橋本甲狀腺炎肝郁脾虛證患者腸道菌群特征探索性研究

高云逸 ，孟淑華 ，肖瑤 ，魏軍平

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京市西城區(qū)廣外醫(yī)院，北京 100055；3.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053

橋本甲狀腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）又稱慢性淋巴細胞性甲狀腺炎，是一種自身免疫性甲狀腺炎。甲狀腺在組織胚胎學(xué)上由原始消化管的前腸部分分化而來。腸道菌群參與宿主的代謝、免疫調(diào)節(jié)、維持胃腸道穩(wěn)態(tài)等生理活動[1]。既往研究表明，實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠腸道菌群組成發(fā)生明顯變化，其中厚壁菌門Firmicutes相對豐度顯著升高，擬桿菌門Bacteroidetes相對豐度下降[2]，因此腸道菌群物種組成和豐度改變可能與HT相關(guān)。HT屬中醫(yī)學(xué)“癭病”范疇，現(xiàn)代醫(yī)家多認為，HT與情志不暢有關(guān)[3-4]。肝喜條達而惡抑郁，肝失疏泄則氣機郁結(jié)，肝木克脾土，則脾氣受損，水液運化失司，痰氣互結(jié)于頸部而發(fā)病。一項關(guān)于新診斷HT的橫斷面研究結(jié)果顯示，肝郁脾虛證占觀察人數(shù)的63.3%[5]，因此，我們認為肝郁脾虛為本病的主要特點，貫穿始終。本研究采用腸道菌群分析法對HT肝郁脾虛證患者、HT非肝郁脾虛證患者和健康人群進行腸道菌群檢測，以觀察HT及HT肝郁脾虛證患者腸道菌群特征?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 病例來源

選取2020年10月－2021年12月中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院、北京市西城區(qū)廣外醫(yī)院內(nèi)分泌門診HT患者。同時納入健康體檢者10例為健康對照組。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準

依據(jù)《中國甲狀腺疾病診治指南——甲狀腺炎》[6]制定HT診斷及分期標準。

1.2.2 中醫(yī)辨證標準

參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[7]制定肝郁脾虛證辨證標準。主癥：胃脘或脅肋脹痛，腹脹，食少納呆，便溏不爽；次癥：情緒抑郁或急躁易怒，善太息，腸鳴矢氣，腹痛即瀉，瀉后痛減，舌苔白或膩，脈弦或細。符合主癥3項，或主癥2項、次癥2項即可明確辨證。非肝郁脾虛證參考《中醫(yī)常見證診斷標準》[8-9]進行辨證。

1.3 納入標準

HT患者：①年齡18～65歲；②符合上述西醫(yī)診斷標準；③近3個月未服用中藥（包括中成藥、成分明確的湯劑和成分未知的方藥等）；④近3個月未服用硒制劑；⑤近6個月未服用抗生素類藥物；⑥近3個月未服用益生菌/益生元或其他微生態(tài)調(diào)節(jié)劑；⑦近6個月未罹患急性胃腸炎等腸道相關(guān)疾病。符合肝郁脾虛證辨證標準者納入HT肝郁脾虛組，其他證型者均納入HT非肝郁脾虛組。

健康對照組：①年齡18～65歲；②無HT相關(guān)疾病或相關(guān)疾病家族病史；③近3個月未服用中藥（包括中成藥、成分明確的湯劑和成分未知的偏方等）；④近3個月未服用益生菌/益生元或其他微生態(tài)調(diào)節(jié)劑；⑤近6個月未患有感染性疾病或服用抗生素類藥物；⑥近6個月未罹患急性胃腸炎等腸道相關(guān)疾病。

1.4 排除標準

①合并Graves病者；②妊娠或備孕婦女、哺乳期婦女；③有嚴重心、肝、腎、腦、血液系統(tǒng)等并發(fā)癥或合并其他嚴重原發(fā)性疾病、精神病患者；④不能配合完成試驗期間實驗室檢查及問卷調(diào)查者。

1.5 調(diào)查內(nèi)容

①受試者一般資料，包括性別、年齡、身高、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）等；②甲狀腺功能及自身抗體水平：血清游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）、總?cè)饧谞钕僭彼幔═T3）、總甲狀腺素（TT4）、促甲狀腺激素（TSH）、甲狀腺過氧化物酶抗體（TPO-Ab）、甲狀腺球蛋白抗體（Tg-Ab）；③甲狀腺超聲檢查結(jié)果；④中醫(yī)基本癥狀，如是否有脘脅脹痛，食少納差，腹痛欲瀉、瀉后痛減，情緒抑郁，煩躁易怒等。

