肺癌相關(guān)自身抗體P53、CAGE在實(shí)性肺結(jié)節(jié)良惡性篩查中的臨床價(jià)值

張夢(mèng)蘭 王鈺吉 馬夕燕 曾大雄

肺癌的發(fā)病率和死亡率很高，早期篩查方法有胸部計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、血清腫瘤標(biāo)志物等[1]。胸部CT對(duì)磨玻璃結(jié)節(jié)、混合密度結(jié)節(jié)有較高的準(zhǔn)確性，但對(duì)實(shí)性結(jié)節(jié)，特別是2cm以下的準(zhǔn)確性明顯下降[2-3]。血清腫瘤標(biāo)志物主要用于監(jiān)控腫瘤復(fù)發(fā)，但敏感性不高，對(duì)早期篩查價(jià)值有限[4]。在肺癌早期，腫瘤相關(guān)抗原可被免疫系統(tǒng)識(shí)別，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體[5]。我國(guó)主流的肺癌抗體包括P53、SOX2、PGP9.5、GAGE7、GBU4-5、CAGE及MAGEA1七項(xiàng)，但既往研究結(jié)果缺乏較好的一致性[6-7]。此外，較少有研究探討血清自身抗體對(duì)實(shí)性肺結(jié)節(jié)良惡性篩查的價(jià)值。如何選擇更優(yōu)化、更經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)組合需進(jìn)一步探索。本文回顧性分析了P53及CAGE等肺癌相關(guān)抗體檢測(cè)在肺結(jié)節(jié)，特別是實(shí)性肺結(jié)節(jié)中良惡性篩查的臨床價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2016年1月至2020年12月就診于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院被診斷為“孤立性肺結(jié)節(jié)”病例381例，按納入、排除標(biāo)準(zhǔn)篩選后，排除35例，納入346例患者，其中男性158(158/346, 45.66%)例，女性188(188/346, 54.34%)例，平均年齡(52.10±12.96)歲。其中病理結(jié)果明確為肺癌的患者有156例，包括7例肺鱗癌，145例肺腺癌，2例小細(xì)胞肺癌，2例其它類型的非小細(xì)胞肺癌(1例為肺淋巴上皮瘤樣癌，1例為肺肉瘤樣癌)，納入肺癌組。190例非肺癌患者的病理結(jié)果包括慢性炎癥、機(jī)化性肺炎、肺大皰、肺結(jié)核等(34例)。156例經(jīng)多學(xué)科會(huì)診后不考慮進(jìn)一步檢查或手術(shù)，并隨訪至少2年后無(wú)進(jìn)展，納入非肺癌組。本研究中肺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)為《2015版WHO肺部腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)》。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[(2022)倫研批第369號(hào)]，患者對(duì)本次研究知悉，并均簽署知情同意書(shū)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：1) 均行胸部CT檢查及肺癌抗體檢測(cè)；2) 均未接受相關(guān)抗腫瘤治療，如化療、放療及免疫治療，或口服靶向藥物治療等。

排除標(biāo)準(zhǔn)：1) 有嚴(yán)重的自身免疫病、長(zhǎng)期使用免疫抑制者；2) 有其它部位明確的惡性腫瘤者；3) 經(jīng)多學(xué)科會(huì)診后考慮為肺部腫瘤，但未獲得明確病理結(jié)果[8-9]。

二、標(biāo)本的采集與檢測(cè)

采集研究對(duì)象的空腹晨血2 mL，離心后使用ELISA試劑盒(試劑盒均購(gòu)自杭州保羅有限公司)，嚴(yán)格參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。七項(xiàng)自身抗體陽(yáng)性參考值分別為：P53≥13.1 U·mL-1，PGP9.5≥11.1U·mL-1，SOX2≥10.3U·mL-1，GAGE7≥14.4U·mL-1，GBU4-5≥7 U·mL-1，MAGEA1≥11.9 U·mL-1，CAGE≥7.3U·mL-1記為陽(yáng)性表達(dá)，反之為陰性表達(dá)。七項(xiàng)肺癌自身抗體中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則將肺癌自身抗體檢測(cè)結(jié)果判定為陽(yáng)性。

