植物甾醇對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)性能、肝胰臟抗氧化功能和攻毒試驗(yàn)的影響

李小平

（蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州 215008）

黃顙魚(yú)（Pelteobagrusfulvidraco）又名黃辣丁，俗稱(chēng)黃姑魚(yú)，是鲿科（Bagridae）、黃顙魚(yú)屬（Pelteobagrus）一種常見(jiàn)的淡水魚(yú)。在自然條件下，黃顙魚(yú)主要棲息于緩流淺水區(qū)域，營(yíng)底棲生活，且腐殖質(zhì)多和游泥多的地方，雜食性，以動(dòng)物性飼料為主，也可吞食植物碎屑（韓慶等，2004）。黃顙魚(yú)具有含肉率高、味道鮮美、脂肪含量中等、肌肉彈性好等優(yōu)點(diǎn)，因而廣受普羅大眾喜愛(ài)，市場(chǎng)需求較為廣闊，是我國(guó)小型淡水名特優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之 一（張志浩等，2019；Zhou等，2015；馬旭洲等，2005）。按照有關(guān)數(shù)據(jù)，全國(guó)黃顙魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量在2019年就已經(jīng)超過(guò)50萬(wàn)t。

隨著黃顙魚(yú)人工養(yǎng)殖技術(shù)提升，池塘集約化程度提高，黃顙魚(yú)的畝產(chǎn)量得到大幅提高。高密度養(yǎng)殖伴隨而來(lái)的營(yíng)養(yǎng)代謝異常和養(yǎng)殖環(huán)境問(wèn)題，會(huì)導(dǎo)致黃顙魚(yú)生長(zhǎng)速度下降、疾病頻發(fā)，養(yǎng)戶經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，制約了黃顙魚(yú)養(yǎng)殖的健康持續(xù)發(fā)展（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局，2019；王明華等，2014）。因此，通過(guò)在飼料中添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增強(qiáng)黃顙魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)代謝能力、抗應(yīng)激能力和疾病抵抗力，是解決黃顙魚(yú)實(shí)現(xiàn)健康可持續(xù)養(yǎng)殖的一個(gè)重要手段。植物甾醇普遍為白色片狀或粉狀物質(zhì)，無(wú)臭無(wú)味，具有旋光性，熔點(diǎn)基本都在100℃。在自然環(huán)境中，植物甾醇有游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種存在形式，游離態(tài)為自由醇結(jié)構(gòu)，結(jié)合態(tài)多以有機(jī)酸酯和甾基糖苷等結(jié)構(gòu)為主，最常見(jiàn)的甾醇有β-谷甾醇、豆甾醇，植物甾醇在植物種子中的含量較高。植物甾醇和動(dòng)物性甾醇的基本分子結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差別，不同之處在于植物甾醇C-3位上有羥基，并且C-5位為雙鍵結(jié)構(gòu)，正是這些細(xì)微差別使得植物甾醇具有獨(dú)特的生理作用（Ni等，2012）。

植物甾醇在食品衛(wèi)生領(lǐng)域已經(jīng)進(jìn)行了較為深入的研究，表明其具有抗炎、退熱、抗癌、阻礙膽固醇吸收等眾多生理功能（黃志毅等，2020；任建敏等，2015；Izadi等，2015）。從2008年開(kāi)始，植物甾醇就已經(jīng)作為新型飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中普遍使用，對(duì)植物甾醇的生理功能做了大量研究（黃志毅等，2018；程業(yè)飛等，2017；吳萍等，2012；李偉等，2010；顧莞婷等，2008），完善了植物甾醇在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用體系，但植物甾醇在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物上的研究應(yīng)用相對(duì)較少。因此本試驗(yàn)以黃顙魚(yú)幼魚(yú)為試驗(yàn)對(duì)象，探究不同水平的植物甾醇對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)、體成分、肝胰臟抗氧化功能和急性攻毒試驗(yàn)的影響，以便為植物甾醇在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供一定的理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料 以魚(yú)粉、豆粕等為蛋白源，魚(yú)油和豆油為脂肪源，利用面粉和纖維素平衡飼料能量來(lái)配制基礎(chǔ)飼料，基礎(chǔ)飼料的具體組成成分和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。在基礎(chǔ)飼料中添加0、20、40、60、80 mg/kg的植物甾醇，設(shè)計(jì)出5種不同植物甾醇含量的試驗(yàn)飼料。植物甾醇購(gòu)自sigma公司。所有飼料原料經(jīng)粉碎后過(guò)40目篩，按照配方比例準(zhǔn)確稱(chēng)重并逐級(jí)混勻，最后制成粒徑為2 mm的顆粒飼料，烘干后自然冷卻，使用自封袋包裝，放在冰箱中備用。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）%