1.6 16S rRNA基因測序

受試者簽署知情同意書后，研究人員準備糞便樣本收集套裝并收集受試者新鮮糞便樣本2 g，立即放入-80 ℃冰箱保存。隨后使用常規(guī)方法提取DNA、設(shè)計引物、PCR擴增、產(chǎn)物純化、檢測純度和濃度，構(gòu)建文庫、測序，并根據(jù)樣本物種信息進行豐富度和結(jié)構(gòu)分析、差異性比較。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以±s表示，所有正態(tài)分布、方差齊數(shù)據(jù)2組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般信息

HT肝郁脾虛組9例，均為女性，平均年齡（41±12）歲，BMI（22.33±1.66）kg/m2；HT非肝郁脾虛組12例，包括男性2例、女性10例，平均年齡（39±10）歲，BMI（23.83±2.21）kg/m2；健康對照組10例，包括男性1例、女性9例，平均年齡（37±12）歲，BMI（21.90±1.79）kg/m2。3組受試者性別、年齡、BMI比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。性別分布符合既往HT流行調(diào)查研究結(jié)果[10]。

2.2 橋本甲狀腺炎患者甲狀腺功能及自身抗體水平

HT肝郁脾虛組患者甲狀腺功能正常6例，亞甲減期3例，甲減期0例；HT非肝郁脾虛組患者甲狀腺功能正常6例，亞甲減期6例，甲減期0例。2組甲狀腺功能及自身抗體水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 腸道菌群分析結(jié)果

本研究受試者31個樣本經(jīng)序列拼接、過濾后，共產(chǎn)生1 280 526個序列。使用USEARCH根據(jù)序列相似度將序列聚類為操作分類單元（OTU），相似度閾值為97%，將稀有序列棄去，最終共聚類為16 941個OTU，以O(shè)TU為基礎(chǔ)進行多樣性分析。

2.3.1 OTU數(shù)目及物種豐度

一組含有多個樣本時，若檢測到某個OTU的樣本數(shù)達到50%以上，則認為這一組含有該OTU。HT非肝郁脾虛組、HT肝郁脾虛組、健康對照組腸道菌群樣品平均OTU數(shù)目分別為（601±250）個、（442±176）個、（623±177）個，其中健康對照組腸道菌群OTU數(shù)目較多，但3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.086）。各組間共有和各自特有OTU數(shù)目即OTU組成相似性及重疊情況見圖1。3組共有的OTU共171個，HT肝郁脾虛組、HT非肝郁脾虛組、健康對照組特有的OTU分別為39個、16個、210個。

圖1 3組受試者腸道菌群OTU Venn圖

2.3.2 OTU主坐標分析

主坐標分析（PCoA）結(jié)果見圖2。與HT患者腸道菌群樣本相比，健康對照組腸道菌群樣本OTU組成分布相對集中，表明健康對照人群腸道菌群主成分相似度高于HT患者。

圖2 3組受試者腸道菌群OTU PCoA二維圖

2.3.3 Alpha多樣性比較

Alpha多樣性包括豐富度、均勻度、多樣性等，使用mothur計算Alpha多樣性指數(shù)。sobs表示觀察到的物種數(shù)，即OTU數(shù)；chao指數(shù)和ace指數(shù)反映樣品中群落的豐富度；shannon指數(shù)越大表明多樣性越高；simpson指數(shù)越小表明多樣性越高。HT肝郁脾虛組多樣性較高，但與其他2組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 3組受試者腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)（±s）

表1 3組受試者腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)（±s）

指數(shù)sobs chao ace shannon simpson HT肝郁脾虛組601.22±249.81 716.43±262.19 726.44±266.55 3.28±0.99 0.17±0.13 HT非肝郁脾虛組442.08±176.35 557.40±194.09 578.70±211.08 2.63±0.92 0.24±0.16健康對照組622.50±176.76 765.10±188.97 776.20±200.96 3.23±0.55 0.17±0.10 F值2.688 2.853 2.306 2.011 1.011 P值0.086 0.075 0.118 0.153 0.377