三、胸部薄層CT檢查方法

所有患者均行胸部薄層CT檢測(cè)，取仰臥位，配合吸氣、屏氣及呼氣，掃描范圍：頸根部至肋膈角，掃描后記錄肺結(jié)節(jié)的位置、大小、形態(tài)、密度、內(nèi)部特征、鄰近結(jié)構(gòu)改變等，所有胸部CT圖像均由2名放射科醫(yī)師觀察肺結(jié)節(jié)的各項(xiàng)指標(biāo)，綜合分析并作出診斷。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料通過(guò)K-S檢驗(yàn)得出不呈正態(tài)分布，使用中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25,P75)]表示，兩組間比較選用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及陽(yáng)性率表示，組間比較選用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)；檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用二分類Logistic回歸計(jì)算聯(lián)合檢測(cè)指標(biāo)預(yù)測(cè)值。每一項(xiàng)自身抗體單獨(dú)檢測(cè)結(jié)果、聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果均采用受試者工作曲線(receiver operation characteristic, ROC曲線)及曲線下面積(area under curve, AUC)評(píng)價(jià)其診斷效能，并計(jì)算敏感度、特異度、準(zhǔn)確率等。

結(jié) 果

一、肺癌相關(guān)自身抗體在肺癌組與非肺癌組中的血清表達(dá)水平

肺癌組患者的P53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGEA1和CAGE七項(xiàng)自身抗體水平均高于非肺癌組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。肺癌組患者的七項(xiàng)自身抗體陽(yáng)性檢測(cè)率高于非肺癌組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

二、肺癌相關(guān)自身抗體單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肺癌患者診斷效能評(píng)估

對(duì)肺癌組和非肺癌組患者繪制ROC曲線，評(píng)估七項(xiàng)自身抗體單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能(見(jiàn)圖1A)。結(jié)果顯示：P53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGEA1和CAGE 七項(xiàng)指標(biāo)的單項(xiàng)AUC均大于0.50，其中P53的靈敏度最高，為82.7%，特異度為49.5%，ROC曲線下面積AUC為0.701，為曲線下面積最大者。CAGE的特異性為83.7%，為特異性最高的指標(biāo)。P53的靈敏度顯著高于其于6項(xiàng)指標(biāo)，將其與特異性最高的3項(xiàng)指標(biāo)，CAGE(83.7%)、MAGEA1(81.6%)、PGP9.5(81.1%)組合：P53聯(lián)合PGP9.5的靈敏度為91.6%，特異性為40.1%，AUC為0.735；P53聯(lián)合CAGE的靈敏度為90.9%，特異性為41.4%，AUC為0.730；P53聯(lián)合MAGEA1的靈敏度為89.8%，特異性為40.4%，AUC為0.712。七項(xiàng)自身抗體聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度為94.9%，特異度為61.6%，AUC為0.846(見(jiàn)表2)。

表1 肺癌相關(guān)自身抗體在不同肺結(jié)節(jié)組別中的表達(dá)水平比較

三、肺癌相關(guān)自身抗體單項(xiàng)在實(shí)性肺結(jié)節(jié)患者中的表達(dá)水平

在肺實(shí)性結(jié)節(jié)患者中，肺癌組患者的P53和PGP9.5的自身抗體水平均高于非肺癌組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。P53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGEA1陽(yáng)性檢測(cè)率高于非肺癌組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

