濾袋式纖維分析儀檢測飼料中粗纖維

陳建勇， 黃麗俊， 金曉威， 金惠萍， 宓曉黎， 于瑞莉， 韓瑩瑩

（1.上海纖維儀器有限公司，上海 201818；2.無錫市食品安全檢驗檢測中心，江蘇無錫 214412；3.江蘇省菩德食品安全檢測技術有限公司，江蘇無錫 214063）

粗纖維（CF）是植物細胞壁的主要組成成分，包括纖維素、半纖維素、木質素等（GB/T 10647-2008，2008），GB 10648-2013《飼料標簽》標準規(guī)定了飼料和飼料原料產(chǎn)品成分分析保證值項目，要求配合飼料、濃縮飼料、精料補充料和飼料原料標示粗纖維，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《飼料原料目錄》中有150余種原料被強制性標識粗纖維或中性洗滌纖維項目。從現(xiàn)代動物營養(yǎng)學的觀點來看，飼養(yǎng)動物每天需要攝入一定量的纖維素，一則作為反芻動物的一種必需營養(yǎng)素，以維持瘤胃正常發(fā)酵和胃腸道健康；二則可作為填充物，使家畜禽有飽腹感，同時可刺激腸道黏膜，促進腸胃的蠕動，有利于糞便的排泄；三則可維持動物正常的生產(chǎn)性能及為動物提供大量能量等，但飼糧中過多的粗纖維成分會對動物產(chǎn)生不良影響，如降低采食量及營養(yǎng)物質消化率等（馬紹楠等，2018；歐陽富龍等，2016）。因此，檢測飼料及原料中粗纖維含量對于評價飼料質量、營養(yǎng)價值及指導優(yōu)化飼料產(chǎn)品配方設計均具有重要意義。

目前，與粗纖維相關的檢測方法多數(shù)為經(jīng)典的Weend法，涉及飼料、糧食、植物類食品、農(nóng)副產(chǎn)品和茶葉等標準，GB/T 6434-2006和GB/T 5515-2008均等同采用ISO 6865:2000，GB/T 8310-2013修改采用ISO 15598:1999及ISO 5498-1981等，這些方法的共同特點是在特定的實驗條件下，試樣在酸堿消煮、有機溶劑脫脂等過程中，其盛試樣容器與濾器之間多次切換，使之分析時間長，操作繁瑣，試樣易流失。因此，試樣的轉移和過濾成了方法的難點或關注點。首先是改進濾材與濾器，由布氏漏斗、古氏濾堝、垂熔玻璃濾器 到 尼 龍 布 （吳 秋 玨 等，2005；AOAC Official Method 962.09，1982；AOAC Official Method 978.10，1979）、聚酯纖維袋（張晨等，2019；Aocs Standard Procedure Ba 6a-05，2009），尤其是濾袋技術的引入，使過濾更為便捷、順暢。另外通過增加玻璃濾器的高度，實現(xiàn)了不用試樣轉移的在線過濾，由此開發(fā)了依Weend法操作過程設計的第一代粗纖維檢測儀，其半自動操作方法在相關國家標準中已得到認可。盡管簡化了操作步驟，但仍然存在操作步驟繁多、過濾難、分析時間長等問題（蔡小玲，2016；何綺霞，2013）。目前，利用濾袋過濾技術的優(yōu)勢，濾袋代替濾堝，降低了傳統(tǒng)實驗過程中抽濾時試樣易板結、堵塞濾堝的風險，研發(fā)的纖維分析儀倍受關注，并得到了應用（張晨等，2019；AOCS Standard Procedure Ba 6a-05，2009）。

本研究利用濾袋式纖維分析儀，檢驗檢測飼料及原料中粗纖維，旨在建立更為快捷、準確，滿足國家標準技術要求的檢測方法，為濾袋式粗纖維分析儀器化和標準化提供實驗與應用基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 SLQ-6A濾堝式纖維分析儀（上海纖檢儀器有限公司）；XF2800濾袋式纖維分析儀，附聚酯纖維濾袋50 mm×55 mm，25μm（上海纖檢儀器有限公司）；SX-4-10箱式電阻爐（上海陽光實驗儀器有限公司）；DHG-9245A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；AB104-S/A分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

飼料中粗蛋白質、粗脂肪、粗纖維、粗灰分標準物質BW21134（北京譜析標準技術有限公司）；硫酸、氫氧化鉀、丙酮、乙醚等（分析純，國藥集團）；飼料原料和飼料產(chǎn)品（東方希望動物營養(yǎng)食品有限公司、蚌埠大北農(nóng)農(nóng)牧科技有公司、榆林上河湖羊養(yǎng)殖基地等）。

