形覺剝奪近視早期雛雞視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡相關(guān)研究

王田甫 徐瓊 朱莉 才藝 王凱 李巖 趙明威

作者單位：1北京大學(xué)人民醫(yī)院眼科，北京 100044；2視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜疾病診治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034

近視是一種常見的眼部疾病[1-2]。高度近視并發(fā)癥可導(dǎo)致不可逆視力損傷，帶來嚴(yán)重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。目前近視進(jìn)展機(jī)制不明[4]，深入探索近視原因?qū)τ诜揽亟?、預(yù)防高度近視并發(fā)癥有重要的意義。

既往多項(xiàng)研究證實(shí)人類病理性近視階段，視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡被激活，研究證實(shí)病理性近視患者的感光細(xì)胞發(fā)生凋亡[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)形覺剝奪12周的雛雞會(huì)出現(xiàn)漆裂紋樣眼底改變，伴隨明顯的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡[6]。但2008年Andrew等[7]通過近視患者（平均屈光度約-3.92 D）的全基因組連鎖研究，篩查出3種與近視相關(guān)的基因，這些基因調(diào)節(jié)線粒體誘導(dǎo)的凋亡過程[8-11]。結(jié)合以上研究，我們猜想凋亡并不是在病理性近視階段才發(fā)生的，在近視發(fā)展早期，凋亡通路可能就已經(jīng)被激活。

bax是一種促凋亡基因[12]。bcl-2 通過干擾bax等因子達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的作用，研究者發(fā)現(xiàn)bcl-2與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)[13-14]。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶[15]。研究者發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜中caspase-3被激活后，視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡增加[16-17]。caspase-8是外源性細(xì)胞死亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白酶，研究發(fā)現(xiàn)caspase-8/HIF-1 α信號(hào)通路與視網(wǎng)膜損傷有關(guān)[18]。本研究希望通過檢測(cè)形覺剝奪雛雞模型中視網(wǎng)膜bax、bcl-2、caspase-3等表達(dá)水平的變化，來驗(yàn)證凋亡與近視發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，希望進(jìn)一步明確近視的可能發(fā)病機(jī)制，為早期近視防控提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

4日齡的白來航雞購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生命技術(shù)有限公司。本研究經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2020PHE091）。所有動(dòng)物有關(guān)程序均按照美國(guó)視覺與眼科學(xué)研究學(xué)會(huì)關(guān)于眼科和視覺研究中對(duì)動(dòng)物的處理原則，并按照北京大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)提供的指南進(jìn)行。

2021 年8 月將48 只白來航雞采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（CONT，n=24）和形覺剝奪組（Form deprivation myopia，F(xiàn)DM，n=24）。所有雛雞均在12 h光照/12 h黑暗的照明條件下飼養(yǎng)。在雛雞8日齡時(shí)，將形覺剝奪組雛雞右眼作為形覺剝奪眼[19]，根據(jù)形覺剝奪時(shí)間分為形覺剝奪1周組（FD1W）和形覺剝奪3周組（FD3W），每只雛雞的左眼作為對(duì)照不處理。對(duì)照組雙眼不作任何處理，形覺剝奪1 周時(shí)隨機(jī)挑選對(duì)照組12 只雛雞作為對(duì)照1 周組（C1W），其余繼續(xù)撫養(yǎng)至形覺剝奪3周，作為對(duì)照3周組（C3W）。形覺剝奪前后，測(cè)量各組雛雞的體質(zhì)量、屈光度、眼軸長(zhǎng)度（Axial length,AL）直至形覺剝奪結(jié)束以驗(yàn)證動(dòng)物模型建立成功。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物學(xué)測(cè)量 在形覺剝奪前，剝奪后1 周，剝奪后3 周分別使用帶狀光檢影鏡（YZ24，蘇州六六視覺科技有限公司）進(jìn)行檢影，測(cè)量雛雞屈光度。在異氟烷麻醉下，使用高頻A型超聲（TECLAB，檢測(cè)軟件為系統(tǒng)自帶UTSystem）測(cè)量AL（角膜前界至視網(wǎng)膜內(nèi)界膜前界）。每只眼重復(fù)測(cè)量15 次，取平均值。