四、肺癌相關(guān)自身抗體單項(xiàng)對(duì)實(shí)性肺結(jié)節(jié)患者診斷效能評(píng)估

對(duì)肺實(shí)性結(jié)節(jié)患者中的肺癌組與非肺癌組患者繪制ROC曲線，分析七項(xiàng)自身抗體單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肺實(shí)性結(jié)節(jié)中肺癌患者的診斷效能，(見(jiàn)圖1B)。結(jié)果顯示，P53及MAGEA1的靈敏度為77.3%，為靈敏度最高的指標(biāo)，P53的AUC為0.71，為曲線下面積最大者。將P53、MAGEA1與特異性最高的CAGE、GAGE7(93.0%、92.7%)聯(lián)合：P53與GAGE7聯(lián)合的靈敏度為81.4%，特異性為50.7%，AUC為0.651；P53與CAGE聯(lián)合的靈敏度為84.6%，特異性為50.9%，AUC為0.706；MAGEA1與CAGE聯(lián)合的靈敏度為84.6%，特異性為34.6%，AUC為0.617；MAGEA1與GAGE7聯(lián)合的靈敏度為81.4%，特異性為34.5%，AUC為0.500。七項(xiàng)自身抗體聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度為95.5%，特異度為69.8%，AUC為0.853(見(jiàn)表3)。

圖1 肺癌相關(guān)自身抗體在肺結(jié)節(jié)、實(shí)性肺結(jié)節(jié)的良惡性鑒別中的診斷效能比較

表2 肺癌相關(guān)自身抗體在所有肺結(jié)節(jié)的良惡性鑒別中的診斷效能(n=346)

表3 肺癌相關(guān)自身抗體在實(shí)性肺結(jié)節(jié)的良惡性鑒別中的診斷效能(n=108)

討 論

在腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期，腫瘤細(xì)胞即會(huì)向機(jī)體分泌多種類和數(shù)量的異常蛋白和蛋白酶體，刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的自身抗體，同時(shí)還不同程度地激活機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生自身反應(yīng)性免疫應(yīng)答，刺激B細(xì)胞分泌腫瘤相關(guān)抗原[10]。腫瘤相關(guān)自身抗體的血清半衰期較長(zhǎng)，可在血液中穩(wěn)定持續(xù)存在較長(zhǎng)時(shí)間，并且自身抗體的分泌遠(yuǎn)早于臨床癥狀的出現(xiàn)[11-15]。因此，及時(shí)檢測(cè)這些蛋白或自身抗體將有助于早期肺癌的篩查。

在本研究中，七項(xiàng)肺癌相關(guān)自身抗體的血清表達(dá)水平及陽(yáng)性檢測(cè)率在肺癌組和非肺癌組中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，能較好地區(qū)別肺部結(jié)節(jié)的良惡性，與Du Q.、賈金芳等人的研究結(jié)果基本一致[16-17]。準(zhǔn)確率、陽(yáng)性似然比和陰性似然比均反映診斷結(jié)果的可信度，屬于同時(shí)反映靈敏度和特異性的指標(biāo)，但由于本研究中存在沒(méi)有意義的計(jì)算值，故采用靈敏度、特異性及ROC曲線下面積來(lái)表示診斷效能。在肺癌相關(guān)自身抗體單項(xiàng)檢測(cè)中，P53靈敏度為82.7%，遠(yuǎn)高于其它自身抗體指標(biāo)，但特異性最低(49.5%)，CAGE的特異性最高為83.7%，七項(xiàng)自身抗體聯(lián)合的靈敏度為94.9%，特異性為61.6%，AUC高達(dá)0.846。而Ren等[18]的研究提示七項(xiàng)自身抗體聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度為61%，特異性為90%，可能與納入樣本量及腫瘤、遺傳、環(huán)境因素的異質(zhì)性有關(guān)，也可能與研究對(duì)象的免疫狀態(tài)相關(guān)。P53聯(lián)合CAGE的靈敏度為90.9%，與P53聯(lián)合PGP9.5、P53聯(lián)合MAGEA1聯(lián)合的靈敏度接近(91.6%、89.8%)，稍次于七項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合(94.9%)，AUC曲線下面積為0.730，具有較好的診斷價(jià)值。在此項(xiàng)研究中，P53聯(lián)合CAGE具有較高的靈敏度，優(yōu)于P53單項(xiàng)指標(biāo)靈敏度，而CAGE單項(xiàng)指標(biāo)具有最高的特異性，可作為早期肺癌篩查指標(biāo)，說(shuō)明或可P53、CAGE替代七項(xiàng)肺癌相關(guān)自身抗體檢測(cè)，以顯著節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本，但仍需要進(jìn)行更大樣本的研究。研究證實(shí)P53與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)[19]，在肺癌早期已經(jīng)發(fā)生突變和異常表達(dá)[20]，其突變率可達(dá)50%以上[21-22]，突變后大量表達(dá)的突變型P53蛋白, 引起機(jī)體自身的免疫應(yīng)答, 產(chǎn)生自身抗體。MAGEA1、CAGE為腫瘤-睪丸抗原，僅在睪丸及惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，不表達(dá)于正常組織[23]。PGP9.5是一種表達(dá)在神經(jīng)組織中的泛素水解酶，肺癌早期階段出現(xiàn)高表達(dá)，從而提示肺癌的發(fā)生發(fā)展[24]。

