCR檢測(cè)。

四、結(jié)語(yǔ)

綜上所述，羊李氏桿菌病對(duì)羊群危害嚴(yán)重，嚴(yán)重制約我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展。因此，做好疾病的鑒別和檢測(cè)，及早發(fā)現(xiàn)疫情對(duì)降低養(yǎng)殖損失至關(guān)重要。養(yǎng)殖人員應(yīng)充分了解病原菌特性以及疾病檢測(cè)方法，做到早發(fā)現(xiàn)、早確診，早治療。