近紅外漫反射光譜法快速測定麥冬多指標(biāo)成分含量

祁梅 ，顧志榮， ，李芹 ，王安紅 ，葛斌

1.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省中醫(yī)藥研究中心，甘肅 蘭州 730000；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000

麥冬為百合科沿階草屬植物麥冬Ophiopogon japonicus（L. f.）Ker-Gawl.的干燥塊根，被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品[1]，主要產(chǎn)于四川三臺和浙江杭州一帶，分別稱為“川麥冬”和“浙麥冬”，其中浙麥冬品質(zhì)較川麥冬為優(yōu)，但生產(chǎn)周期較川麥冬長，種植成本高，且近年生產(chǎn)規(guī)模有所萎縮[2]。二者屬于不同產(chǎn)地的同一種屬來源的中藥，其化學(xué)成分及藥理作用相同。研究表明，麥冬含有皂苷類、黃酮類、多糖類等有效成分[3]，具有抗動脈粥樣硬化[4]、抗心肌缺血[5]、抗腫瘤[6]、抗炎[7]、抗氧化[8]、增強免疫[9]、鎮(zhèn)咳[10]、降血糖[11]等廣泛的作用。

2020年版《中華人民共和國藥典》麥冬項下僅以總皂苷含量進(jìn)行質(zhì)量控制，未將其他有效成分、有效部位或指標(biāo)性成分作為質(zhì)控指標(biāo)[12]，因此難以對麥冬進(jìn)行快速、全面的質(zhì)量控制與評價。目前已實現(xiàn)麥冬中總皂苷、總黃酮、總多糖的近紅外光譜（NIR）快速測定[13-14]，對完善麥冬的質(zhì)量控制體系作出了技術(shù)示范，但主要指標(biāo)性成分及單體有效成分的快速測定對麥冬的質(zhì)量控制更具有實際價值，而鮮見報道。本研究采集不同產(chǎn)區(qū)、不同采收期的麥冬樣品，建立其代表性成分麥冬皂苷B、麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B含量的NIR定量分析模型，實現(xiàn)其含量的快速測定，為麥冬的快速、全面質(zhì)量控制與評價提供參考。

1 儀器與試藥

Nicolet-6700型傅里葉變換近紅外光譜儀（美國Thermo公司），Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），Alltech 3300型蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD，美國Grace公司），Milli-Q Advantage A10超純水儀（法國Merck Millipore公司），DZF-6090型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），AL204型萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），DD-5M型離心機（湘儀離心機儀器有限公司），SB25-12DTD型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

120批麥冬樣品，采集（購買）于四川、浙江的3個主要產(chǎn)區(qū)，見表1。所有樣品均經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為百合科沿階草屬植物麥冬Ophiopogon japonicus（L. f.）Ker-Gawl.的干燥塊根[12]。將樣品粉碎至過80目篩，冷藏備用。麥冬皂苷B對照品（批號CHB180122）、麥冬皂苷D對照品（批號CHB180120）、麥冬皂苷D′對照品（批號CHB180121）、甲基麥冬二氫高異黃酮A對照品（批號CHB190119）、甲基麥冬二氫高異黃酮B對照品（批號CHB190125），成都克洛瑪生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不低于98%；甲醇、乙腈均為色譜純，天津大茂化學(xué)試劑廠；其他試劑均為分析純。

表1 麥冬樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 近紅外光譜采集

儀器預(yù)熱30 min后，采用積分球漫反射方式采集NIR。取于60 ℃干燥至恒重的麥冬粉末適量，混勻，置于樣品旋轉(zhuǎn)杯內(nèi)，壓實，以內(nèi)置背景為參比，掃描范圍10 000～4 000 cm-1，掃描64次，分辨率8 cm-1，溫度（25±0.5）℃，相對濕度20%～30%，每批樣品重復(fù)采集3次，取平均光譜[15]。120批麥冬樣品NIR疊加圖見圖1。

圖1 120批麥冬樣品NIR疊加圖

2.2 化學(xué)參考值測定

2.2.1 供試品溶液制備

精密稱取麥冬粉末約4.0 g，置于具塞三角瓶中，精密加入甲醇溶液50 mL，超聲（頻率40 kHz，功率500 W）提取60 min，過濾，濾液60 ℃水浴蒸至近干，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，用甲醇洗滌并定容至刻度線，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 混合對照品溶液制備

分別精密稱取麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、麥冬皂苷B、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B 7.72、8.62、5.51、10.14、7.53 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲使完全溶解，并以甲醇定容至25 mL，制成濃度分別為0.308 8、0.344 8、0.220 4、0.405 6、0.301 2 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 色譜條件