1.2.2 視網(wǎng)膜電圖檢查 形覺剝奪后1周和3周及在對(duì)照組中隨機(jī)挑選6只雛雞，將其提前暗適應(yīng)4 h，進(jìn)行異氟烷麻醉，使用眼電生理診斷系統(tǒng)（RETIPort21，德國(guó)羅蘭公司）。記錄暗適應(yīng)和明適應(yīng)的a波和b波的振幅[20-21]。

1.2.3 組織形態(tài)學(xué)觀察 在形覺剝奪完成后處死雛雞，于冰上剪出眼球，立刻放入FAS眼球固定液（G1109，武漢賽維爾生物科技有限公司）中。常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片完成石蠟切片，脫蠟水化，蘇木素染色，伊紅染色，脫水透明，封片完成蘇木素-伊紅染色（HE染色），在光學(xué)顯微鏡下觀察其組織形態(tài)。

1.2.4 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 本研究使用雛雞視網(wǎng)膜蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)分析。在形覺剝奪后處死雛雞，于冰上取出視網(wǎng)膜組織。提取蛋白質(zhì)，測(cè)定濃度，配制蛋白質(zhì)溶液。電泳采用10%NUPAGE預(yù)制膠分離等量的蛋白質(zhì)，并在250 mA電流將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上1 h。在室溫下用封閉緩沖液封閉膜1 h。本研究中使用的主要抗體如下：bcl-2（1:1000）、caspase-3（1:1000）、bax（1:1000）、caspase-8（1:1000）、GAPDH（1:1000），均購(gòu)自中國(guó)Proteintech公司。清洗膜并在室溫下與兔IgG（H&L）二級(jí)抗體IRDye800CW和小鼠IgG（H&L）二級(jí)抗體IRDye800CW（1:1000）孵育1 h。使用雙色紅外激光成像系統(tǒng)（Odyssey CLX，美國(guó)LI-COR公司）拍攝圖像。

1.2.5 彩色立體眼底照相 雛雞形覺剝奪后，使用氯胺酮、賽拉嗪注射液將雛雞腹腔注射麻醉后，使用視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)（OPTO-RIS,英國(guó)Optoprobe Science LTD公司）進(jìn)行彩色立體眼底照相，以果膠（關(guān)于雞pecten oculi結(jié)構(gòu)的介紹參考文獻(xiàn)[22]）為照相時(shí)的參照系，以確保每次照相的范圍和角度相同。

1.2.6 透射電鏡 雛雞形覺剝奪1周和3周后，和相同年齡段對(duì)照組雛雞一起，眼球分別剪取眼底后極部組織片，約2 mm×2 mm，經(jīng)固定、脫水、滲透、包埋、切片、鈾鉛雙染色后在透射電子鏡下觀察，采集圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)研究。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 屈光度和AL增長(zhǎng)量比較

與對(duì)照1 周組[（+2.75±0.99）D]相比，形覺剝奪1 周組[（-9.17±2.14）D]雛雞（n=12）屈光度出現(xiàn)了明顯的近視性改變（t=12.40,P<0.001），同時(shí)伴有更多的AL 增長(zhǎng)量[（0.47±0.10）mmvs.（1.03±0.54）mm；t=3.53,P=0.002]。

與對(duì)照3周組[（1.30±0.84）D]相比，形覺剝奪3 周組[（-13.00±2.44）D]的雛雞屈光度同樣明顯高于對(duì)照組（t=12.37,P<0.001）和形覺剝奪1周組[（-9.17±2.14）D；t=2.63,P=0.030]，同時(shí)伴有更多的AL增長(zhǎng)量[對(duì)照3周組：（0.96±0.08）mm；形覺剝奪3周組：（2.35±0.17）mm；t=18.21,P<0.001；形覺剝奪1周組：（1.03±0.54）mm;t=5.28,P<0.001]。

2.2 視網(wǎng)膜電圖（ERG）波幅比較

對(duì)照1 周組和形覺剝奪1 周組雛雞在處理1 周后進(jìn)行ERG檢查，統(tǒng)計(jì)各組暗適應(yīng)和明適應(yīng)的a波和b波振幅，結(jié)果顯示2 組a波和b波振幅差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。