2.3.4 物種分布及其豐度比較

以目、屬分類水平為例，本研究所有樣品共注釋到20個優(yōu)勢菌目、39個優(yōu)勢菌屬（不包含unclassified），結(jié)果見圖3、圖4、表2、表3。從目水平來看，HT患者的梭菌目Clostridiales相對豐度較健康對照組偏低，HT肝郁脾虛組高于HT非肝郁脾虛組；HT患者的擬桿菌目Bacteroidales相對豐度較健康對照組偏高，而HT肝郁脾虛組低于HT非肝郁脾虛組。從屬水平來看，3組擬桿菌屬Bacteroides相對豐度差異不大；HT肝郁脾虛組棲糞桿菌屬Faecalibacterium相對豐度低于HT非肝郁脾虛組和健康對照組；HT患者普氏菌屬Prevotella相對豐度明顯高于健康對照組。

圖3 3組受試者腸道菌群目水平分布

圖4 3組受試者腸道菌群屬水平分布

表2 3組受試者腸道菌群目水平相對豐度（前10位，%）

表3 3組受試者腸道菌群屬水平相對豐度（前10位，%）

3 討論

腸道菌群是人體內(nèi)復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，種類及數(shù)量龐大，與人類共生，其基因組有人類“第二基因組”之稱[11]。近年來，腸道菌群失調(diào)與疾病關(guān)系越來越受到國內(nèi)外研究者的重視。HT是自身免疫性疾病的一種，有研究報道，腸道菌群通過甲狀腺-腸軸參與HT發(fā)生發(fā)展并改變甲狀腺功能[12]。腸道菌群受年齡、BMI等因素影響，因此本研究根據(jù)HT患者基本情況匹配健康志愿者以減少偏倚。

本研究結(jié)果表明，HT肝郁脾虛證患者腸道菌群物種相對豐度發(fā)生改變，并且與HT非肝郁脾虛證患者腸道菌群物種豐度也有一定差異，提示HT患者腸道菌群改變與證候有一定關(guān)系。但本研究HT肝郁脾虛組部分患者兼有血瘀、氣虛等證，HT非肝郁脾虛組包含肝郁化火、脾腎陽虛、肝郁氣滯、脾腎氣虛等證型，這可能對HT肝郁脾虛組和HT非肝郁脾虛組腸道菌群差異性分析造成影響。

本研究結(jié)果顯示，健康人群擬桿菌目相對豐度低于HT肝郁脾虛證患者及非肝郁脾虛證患者，這與既往研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺功能減退型HT患者腸道擬桿菌門數(shù)量顯著多于甲狀腺功能正常型HT患者一致[13]。研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌目可以促進結(jié)腸中上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)目增加，進而以髓樣分化因子88依賴的方式產(chǎn)生白細胞介素-6（IL-6）[14]，IL-6參與HT免疫紊亂，與Th1/Th2比例失衡相關(guān)[15]，提示擬桿菌目豐度增高可能是HT轉(zhuǎn)歸的危險因素。此外，HT肝郁脾虛證多見于疾病早中期，后期多為脾腎陽虛證，脾運化功能失常可引起腸道微生態(tài)系統(tǒng)失去自穩(wěn)狀態(tài)，使腸道菌群失調(diào)，從而通過免疫相關(guān)機制對甲狀腺產(chǎn)生影響，還可影響與HT相關(guān)的碘、硒等微量元素的代謝吸收。因此，這一研究結(jié)果還提示腸道菌群物種分布和豐度可能與HT疾病存在相關(guān)性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，HT患者普氏菌屬相對豐度明顯高于健康人群。有研究顯示，普氏菌屬豐度較高的女性表現(xiàn)較高水平的負面情緒，如焦慮、苦惱和敏感性等[16]，而情志不暢與HT關(guān)系密切，HT患者伴隨焦慮、抑郁狀態(tài)的發(fā)病率遠高于一般人群[17]，所以普氏菌屬可能與HT相關(guān)。但也有研究認為，普氏菌屬部分成員的豐度與Th17呈負相關(guān)，并可抑制促炎因子水平[18-19]，而國內(nèi)外研究多認為Th17/Treg比例失衡是HT發(fā)生、發(fā)展的重要原因[20-21]，所以普氏菌屬的部分成員還可能是HT發(fā)病的保護因素。HT患者腸道菌群普氏菌屬的多樣性和豐富度與HT的相關(guān)性還有待進一步研究。