檢測器為ELSD，采用Agilent Extend C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-水（B）為流動相，梯度洗脫（0～60 min，35%A → 65%A），流速1 mL/min，柱溫35 ℃，漂移管溫度100 ℃，氮氣流速3.0 L/min，進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見圖2。

圖2 麥冬中5種成分HPLC圖

2.2.4 方法學(xué)考察及含量測定

經(jīng)方法學(xué)考察，5種成分線性回歸方程相關(guān)系數(shù)為0.998 8～0.999 5；精密度試驗結(jié)果表明，5種成分峰面積RSD為0.71%～0.93%；穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，5種成分的溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定；重復(fù)性試驗結(jié)果表明，5種成分峰面積RSD為1.45%～1.85%；5種成分平均加樣回收率為98.93%～102.33%，RSD為1.76%～2.21%。表明本試驗所采用的儀器及方法誤差均符合要求。按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定峰面積，采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中5種成分含量的化學(xué)參考值。

2.3 定量校正模型建立

2.3.1 異常樣品剔除

異常樣品指光譜數(shù)據(jù)存在較大誤差的樣品，這些樣品會對所建模型的準(zhǔn)確性及穩(wěn)健性產(chǎn)生不利影響。本試驗利用Dixon檢驗剔除異常光譜[16]，結(jié)果共剔除8個光譜異常的樣品。

2.3.2 樣本集劃分

將經(jīng)過Dixon檢驗的112批樣品按含量數(shù)值從小到大排列后，選取2/3作為校正集（75批），剩余1/3作為驗證集（37批），并且確保驗證集樣品含量在校正集樣品的含量范圍之內(nèi)[17]。樣本集劃分與含量分布結(jié)果見表2。

表2 5種成分樣本集劃分與含量分布結(jié)果（mg/g，n=3）

2.3.3 光譜預(yù)處理方法選擇

NIR易受噪聲、基線漂移、樣品顆粒不均勻、光散射等多種因素干擾，引起隨機誤差，降低信噪比，使模型的準(zhǔn)確性與穩(wěn)健性降低，因此對光譜進(jìn)行預(yù)處理非常重要。本試驗考察未處理光譜（None）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量校正（SNV）、多元散射校正（MSC）、一階導(dǎo)數(shù)（FD）、二階導(dǎo)數(shù)（SD）、11點移動窗口最小二乘多項式平滑（Savitzky-Golay smoothing，SG）和Norris導(dǎo)數(shù)濾波平滑等常見光譜預(yù)處理方法及組合方法。以決定系數(shù)（R2）、校正均方差（RMSEC）、預(yù)測均方差（RMSEP）和留一法交叉驗證均方差（RMSECV）為指標(biāo)，篩選不同建模方法。R2越接近1，RMSEC、RMSEP和RMSECV越接近0，模型的穩(wěn)健性及預(yù)測效果越好。結(jié)果表明，對麥冬皂苷B、麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B分別采用SNV+SD+SG、MSC+FD+SG、MSC+SD+SG、MSC+FD+Norris、MSC+FD+ SG進(jìn)行光譜預(yù)處理所得模型預(yù)測效果最佳，見表3。

表3 5種成分最佳光譜預(yù)處理方法

2.3.4 光譜波段選擇

采用篩選出的最佳光譜預(yù)處理方法處理光譜后，用TQ Analyst 8.0軟件的自動優(yōu)化功能，對不同光譜波段的建模效果進(jìn)行考察，選取留一交叉驗證R2最接近1的波段為最佳建模波段?？傻名湺碥誃的最佳建模波段為8 105.4～7 316.6 cm-1及9 713.4～8 945.5 cm-1，麥冬皂苷D的最佳建模波段為9 554.6～7 098.4 cm-1，麥冬皂苷D′的最佳建模波段為8 253.1～6 765.2 cm-1、9 425.4～9 005.8 cm-1及9 637.1～9 458.9 cm-1，甲基麥冬二氫高異黃酮A的最佳建模波段為9 252.6～4 125.1 cm-1，甲基麥冬二氫高異黃酮B的最佳建模波段為9 134.2～4 254.2 cm-1。

2.3.5 因子數(shù)選擇

采用內(nèi)部交叉驗證法考察因子數(shù)對RMSECV及交叉驗證R2（%）的影響。當(dāng)模型RMSECV較小且R2最接近1時，對應(yīng)的因子數(shù)用于建模效果最佳。結(jié)果表明，麥冬皂苷B、麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B的因子數(shù)分別選擇10、9、10、6、5時建模效果最佳。