肺實(shí)性結(jié)節(jié)，特別是直徑小于2cm的實(shí)性肺結(jié)節(jié)通常不具有明顯的影像形態(tài)學(xué)特征，良惡性鑒別有較大難度。在肺癌患者中，肺實(shí)性結(jié)節(jié)與非實(shí)性結(jié)節(jié)的抗體表達(dá)水平、陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)明顯差異。在108例肺實(shí)性結(jié)節(jié)患者中，肺癌組患者的P53和PGP9.5的自身抗體水平及各項(xiàng)抗體的陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于非肺癌組，P53及MAGEA1的靈敏度為77.3%，為最靈敏的指標(biāo)，P53的AUC為0.71，為曲線下面積最大者。CAGE的特異性為93.0%，為特異性最高的指標(biāo)。七項(xiàng)自身抗體聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度為95.5%，特異度69.8%和AUC為0.853，對(duì)肺實(shí)性小結(jié)的良惡性鑒別具有一定的臨床意義。P53聯(lián)合CAGE的靈敏度與MAGEA1聯(lián)合CAGE的靈敏度均為84.6%，僅次于七項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合(95.5%)，而P53的總體診斷效能優(yōu)于MAGEA1，同上述早期肺結(jié)節(jié)的結(jié)論相似。研究發(fā)現(xiàn)，P53是目前與人類腫瘤最密切相關(guān)的基因，Mattioni等[25]的研究顯示P53在非肺癌患者中呈陰性，Teng等[26]的項(xiàng)研究表明，在非肺癌患者中的非實(shí)性結(jié)節(jié)的P53陽(yáng)性率低于肺癌患者。GAGE7在多種惡性腫瘤中均有表達(dá)，MAGEA1、CAGE在除睪丸以外的正常組織中不表達(dá)，但在肺癌中高度表達(dá)[27-28]。但本次研究中肺實(shí)性結(jié)節(jié)的樣本數(shù)量較少，七項(xiàng)肺癌抗體與肺實(shí)性結(jié)節(jié)的良惡性篩查仍需大量樣本和多中心研究進(jìn)一步探索。

綜上，本研究結(jié)果表明肺癌相關(guān)自身抗體中的P53及CAGE兩項(xiàng)自身抗體指標(biāo)檢測(cè)在肺結(jié)節(jié)，特別是在實(shí)性肺結(jié)節(jié)的良惡性篩查中具有較高的靈敏度及特異性，可以作為早期肺癌篩查的有力補(bǔ)充工具之一。當(dāng)然，其具體的臨床價(jià)值還有待于更大規(guī)模和更多中心的進(jìn)一步研究證實(shí)，以期為臨床診斷提供更為全面的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。