1.2 試驗(yàn)魚(yú)與飼養(yǎng)管理 黃顙魚(yú)魚(yú)苗購(gòu)自江蘇省蘇州市。魚(yú)苗先在暫養(yǎng)魚(yú)池馴養(yǎng)兩周，在馴養(yǎng)期間投喂商品飼料。養(yǎng)殖試驗(yàn)是在循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。馴養(yǎng)結(jié)束后，選取初始體重為（1.64±0.01）g健康游動(dòng)的黃顙魚(yú)幼魚(yú)600尾平均放養(yǎng)到15個(gè)水族桶中。這15個(gè)養(yǎng)殖桶共分為5個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組有3個(gè)養(yǎng)殖桶作為重復(fù)，每組投喂對(duì)應(yīng)飼料，按植物甾醇添加量從低到高標(biāo)記為PS0、PS20、PS40、PS60和PS80。每天8:00和17:00各投喂一次，采取飽食投喂方式，投喂量為魚(yú)重的4%、6%，根據(jù)黃顙魚(yú)攝食情況進(jìn)行調(diào)整；養(yǎng)殖期間全程曝氣，水溫為25～29℃，pH維持在7.20～7.80，定期換水。若有死亡的魚(yú)及時(shí)取出并稱(chēng)重記錄。試驗(yàn)期為60 d。

1.3 攻毒試驗(yàn) 菌種為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophylia），是實(shí)驗(yàn)室自制所得，是從患病的黃顙魚(yú)魚(yú)體上獲得，然后經(jīng)過(guò)挑選、分離和純化，最后通過(guò)基因測(cè)序確定。在攻毒試驗(yàn)前開(kāi)展預(yù)試驗(yàn)，確定該嗜水氣單胞菌在黃顙魚(yú)上的半數(shù)致死濃度。在菌種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期取菌液50 mL，然后3500 r/min離心5 min沉淀菌體。沉淀的菌體用滅菌水梯度稀釋?zhuān)苽?00 nm下吸光度為0.12的菌體懸液（約1×106CFU/mL），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品采集 飼喂60 d后，讓試驗(yàn)魚(yú)空腹24 h。然后撈取每個(gè)養(yǎng)殖桶中的黃顙魚(yú)，統(tǒng)計(jì)數(shù)量并稱(chēng)重。每個(gè)養(yǎng)殖桶隨機(jī)抽取15尾魚(yú)，測(cè)量體重和體長(zhǎng)用于計(jì)算形體指標(biāo)，再將其中5尾魚(yú)用于測(cè)定全魚(yú)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)分析，剩下10尾魚(yú)用干凈紗布抹干之后解剖，挑取內(nèi)臟團(tuán)和肝臟并稱(chēng)重。所有樣品置于-80℃冰箱中以備分析。最后從每個(gè)養(yǎng)殖桶挑選15尾魚(yú)用于攻毒試驗(yàn)。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo) 生長(zhǎng)性能指標(biāo)計(jì)算公式如下：