2.3.6 定量模型建立與評價

通過上述模型優(yōu)化過程，得到麥冬中5種成分的PLS模型建立方法，見表4。校正模型的相關(guān)性見圖3。其中，麥冬皂苷B定量校正模型R2=0.970 2，RMSEC=0.520 7，RMSEP=0.554 1，采用交叉驗證法判斷模型穩(wěn)健性，交叉驗證R2=0.943 0，RMSECV=0.646 5；麥冬皂苷D定量校正模型R2=0.949 8，RMSEC=0.662 7，RMSEP=0.315 7，交叉驗證R2=0.920 6，RMSECV=0.358 3；麥冬皂苷D′定量校正模型R2=0.980 4，RMSEC=0.085 3，RMSEP=0.415 5，交叉驗證R2=0.951 6，RMSECV=0.693 3；甲基麥冬二氫高異黃酮A定量校正模型R2=0.959 3，RMSEC=0.812 2，RMSEP=0.567 4，交叉驗證R2=0.939 5，RMSECV=0.744 4；甲基麥冬二氫高異黃酮B定量校正模型R2=0.940 8，RMSEC=0.645 1，RMSEP=0.747 6，交叉驗證R2=0.928 3，RMSECV=0.884 9。由圖3可知，校正集與驗證集樣品均勻分布在回歸線兩側(cè)，表明模型預(yù)測值與實測值（化學(xué)參考值）之間具有較好的相關(guān)性，模型預(yù)測性能較為理想。

圖3 5種成分參考值與模型預(yù)測值的相關(guān)性

表4 5種成分PLS模型建立方法

2.3.7 外部驗證

選擇15批樣品掃描NIR，輸入模型進(jìn)行外部驗證，檢驗?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，結(jié)果見表5～表9?？梢?，模型預(yù)測值的分布范圍與實測值基本相符，相對誤差均較小，預(yù)測結(jié)果較為準(zhǔn)確。對各成分的模型預(yù)測值與實測值進(jìn)行配對t檢驗，結(jié)果P值均大于0.05（α=0.05），預(yù)測值與實測值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明2種檢測方法之間的系統(tǒng)誤差較小，可忽略不計。因此，利用NIR技術(shù)快速測定麥冬5種成分的含量是可行的。

表5 麥冬皂苷B的PLS模型外部驗證結(jié)果

表6 麥冬皂苷D的PLS模型外部驗證結(jié)果

表9 甲基麥冬二氫高異黃酮B的PLS模型外部驗證結(jié)果

表7 麥冬皂苷D′的PLS模型外部驗證結(jié)果

表8 甲基麥冬二氫高異黃酮A的PLS模型外部驗證結(jié)果

3 討論

本研究對象是百合科植物麥冬Ophiopogon japonicus（L. f）Ker-Gawl.，不包含山麥冬[即百合科植物湖北麥冬Liriope spicata（Thunb.）Lour. var.proliferaY. T. Ma和Liriope muscari（Decne.）Baily]，2020年版《中華人民共和國藥典》將麥冬與山麥冬嚴(yán)格區(qū)分為2種不同的中藥。已有研究發(fā)現(xiàn)，山麥冬與麥冬的化學(xué)成分組成存在差異[18]。

傳統(tǒng)的麥冬采收期多根據(jù)經(jīng)驗確定，如川麥冬在種植次年清明之后采收，而浙麥冬在種植后的第3年立夏后采收，兩者種植區(qū)域的東西跨度較大，采收期時間跨度也較大，因此其生產(chǎn)、加工、流通、使用等各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制較難掌握。2020年版《中華人民共和國藥典》收載了麥冬水分、總灰分、水溶性浸出物和麥冬總皂苷的限量要求，規(guī)定含麥冬總皂苷以魯斯可皂苷元計不得少于0.12%[12]，但未對麥冬其他單體有效成分或有效部位進(jìn)行要求。因此，目前尚缺少完善的含量標(biāo)準(zhǔn)評價麥冬質(zhì)量及不同品種的差異。

川麥冬與浙麥冬化學(xué)成分種類及主要藥理作用未見明顯不同，但其成分含量存在明顯差異，主要表現(xiàn)為浙麥冬中麥冬皂苷B、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、總黃酮及總多糖的含量更高，因此浙麥冬質(zhì)量更優(yōu)[19]。麥冬總皂苷、總黃酮是麥冬的主要有效部位，是其抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)[4，20]。本研究建立的近紅外光譜模型可以準(zhǔn)確測試2個產(chǎn)地麥冬中的3種主要皂苷及2種主要黃酮的含量，模型預(yù)測結(jié)果與實測結(jié)果無明顯差異，可為麥冬的質(zhì)量控制提供快速、簡便的分析方法及評價依據(jù)。