油菜miR399生物信息學(xué)分析及靶基因功能預(yù)測

李欣燃， 方娜娜， 朱 淼， 翁貴英， 王緒英

（六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州六盤水 553004）

MicroRNA（miRNA）是一類長度為20～24 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA（崔玉等，2022），其前體一般含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，對植物生長發(fā)育、新陳代謝、有機物合成、抗逆作用及細胞凋亡過程均起到非常重要的作用（葉靖等，2022；陳志輝等，2018）。miR399作為miRNA的重要家族成員，已在多個物種中被鑒定。該基因在磷轉(zhuǎn)運作用機制中的研究已相對透徹，其靶基因POH2（Phosphatase2）與miR399結(jié)合，導(dǎo)致POH2表達受到抑制，從而增強磷轉(zhuǎn)運蛋白的表達，促進植物中磷的積累，達到調(diào)節(jié)植物對磷吸收的目的（劉浩等，2019）。研究表明，miR399廣泛分布在被子植物中，且長度較穩(wěn)定，成員間進化具有一定的保守性，但不同物種間miR399在數(shù)量分布和功能進化等方面存在一定的差異（劉潮等，2019），其對靶基因的具體調(diào)節(jié)機制值得深入研究。

油菜（BrassicanapusL.）作為我國主要的油料作物，近年來年均種植面積已達667 hm2，以其生產(chǎn)的菜籽油占我國油料作物產(chǎn)油總量的55%以上（趙改會等，2022）。不僅如此，油菜也可作為人們餐桌上的食用蔬菜及畜牧業(yè)飼料蛋白來源（文雁成等，2022；鄔瑜錦等，2022）。因此，提升油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的經(jīng)濟價值和戰(zhàn)略意義。挖掘利用油菜自身的調(diào)節(jié)機制，選育優(yōu)良性狀已成為研究熱點，油菜miR399（Bna-miR399）家族成員眾多，且在油菜生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本研究通過生物信息學(xué)的方法對Bna-miR399進行分析預(yù)測，以期更好地為油菜分子育種及性狀改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 利用PmiREN數(shù)據(jù)庫搜索BnamiR399家族成熟以及前體序列，并將獲得的全部成員下載備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 成熟序列堿基保守性分析 利用Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW對BnamiR399的成熟序列進行比對，并將比對結(jié)果用WebLogo繪制序列保守性Logo圖，以便于進一步分析每個位點上堿基出現(xiàn)頻率和保守度。

1.2.2 前體序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析 利用RNAfold web server預(yù)測BnamiR399全部成員前體二級結(jié)構(gòu)，通過MEGA X計算Bna-miR399前體序列建樹最優(yōu)模型，并通過最大似然法（ML）構(gòu)建Bna-miR399成員的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.3 靶基因預(yù)測 利用WMD3和psRNATarget分別獲得Bna-miR399全部成員的靶基因預(yù)測信息，利用NCBI在線比對獲取基因注釋功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bna-miR399家族成熟序列分析 共獲得22個Bna-miR399家族成員，對其成熟序列保守性進行分析（圖1），并將該結(jié)果繪制了序列保守性的直觀Logo對比圖（圖2）?？梢钥闯鯞namiR399的22條成熟序列中，除Bna-miR399 g和h含有20 nt，其余20個成熟序列均含有21 nt，序列間有17 nt重復(fù)位點，保守性較高，其中BnamiR399 c和e，Bna-miR399 d和f，Bna-miR399 a、b、k、o、p、q、m和l，Bna-miR399 i，Bna-miR399 g和h，Bna-miR399 j、n、r、s、t、u和v序列堿基分別完全相同。這22個成熟序列間位點輕微差異的產(chǎn)生可能是由于其處于油菜不同發(fā)育階段或組織導(dǎo)致的。

圖1 Bna-miR399家族成熟序列比對

圖2 Bna-miR399家族成熟序列保守性分析

2.2 Bna-miR399前體序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過對Bna-miR399家族22個前體序列二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測（圖3），結(jié)果顯示，Bna-miR399家族成員均可形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且各前體的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)差異較大，莖環(huán)大小高度可變，表明其前體保守性較低。

圖3 Bna-miR399前體二級結(jié)構(gòu)

2.3 Bna-miR399前體序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析利用MEGA X對Bna-miR399家族成員前體序列對比分析，并構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖4），結(jié)果表明22個家族成員分為6個分支：Bna-miR a、b、d、f、l、o和q為第Ⅰ分支，Bna-miR c、e、k、m和p為第Ⅱ分支，Bna-miR i為第Ⅲ分支，Bna-miR g和h為第Ⅳ分支，Bna-miR n和r為第Ⅴ分支，Bna-miR j、s、t、u和v為第Ⅵ分支。從進化樹角度看，成員Bna-miR i應(yīng)該產(chǎn)生較早，其前體序列和成熟序列也與其他成員差異最大，可以推出BnamiR i在油菜進化過程中發(fā)生了較多的堿基替換或突變的現(xiàn)象（劉雪梅等，2021）。