對(duì)照3 周組和形覺剝奪3 周組雛雞在處理3 周后進(jìn)行ERG檢查，統(tǒng)計(jì)各組暗適應(yīng)和明適應(yīng)的a波和b波振幅，結(jié)果顯示2 組a波和b波振幅差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。

2.3 視網(wǎng)膜切片HE染色

將形覺剝奪1周和3周后的對(duì)照組和相應(yīng)形覺剝奪組雛雞眼球石蠟切片進(jìn)行HE染色觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)，可以看到形覺剝奪1 周和3 周的雛雞視網(wǎng)膜均未出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)紊亂（見圖1）。

圖1.對(duì)照組和形覺剝奪組雛雞視網(wǎng)膜石蠟切片HE染色結(jié)果A：對(duì)照1周組；B：形覺剝奪1周組；C：對(duì)照3周組；D：形覺剝奪3周組Figure 1.HE staining results of paraffin sections of retina in the control and form deprivation groupsA: Control 1 week group;B: Form deprivation 1 week group;C: Control 3 weeks group;D: Form deprivation 3 weeks group.

2.4 雛雞眼底照相檢查

形覺剝奪1周和3周后雛雞接受腹腔注射麻醉下雙眼彩色立體眼底照相，可以看到在為期1周和3周的形覺剝奪結(jié)束后，形覺剝奪組雛雞眼底均未見明顯的病理性近視改變。

2.5 形覺剝奪后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量變化

與對(duì)照1 周組相比，形覺剝奪1 周組雞視網(wǎng)膜bcl-2 表達(dá)量下降（t=2.77,P=0.040），而caspase-3（t=3.44,P=0.026）、bax（t=2.99,P=0.040）、caspase-8（t=5.82,P=0.028）的表達(dá)量均明顯上升（見圖2）。與對(duì)照3 周組相比，形覺剝奪組3 周組視網(wǎng)膜抑凋亡因子bcl-2表達(dá)量下降（t=4.58,P=0.044），促凋亡因子caspase-3（t=3.25,P=0.023）、bax（t=4.77,P=0.018）、caspase-8（t=5.38,P=0.013）的表達(dá)量均明顯上升（見圖3）。

圖2.形覺剝奪1周組和對(duì)照1周組雛雞視網(wǎng)膜蛋白表達(dá)量對(duì)比與對(duì)照1周組相比，形覺剝奪1周組雛雞視網(wǎng)膜中bcl-2的表達(dá)水平在1周后下降，caspase-3、bax、caspase-8的表達(dá)水平明顯增加Figure 2.Comparison of retinal protein expression in chicks of form deprivation 1 week group and control 1 week groupCompared with the control 1 week group,the expression of bcl-2 in the retina of chicks in the form deprivation 1 week group decreased after one week,and the expression of caspase-3,bax,caspase-8 increased significantly.a,P<0.05.C1W was control 1 week group;FD1W was form deprivation 1 week group.

圖3.形覺剝奪3周組和對(duì)照3周組雛雞視網(wǎng)膜蛋白表達(dá)量對(duì)比與對(duì)照3周組相比，形覺剝奪3周組雛雞視網(wǎng)膜中bcl-2的表達(dá)水平在3周后下降，caspase-3、bax、caspase-8的表達(dá)水平明顯增加Figure 3.Comparison of retinal protein expression of chicks in the form deprivation 3 weeks group and the control 3 weeks groupCompared with the control 3 weeks group,the expression of bcl-2 in the refina of chicks in the form deprivation group decreased after 3 weeks,and the expression of caspase-3,bax,caspase-8 increased significantly.a,P<0.05.C3W was control 3 weeks group;FD3W was form deprivation 3 weeks group.