增重率/%=（Wt-W0）/W0×100；

特定生長(zhǎng)率/（%/d）=[ln（Wt/W0）]/t×100；

飼料系數(shù)=F/（Wt-W0）；

蛋白質(zhì)效率/%=[（Wt-W0）×D/（F×d）]×100；

肥滿度/（g/cm3）=（Wt/L3）×100；

肝體比/%=（Wg/Wt）×100；

臟體比/%=（Wn/Wt）×100。

式中：Wt為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)黃顙魚(yú)平均體重，g；W0為試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)黃顙魚(yú)平均體重，g；t為養(yǎng)殖試驗(yàn)天數(shù)，d；F為總投喂量，g；Wt為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)黃顙魚(yú)總體重，g；W0為試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)黃顙魚(yú)總重，g；D為黃顙魚(yú)魚(yú)體粗蛋白質(zhì)含量，%；d為飼料中粗蛋白質(zhì)含量，%；L為黃顙魚(yú)體長(zhǎng)，cm；Wn為內(nèi)臟團(tuán)重量，g；Wg為肝臟重量，g。

1.5.2 體成分的測(cè)定 全魚(yú)體成分測(cè)定分析方法：水分測(cè)定參照GB/T 6435-2014，粗蛋白質(zhì)和粗脂肪測(cè)定參照GB/T 18868-2002，粗灰分測(cè)定參照GB/T 6438-2007。

1.6.3 肝胰臟抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、總抗氧化能力和丙二醛等生化指標(biāo)，使用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測(cè)定。具體檢測(cè)方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.5.4 攻毒試驗(yàn) 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后每個(gè)重復(fù)挑取15尾魚(yú)，按每10 g體重注射菌液0.1 mL的比例進(jìn)行攻毒，不投餌，但氧氣供給和水循環(huán)如常，試驗(yàn)持續(xù)48 h。在攻毒期間觀察魚(yú)的活動(dòng)情況，出現(xiàn)死魚(yú)馬上撈出，統(tǒng)計(jì)各組的死魚(yú)數(shù)目，通過(guò)攻毒結(jié)束時(shí)存魚(yú)數(shù)目與攻毒開(kāi)始時(shí)放養(yǎng)數(shù)目計(jì)算24 h和48 h內(nèi)的死亡率（MR）。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 植物甾醇對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)性能、飼料利用和形體指標(biāo)的影響 由表2可以看出，與PS0組相比，各試驗(yàn)組的終末體重、增重率和特定生長(zhǎng)率均有所提高，其中PS40組的終末體重顯著高于PS0組6.3%，增長(zhǎng)率重顯著高于PS0組5.9%（P＜0.05）；PS20和PS40組的特定生長(zhǎng)率分別顯著高于PS0組1.6%、1.8%（P＜0.05）；與PS0組相比，各試驗(yàn)組的飼料系數(shù)下降，蛋白質(zhì)效率提升，其中PS40組飼料系數(shù)顯著低于PS0組4%（P＜0.05），PS20、PS40和PS60組的蛋白質(zhì)效率分別顯著高于PS0組5.6%、10.3%、4.3%（P＜0.05）；肥滿度、肝體比和臟體比在五組試驗(yàn)組之間差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 植物甾醇對(duì)黃顙魚(yú)生長(zhǎng)性能、飼料利用和形體指標(biāo)的影響

2.2 植物甾醇對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)體成分的影響 由表3可知，與PS0組相比，PS40、PS60和PS80組的粗蛋白質(zhì)含量顯著提高，提高幅度分別達(dá)到3.3%、5.9%、5.3%（P＜0.05）；與PS0組相比，PS40和PS60組粗脂肪含量顯著降低10.7%、11.8%（P＜0.05）；干物質(zhì)和粗灰分含量在五組試驗(yàn)組間差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 植物甾醇對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)體成分的影響（干物質(zhì)基礎(chǔ)）%