1.2 檢驗依據(jù)及原理 粗纖維測定方法依據(jù)GB/T 6434-2006《飼料中粗纖維的含量測定 過濾法》。試樣用固定量的酸和堿，在特定條件下消煮，再用醚、丙酮除去醚溶物，經(jīng)高溫灼燒扣除礦物質的量，所余量稱為粗纖維。

1.3 試樣制備 風干試樣粉碎，使其完全通過篩孔為1 mm的篩（16目）。必要時進行脫脂和除碳酸鹽，置干燥器中待測。

1.4 過濾法 用濾堝式纖維分析儀，依GB/T 6434-2006標準步驟分析檢測，按半自動操作方法的分析步驟，以下簡稱過濾法，即國標法。

1.5 濾袋法

1.5.1 操作步驟 稱取約1 g試樣（m），準確到0.1 mg，置濾袋（m1）中，并用封口機封口。將含樣品的濾袋以及空白試驗濾袋置濾袋架中，并放入濾袋式纖維分析儀的反應鍋內。一次最多可以在濾袋架上放24個濾袋。在儀器界面設定酸消煮、堿消煮及水洗滌的時間、溫度、頻次等參數(shù)（表1），同時在試劑桶內分別盛0.13 mol/L硫酸、0.23 mol/L氫氧化鉀和蒸餾水備用。進入自動模式，點擊“啟動”按鈕。消煮結束，打開鍋蓋，將濾袋架從儀器反應鍋中取出，輕擠壓去掉多余的水。脫脂，濾袋放入燒杯中，加丙酮或石油醚至覆沒濾袋，浸泡3～5 min，取出濾袋并輕輕擠壓去除多余的溶劑。干燥，濾袋在105℃干燥箱中至少干燥4 h，冷卻后稱量（m2）?；一?，將濾袋置已知質量坩堝（m3）中，放入馬弗爐中，600℃灰化至恒重，冷卻后稱量（m4）。同時做空白實驗。

表1 儀器參數(shù)設定

1.5.2 粗纖維的計算 試樣中CF含量按以下公式進行計算：

式中：XCF為試樣中CF含量，g/100 g；m為樣品質量，g；m1為濾袋質量，g；m2為儀器處理并烘干后濾袋和樣品的總質量，g；m3為坩堝質量，g；m4為灰化后坩堝和灰分的總質量，g；C為空白濾袋校正系數(shù)（空白濾袋處理后的質量/空白濾袋的質量）。

1.6 數(shù)據(jù)處理 本研究所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析均采用Microssoft Excel軟件的數(shù)據(jù)分析工具進行。計量資料采用“平均值±標準差”表示，兩組變量配對t檢驗，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 試樣粉碎粒度對粗纖維含量的影響 分別選擇過1 mm篩、過0.42 mm篩和過0.42 mm上層篩且不過0.15 mm下層篩的顆粒與粉末進行實驗，結果如圖1，試樣的粉碎粒度和分布對粗纖維含量有影響，過1 mm篩試樣的粗纖維含量會略大于過0.42 mm篩；當將粒度控制在0.42～0.15 mm篩間時，與只過0.42 mm篩比較，粗纖維含量明顯升高，因為過0.42～0.15 mm篩的試樣中除去了過細的試樣，粒度均勻分布在一定的區(qū)間。

圖1 試樣粒度對粗纖維含量的影響

飼料經(jīng)過酸、堿處理后剩下的大部分是纖維素、木質素和少量的半纖維素，所以樣品粒度對于測定值有很大影響。試樣粒度大，在規(guī)定的時間內可能存在消解不完全，非纖維物質不易被破壞，不易被充分洗去，造成粗纖維測定結果偏高；反之，粒度小，在過濾時會損失粗纖維，結果會偏低；控制粒度區(qū)間結果提示，粉碎時應關注粉碎機的轉速與粉碎時間，不然粒度分布對結果也有影響。有研究表明，不同粉碎方式導致樣品的粒度大小及體積累積分布差異明顯，但總體差異在可接受范圍內（張森等，2015），過濾法也有同樣的粒度問題（郭萍，2004；王仁華等，2000），另外，小粒試樣黏附于抽濾器壁上會致結果反而升高，因此濾袋法結果可能更接近標準理論值。鑒于測粗纖維含量是概略方法，應嚴格執(zhí)行公認方法的操作條件或步驟，所以試樣粒度應與過濾法一致為適，制樣時應選擇1 mm的篩。

2.2 濾袋因素對粗纖維含量的影響 在檢測粗纖維時，每次要做空白濾袋實驗，采集了19次空白濾袋的校正系數(shù)，均值為0.9846±0.0036，RSD為0.37%，大部分在0.98左右，個別在0.97左右。假設空白濾袋的校正系數(shù)為0.9846或1時，粗纖維含量計算結果見表2，相對平均偏差顯示，高含量時，不同校正系數(shù)引入的誤差較小，反之則較大。因此對同一批濾袋，經(jīng)多次檢驗后可確認空白濾袋的校正系數(shù)為一個常數(shù)，但不宜忽略。