2.6 形覺剝奪后視網(wǎng)膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，形覺剝奪1周后視網(wǎng)膜中未觀察到細(xì)胞凋亡表現(xiàn)（見圖4）。形覺剝奪3 周后視網(wǎng)膜多個(gè)層次細(xì)胞的細(xì)胞核染色質(zhì)分布不均勻，可見染色質(zhì)固縮顆粒聚集；線粒體重度腫脹，基質(zhì)大量溶解，嵴消失，空泡變；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中度擴(kuò)張，局部脫顆粒（見圖4）。

圖4.形覺剝奪1、3周后對(duì)照組和形覺剝奪1、3周組雛雞視網(wǎng)膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)對(duì)比形覺剝奪3周后，通過透射電鏡觀察到雛雞視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡。A、F：對(duì)照1周組；B、G：形覺剝奪1周組。C、H：對(duì)照3周組細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞質(zhì)無明顯損傷；D、I：形覺剝奪3周后，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見染色質(zhì)凝集顆粒（NA）；E、J：形覺剝奪3周后，視網(wǎng)膜內(nèi)核層細(xì)胞內(nèi)可見染色質(zhì)固縮和核內(nèi)顆粒聚集（NA），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RER）適度擴(kuò)張和脫顆粒，線粒體（MI）嚴(yán)重腫脹，嵴消失和空泡化Figure 4.Comparison of ultrastructure of retinal cells between control group and form deprivation group after 1 week and 3 weeks of form deprivationAfter 3 weeks of form deprivation,retinal cell apoptosis was observed by transmission electron microscopy.A,F: Control 1 week group.B,G: Form deprivation 1 week group.C,H: In the control 3-week group,the cell structure was normal,the chromatin was evenly distributed,and there was no obvious damage to the cytoplasm.D,I: In the form deprivation 3 weeks group,chromatin condensation granules (NA) were observed in retinal ganglion cell layer.E,J: After 3 weeks of form deprivation,chromatin pyknosis and particle aggregation (NA) in the nucleus,moderate expansion and degranulation of the endoplasmic reticulum (RER),severe swelling of mitochondria (MI),disappearance of cristae and vacuolation can be seen in the cells of the retinal inner nuclear layer.C1W,C3W were control 1 week,3 weeks group;FD1W,FD3W were form deprivation 1 week,3 weeks group.

3 討論

人類高度近視通常伴隨著眼底的退行性改變，包括脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮、后鞏膜葡萄腫和脈絡(luò)膜新生血管，這些眼底改變將導(dǎo)致不同程度的視力下降。此前，在人類高度近視眼和近視動(dòng)物模型中都觀察到視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡[5,23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，雛雞形覺剝奪3周的近視模型在出現(xiàn)視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)病理改變之前，已經(jīng)出現(xiàn)視網(wǎng)膜細(xì)胞線粒體的重度腫脹，bcl-2下調(diào)，bax和caspase-3等凋亡信號(hào)通路蛋白的上調(diào)，它們可能是視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的早期表現(xiàn)，可能導(dǎo)致了后期的近視進(jìn)展及視網(wǎng)膜病理改變過程。

在目前的研究中，雛雞形覺剝奪1 周和3 周后的眼球切片HE染色結(jié)果未見明顯的結(jié)構(gòu)紊亂，其彩色立體眼底照片也顯示玻璃體腔清亮，屈光介質(zhì)透明，眼底未見炎癥或變性表現(xiàn)。同時(shí)ERG顯示2組雛雞視桿和視錐細(xì)胞功能均未見明顯差異，提示此次研究中，形覺剝奪并未直接導(dǎo)致雛雞視網(wǎng)膜形態(tài)和功能受損。