2.3 植物甾醇對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)肝胰臟抗氧化指標(biāo)的影響 由表4可知，與PS0組相比，各試驗(yàn)組的超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活力和總抗氧化能力均有所提升，其中PS40、PS60和PS80組超氧化物歧化酶活力顯著提高40.2%、21.1%、16.1%（P＜0.05）；PS40、PS60和PS80組總抗氧化能力顯著提高17.6%、10.3%、14.7%（P＜0.05），PS40和PS60組過(guò)氧化氫酶活力顯著提高9.3%、38.3%（P＜0.05）；與PS0組相比，各試驗(yàn)組的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的活力差異不顯著（P＞0.05）；與PS0組相比，各試驗(yàn)組的丙二醛含量顯著下降，分別達(dá)9.3%、14.3%、14.8%、11.5%（P＜0.05）。

表4 植物甾醇對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)肝胰臟抗氧化指標(biāo)的影響

2.4 植物甾醇對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)攻毒后死亡率的影響 由表5可知，與PS0組相比，PS40、PS60和PS80組的24 h死亡率顯著下降22.7%、18.2%、18.2%（P＜0.05）；與PS0組相比，各試驗(yàn)組的48 h死亡率顯著下降11.11%、22.2%、22.2%、18.5%（P＜0.05）。

表5 植物甾醇對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)攻毒后累積死亡率的影響%

3 討論

3.1 植物甾醇對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)性能影響 植物甾醇在豬、牛和雞等養(yǎng)殖動(dòng)物上有改善其生長(zhǎng)性能、提高飼養(yǎng)過(guò)程中飼料利用率的作用（黃志毅等，2018；程業(yè)飛等，2017）。當(dāng)植物甾醇作用于動(dòng)物機(jī)體時(shí)，其是以一種植物甾醇-脂質(zhì)-生長(zhǎng)激素復(fù)合體存在，該復(fù)合體能提高動(dòng)物體內(nèi)的蛋白質(zhì)翻譯效率，這意味著更多的蛋白質(zhì)會(huì)被合成出來(lái)（Li等，2015）。同時(shí)該復(fù)合體比單獨(dú)的生長(zhǎng)激素的穩(wěn)定性要高，因而作用時(shí)效比單獨(dú)的生長(zhǎng)激素長(zhǎng)，從而促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)和發(fā)育（張永輝等，2011）。李志華等（2019）研究表明，20、40 mg/kg植物甾醇的添加量可顯著提高羅非魚(yú)增重率及特定生長(zhǎng)率，且40 mg/kg的添加量效果更佳。潘忠超等（2019）在羅氏沼蝦飼料中添加植物甾醇發(fā)現(xiàn)，植物甾醇可提高羅氏沼蝦的生產(chǎn)性能，降低其料肉比。本試驗(yàn)與前人研究結(jié)果一致，各植物甾醇添加量均能顯著提高黃顙魚(yú)的增重率和蛋白質(zhì)效率，同時(shí)降低飼料系數(shù)。本試驗(yàn)中20、60 mg/kg和80 mg/kg組的效果弱于40 mg/kg組，表明以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，植物甾醇一定范圍內(nèi)并不是越高越好，其最佳添加量需要根據(jù)不同動(dòng)物和不同生長(zhǎng)階段進(jìn)行調(diào)整，具體的機(jī)理需要進(jìn)一步探究。

3.2 植物甾醇對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)體成分和形體指標(biāo)影響 溫超等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，植物甾醇會(huì)使蛋雞中腹脂的相對(duì)質(zhì)量有一定程度降低。張嚴(yán)偉等（2012）在團(tuán)頭魴基礎(chǔ)飼料中添加一定比例的的植物甾醇發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組團(tuán)頭魴肌肉中的肌間脂肪會(huì)比沒(méi)有添加植物甾醇的空白組增加。本試驗(yàn)中植物甾醇對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)的全魚(yú)干物質(zhì)和粗灰分沒(méi)有影響，但能增加全魚(yú)的粗蛋白質(zhì)，降低粗脂肪。植物甾醇對(duì)不同養(yǎng)殖動(dòng)物的體成分影響并不一致，目前關(guān)于植物甾醇調(diào)控動(dòng)物機(jī)體體成分的研究只在具體指標(biāo)上，其影響相關(guān)指標(biāo)的機(jī)制仍需深入研究。