表2 空白濾袋校正系數(shù)對粗纖維含量的影響

對濾袋法，在分析結果計算中是否引入空白濾袋的校正系數(shù)，有引入的（AOCS Standard Procedure Ba 6a-05，2009），也有不引入的（DB12/T 963-2020，2020）。引入空白濾袋的校正系數(shù)概念其目的主要是扣除濾袋灰化或干燥質量變化對結果的影響，同時也可作為選擇濾材的依據(jù)，當校正因子C小于1時，校正因子有效，可參與計算，C大于1表示試樣粒子從濾袋中流出浸入空白濾袋中，可能是濾袋孔徑過大或封口不嚴，任何纖維粒子從濾袋中流失可導致錯誤結果?？赏ㄟ^提高濾袋的目數(shù)或減小濾袋的孔徑，從而保證實驗數(shù)據(jù)的準確性。

2.3 精密度實驗 選擇各類飼料及原料，涉及畜禽類、水產(chǎn)類、實驗動物等配合飼料，高纖維和低纖維的飼料原料，分別用濾袋法和過濾法檢測，檢測結果見表3，結果提示，濾袋法的相對標準差在0.65%～6.46%；過濾法的相對標準差在0.09%～3.92%。GB/T 6434-2006標準資料性附錄中所列7種試樣的重復性變異系數(shù)（RSD）在1.3%～4.2%，本實驗濾袋法除1例可能因為含量略低，RSD偏離外，結果重復性滿足國標要求；過濾法采用的是半自動儀器操作方法避免了轉移步驟，也減小了分析誤差。

表3 重復性實驗結果

2.4 準確度實驗 采用已知粗纖維特性值為4.08 g/100 g的飼料質控樣，其特性值區(qū)間為3.36～4.80 g/100 g，用濾袋法和過濾法進行檢測，檢測結果見表4，濾袋法和過濾法的回收率分別為93.14%和84.31%，相對標準差為3.66%和1.82%，檢測結果均落在特性值區(qū)間內。濾袋法的回收率高于過濾法。

表4 回收實驗結果

2.5 濾袋法與過濾法比較 濾袋法在飼料粗纖維檢測中應用的標準方法尚未頒布，所以在本實驗研究中均以過濾法為佐證，表3中兩組數(shù)值采用t檢驗，檢驗水準選擇0.05，即P＜0.05時，差異存在顯著性，結果見表5，t（-0.0720），P（T＜=t）=0.9436，濾袋法與過濾法檢測結果差異不顯著；兩組數(shù)值相關系數(shù)為0.9976，濾袋法與過濾法檢測結果關聯(lián)性好。因此，濾袋法適用于相關飼料及原料中粗纖維的檢測。

表5 t-檢驗成對雙樣本均值分析

3 結論與討論

濾袋技術（FBT）是一種簡便易行、高效準確的分析技術。該項技術目前應用于飼料中粗纖維（CF）、中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）的測定（張麗英等，2001）。本實驗研究提示，濾袋式纖維分析儀檢測粗纖維具有以下特點：（1）分析操作更為簡便、快捷。采用濾袋技術，試樣在濾袋中完成酸堿消煮、洗滌和過濾等步驟，最為關鍵是解決了坩堝過濾試樣易堵塞的痛點，其固體截留在袋內，酸、堿消煮液自由出入，省去了抽濾，簡單壓濾即可。適用于批量檢測，24只濾袋可以同時放入消煮鍋中，同時檢測22份樣品，2份濾袋空白，坩堝式儀器法同時可做4份樣品，2份空白。（2）精密度和準確度高。當采用濾袋技術時，消除了分析人員因操作繁冗、樣品過濾轉移損失等引起的偶然誤差，分析人員稱樣封口后，只需認真按照操作規(guī)程進行，就可一次獲得準確和重復性好分析結果。且其分析結果與標準方法（過濾法）結果相吻合。（3）分析成本低。節(jié)省勞動力，提高了工作效率，樣品處理過程可以無操作人員值守，批量檢測更顯優(yōu)勢，分析每個樣品的勞動力成本可減少50%以上。節(jié)省試劑成本，盡管酸和堿試劑用量增加，一般一個消煮鍋內加試劑2～3 L，但平均到每一樣品中，消耗體積為90～140 mL，則與標準法所耗試劑用量150 mL相當，且無需消泡劑和酸洗硅藻土。

通過實驗，濾袋法與過濾法間的一致性得到充分驗證，并且國際上已有濾袋技術及相關儀器應用于粗纖維的檢測。因此，濾袋式纖維測定法可作為國標法檢測飼料中粗纖維含量，其他適用范圍有待進一步實驗證明。