以往有很多以形覺剝奪動(dòng)物模型為對(duì)象的研究，多對(duì)鞏膜差異表達(dá)的分子進(jìn)行檢測(cè)，分析鞏膜重塑影響近視進(jìn)展的可能通路[25-27]，或針對(duì)視網(wǎng)膜蛋白表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)，例如多巴胺及其初級(jí)代謝產(chǎn)物[28-29]。但既往研究很少且很難分析上游視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，究竟通過何種機(jī)制調(diào)控下游鞏膜的重塑，從而影響近視的發(fā)生與發(fā)展。因此研究者試圖從病理性近視視網(wǎng)膜病變機(jī)制進(jìn)行探索。Xu等[5]在研究人近視視網(wǎng)膜變性時(shí)發(fā)現(xiàn)，在摘除的人病理性近視眼球中，視網(wǎng)膜光感受細(xì)胞層存在細(xì)胞凋亡，可能是近視視功能下降的重要原因。Pruett[30]也發(fā)現(xiàn)在病理性近視導(dǎo)致后鞏膜葡萄腫時(shí)，有大量的光感受細(xì)胞發(fā)生凋亡。有研究者發(fā)現(xiàn)隨著形覺剝奪性近視的海藍(lán)雞AL不斷拉長(zhǎng)，在第12周時(shí)，海藍(lán)雞視網(wǎng)膜開始出現(xiàn)病理性改變，外核層和內(nèi)核層可見凋亡細(xì)胞核和凋亡小體，且視網(wǎng)膜中caspase-3樣蛋白酶活性升高[31]。因此，有觀點(diǎn)認(rèn)為高度近視視網(wǎng)膜病理性改變與凋亡有明顯的相關(guān)性，且caspase-3等凋亡信號(hào)通路或參與其中。細(xì)胞凋亡受到內(nèi)部凋亡刺激因子的作用，可激活細(xì)胞內(nèi)部線粒體凋亡途徑[32-33]。bcl-2家族蛋白是控制細(xì)胞凋亡的主要調(diào)節(jié)因子，它可以控制線粒體相關(guān)的凋亡因子釋放，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡，bax與bcl-2同源，當(dāng)其表達(dá)時(shí)可拮抗bcl-2 的保護(hù)作用致使細(xì)胞凋亡增加。當(dāng)線粒體的膜電位下降時(shí)，bcl-2 表達(dá)水平下降，bax表達(dá)水平上升，線粒體膜通透性增加，線粒體內(nèi)的促凋亡因子如細(xì)胞色素C會(huì)釋放到細(xì)胞質(zhì)中。與Apaf-1相互作用形成凋亡復(fù)合體，進(jìn)一步激活caspase-3和caspase-7，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究旨在探索近視動(dòng)物模型中，這一病理性改變過程最早何時(shí)開始出現(xiàn)，為早期進(jìn)行相關(guān)干預(yù)提供依據(jù)。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，形覺剝奪1周雛雞視網(wǎng)膜蛋白即開始出現(xiàn)凋亡相關(guān)因子表達(dá)改變，而透射電子顯微鏡在形覺剝奪3周時(shí)開始觀察到視網(wǎng)膜細(xì)胞中出現(xiàn)了染色質(zhì)固縮聚集和核孔處染色質(zhì)顆粒，細(xì)胞質(zhì)中線粒體重度腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中度擴(kuò)張、脫顆粒等細(xì)胞損傷的現(xiàn)象，提示視網(wǎng)膜細(xì)胞處于細(xì)胞凋亡過程。如果在這個(gè)階段從細(xì)胞凋亡調(diào)控途徑入手，予以有效的藥物或基因干預(yù)，將會(huì)為近視進(jìn)展調(diào)控提供新思路。

本研究通過檢測(cè)形覺剝奪1周和3周雛雞模型在近視進(jìn)展早期視網(wǎng)膜中蛋白表達(dá)量的變化，首次證明了形覺剝奪性近視的雞在出現(xiàn)病理性改變之前，視網(wǎng)膜中bcl-2、bax、caspase-3、caspase-8等均已經(jīng)出現(xiàn)表達(dá)水平顯著變化，提示細(xì)胞凋亡上調(diào)，視網(wǎng)膜細(xì)胞中出現(xiàn)了染色質(zhì)聚集，線粒體的形態(tài)變化，重度腫脹，結(jié)合凋亡相關(guān)因子的變化，提示視網(wǎng)膜發(fā)生了細(xì)胞凋亡，為近視早期進(jìn)展與凋亡的關(guān)系提供了新的證據(jù)，提示了新的可能的早期近視調(diào)控通路。未來需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)探索揭示凋亡相關(guān)因子的表達(dá)變化調(diào)控形覺剝奪性近視進(jìn)展的具體機(jī)制，探討近視防控的可能靶點(diǎn)。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明王田甫：負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)研究并撰寫論文，包括設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、數(shù)據(jù)采集、分析數(shù)據(jù)、起草及修訂文章；根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行修改。徐瓊、王凱、李巖：參與選題、設(shè)計(jì)和修改論文的結(jié)果、結(jié)論。朱莉：參與選題、設(shè)計(jì)、資料的分析和解釋。才藝：參與數(shù)據(jù)采集、分析數(shù)據(jù)、起草文章。趙明威：指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)，對(duì)論文知識(shí)性內(nèi)容作批判性審閱