魚(yú)體的肥滿度是用來(lái)衡量魚(yú)類(lèi)體重與體長(zhǎng)關(guān)系的一個(gè)最重要指標(biāo)，可以反映魚(yú)類(lèi)在當(dāng)前養(yǎng)殖階段的營(yíng)養(yǎng)吸收狀況和對(duì)所在生存環(huán)境適應(yīng)的生理狀態(tài)（Chatzifotis等，2010）。肝臟是魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)代謝和免疫功能的主要器官，因此魚(yú)類(lèi)肝臟的重量與其營(yíng)養(yǎng)方式和疾病發(fā)生的相關(guān)系數(shù)很高。當(dāng)魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)異常或者病變時(shí)，肝體比和臟體比這兩個(gè)指標(biāo)往往會(huì)有顯著變化（張麗等，2011）。本試驗(yàn)中各試驗(yàn)組的肥滿度、肝體比和臟體比均沒(méi)有顯著差異，這說(shuō)明飼料中添加植物甾醇對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)吸收和機(jī)體健康沒(méi)有負(fù)面作用。

3.3 植物甾醇對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)肝胰臟抗氧化指標(biāo)的影響 本試驗(yàn)中，投喂各植物甾醇含量的飼料可不同程度地提高黃顙魚(yú)幼魚(yú)肝胰臟的超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶的活力和總抗氧化能力，并降低丙二醛的含量。這表明飼料中添加植物甾醇可增強(qiáng)黃顙魚(yú)幼魚(yú)機(jī)體的抗氧化能力?，F(xiàn)有研究表明，植物甾醇具有抗氧化功能的主要結(jié)構(gòu)特征在于其分子側(cè)鏈上都有一個(gè)亞乙基（傅夢(mèng)月等，2013）。另外也有研究顯示，植物甾醇可以通過(guò)直接提高動(dòng)物機(jī)體抗氧化相關(guān)酶的活力來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力（李志華等，2019；張嚴(yán)偉等，2012）。

3.4 植物甾醇對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)攻毒試驗(yàn)的影響致病性嗜水氣單胞菌能夠誘發(fā)黃顙魚(yú)細(xì)菌性敗血癥，特別對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)危害更大。因此該病菌是我國(guó)黃顙魚(yú)淡水養(yǎng)殖中產(chǎn)生暴發(fā)性傳染病的主要病原菌之一（柏愛(ài)旭等，2018）。本試驗(yàn)中，各植物甾醇添加組的24 h死亡率和48 h死亡率均明顯下降，表現(xiàn)出了對(duì)嗜水氣單胞菌很好的抵抗力。研究證明植物甾醇與抗炎藥氫化可的松具有一定程度的類(lèi)似性，因而會(huì)有較強(qiáng)的抗炎作用。植物甾醇具有抗炎和抗感染功效是因?yàn)槠淠軌蚯度爰?xì)胞膜，改變后的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)會(huì)對(duì)白細(xì)胞產(chǎn)生影響，最后依靠抑制補(bǔ)體途徑產(chǎn)生免疫調(diào)控（Navarro等，2001）。

4 結(jié)論

在飼料中添加植物甾醇可以提高黃顙魚(yú)幼魚(yú)的蛋白質(zhì)效率和飼料利用率，促進(jìn)黃顙魚(yú)生長(zhǎng)，能夠提高其機(jī)體內(nèi)抗氧化相關(guān)酶的活力，降低脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)生，同時(shí)對(duì)免疫力有正相關(guān)作用，減少感染致病性嗜水氣單胞菌的死魚(yú)數(shù)量。因此建議在飼料生產(chǎn)中可以通過(guò)添加適量植物甾醇來(lái)促進(jìn)黃顙魚(yú)健康生長(zhǎng)，在本試驗(yàn)中以40 mg/kg的效果最好。