圖4 Bna-miR399前體序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.4 Bna-miR399家族靶基因預(yù)測 利用WMD3、psRNATarget、NCBI分 別 預(yù) 測 BnamiR399家族22個成員靶基因及其功能（表1）。結(jié)果顯示，22個成員有多個共同的靶基因，如所有成員均可預(yù)測到TC186251，表明Bna-miR399成員間功能具有較高的保守性。通過對基因功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)這些靶基因在油菜多種生命活動中發(fā)揮重要作用，表明該基因家族功能具有廣泛性的特點。

表1 Bna-miR399家族靶基因預(yù)測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

植物基因調(diào)控與生長發(fā)育及脅迫應(yīng)答調(diào)控網(wǎng)絡(luò)間存在著密切聯(lián)系。油菜作為我國主要的油料和動物蛋白飼料來源，其與miR399之間的關(guān)聯(lián)與互作機制目前仍鮮見報道，但隨著生物信息技術(shù)的高速發(fā)展，使得探究油菜中miR399成員功能成為可能。

研究發(fā)現(xiàn)miR399僅分布于被子植物中，特別是雙子葉植物居多（劉潮等，2019）。該家族成員在植物中比較保守，目前已經(jīng)陸續(xù)在擬南芥、水稻、菜豆及苜蓿等多種植物中被發(fā)現(xiàn)，該基因家族成員受低磷誘導(dǎo)作用影響，可通過調(diào)節(jié)靶基因PHO2轉(zhuǎn)錄水平，促進植物對磷的吸收，進而緩解低磷脅迫對植物生長發(fā)育過程中的不良影響（陶平，2016）。通過檢索發(fā)現(xiàn)Bna-miR399共有22個成員，其成熟序列間具有較高的保守性，前體序列高度可變，其中Bna-miR i序列與其他成員差異最大，應(yīng)相對產(chǎn)生較早，可推斷Bna-miR i在油菜進化過程中發(fā)生了較多的堿基替換或突變的現(xiàn)象，可見Bna-miR399成員間既高度保守，又存在一定的變化。通過對Bna-miR399成員靶基因及其功能分析發(fā)現(xiàn)，Bna-miR399所有成員均可預(yù)測到“可能的泛素結(jié)合酶E2 24”功能，說明Bna-miR399在DNA修復(fù)、光周期和維管分化調(diào)控及抗逆脅迫響應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用（王金利等，2010）；部分家族成員靶基因含有“線粒體磷酸鹽載體蛋白3”作用，可以將無機磷轉(zhuǎn)運至線粒體基質(zhì)上，促進無機磷轉(zhuǎn)運，便于ADP轉(zhuǎn)化成ATP（衣冠帥，2016）；“無機磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1-7”有利于植物將土壤中磷元素吸收、分配和再利用（付禹，2021）；“堿性/中性轉(zhuǎn)化酶A/C”與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，在植物的生長周期、生物/非生物應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用（劉爽，2020）；“s-腺苷甲硫氨酸載體1”是植物體內(nèi)甲基供體的關(guān)鍵酶，可提升植物對逆境響應(yīng)的耐受作用（才曉溪等，2022）；“液泡加工酶α同工酶”可能與油菜的蛋白儲存和細胞凋亡密切相關(guān)（蘇雨等，2021）；“U-box結(jié)構(gòu)域的蛋白35”可能通過控

制油菜異常蛋白質(zhì)降解的方式參與其發(fā)育及病變的相關(guān)過程 （靳苗靜等，2007）。此外，BnamiR399家族基因還具有參與甘遂醇合成、氨基酸蛋白激酶等多種功能，進而調(diào)控RNA合成及轉(zhuǎn)錄、代謝等過程（劉潮等，2019）。綜上，miR399家族在油菜磷轉(zhuǎn)運及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用，間接調(diào)節(jié)植物體的生長發(fā)育、有機物合成、磷的吸收以及脅迫響應(yīng)等各個過程，對油菜多種代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控起著不可替代的作用。

通過對Bna-miR399基因家族生物信息學(xué)分析，可為油菜優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)，分析BnamiR399家族成員及靶基因作用特點對于解析該基因家族作用機制及其起源和進化具有重要意義，同時為探明Bna-miR399基因調(diào)節(jié)機制提供理論依據(jù)。