丁酸梭菌對斷奶仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)和產(chǎn)丁酸代謝的影響

張紅芳， 施偉領(lǐng)， 馬靈燕， 呂文濤， 楊彩梅， 楊 華， 吳酬飛， 肖英平*

（1.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江湖州 313000；2.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，浙江杭州 310021；3.浙江大飛龍動物保健品股份有限公司，浙江金華 321017；4浙江萬方生物科技有限公司，浙江湖州 313300）

腸道作為哺乳動物最重要的器官，其腸內(nèi)含有與宿主健康相關(guān)的多種微生物（Zhaxi，2020；徐娥，2019）。這些微生物在維持宿主生長發(fā)育方面發(fā)揮著顯著作用，例如合成維生素，刺激與免疫相關(guān)的組織來抵御病原菌的入侵，提供營養(yǎng)物質(zhì)并產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物（李潔，2020；鄭有秀，2018）。仔豬作為豬生長發(fā)育中最重要的階段，其在斷奶期間引起的應(yīng)激會打破宿主與腸道微生物的動態(tài)平衡，導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)和黏膜屏障損毀，容易引起仔豬腹瀉、采食量降低、生長速度緩慢，甚至死亡（Xun，2015；Campbell，2013）。研究表明，在飼料中加入微生態(tài)制劑能夠有效地改善斷奶仔豬的生長性能（李慧敏，2022），主要是通過改變宿主體內(nèi)腸道微環(huán)境，促進宿主體內(nèi)有益菌的增加，抑制有害菌的生長起到益生作用（黃其田，2017）。特別是自2020年飼料全面實施禁抗以來，尋找綠色安全，無毒害作用的微生態(tài)制劑已成為必經(jīng)之路（Ming，2021）。眾所周知，丁酸梭菌作為一種能調(diào)節(jié)動物疾病的革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌，作為促進動物生長的飼料添加劑已被廣泛應(yīng)用。在日糧中添加丁酸梭菌可以顯著降低畜禽的腹瀉率和腸道通透性，增加營養(yǎng)物質(zhì)的消化率和腸道緊密連接蛋白的表達，維持腸上皮屏障的完整性（李娜，2021；Fu，2021）。丁酸梭菌能夠使仔豬血清樣本中IgA、IgG蛋白的濃度明顯升高（李玉鵬，2020）。此外，丁酸梭菌在機體內(nèi)的代謝物SCFAs能夠為大腸提供必要的能量，對維持宿主的免疫穩(wěn)態(tài)起調(diào)節(jié)作用（Koh，2016），特別是在丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶作用下生成的代謝物能夠為機體腸道上皮細胞再生和修復(fù)等生物學(xué)過程提供必要的營養(yǎng)（楊華，2019）。然而，目前的研究大多集中在丁酸梭菌作為益生菌對仔豬生長性能、血清免疫的用途（Wang，2019a），對于丁酸梭菌對斷奶仔豬盲腸菌群及其產(chǎn)丁酸代謝的研究較少。因此，本試驗通過研究丁酸梭菌對斷奶仔豬盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，旨在揭示微生物及微生物代謝產(chǎn)物（SCFAs）與宿主的關(guān)系，為丁酸梭菌替代抗生素在畜牧中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和設(shè)計 選取日齡為（25±1）d、重量為（6.24±0.32）kg的“杜×長×大”斷奶仔豬162頭，隨機分成3個試驗組。處理如下：對照組（Ctrl組）給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，試驗組在對照組的基礎(chǔ)上加入濃度為500 mg/kg（CB500組）和2000 mg/kg（CB2000組）的丁酸梭菌。試驗仔豬飼喂的常規(guī)飼料成分與配方參照鄭有秀（2018）的報道，飼養(yǎng)期為30 d，然后從每個組中選取4頭仔豬進行屠宰，取盲腸內(nèi)容物于-80℃保存用于測序。

1.2 DNA提取和產(chǎn)丁酸關(guān)鍵功能基因RTPCR分析 用QIAamp DNA Stool Mini Kit（QIAGEN，CA）試劑盒從試驗仔豬盲腸內(nèi)提取一定量的微生物DNA，參照趙廣民（2021）的引物序列（表1）對仔豬盲腸丁酸激酶和丁酰-CoA，乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶進行PCR擴增，其擴增體系共10μL，分別為5.0 μL SYBRTM Green Mix，上、下游引物各0.5μL，dd H2O 4.0μL，擴增流程為:在溫度為95℃的條件下進行預(yù)變性2 min；95℃變性15 s；58℃退火45 s；最后在72℃延伸1 min；共三十次循環(huán)。每個樣品設(shè)置三次重復(fù)，根據(jù)所測定的Ct值和標準曲線對比來計算樣本中基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.3 短鏈脂肪酸測定 參照Xiao（2017）的方法進行短鏈脂肪酸含量的測定，具體為稱取斷奶仔豬盲腸腸道內(nèi)容物0.5 g于15 mL的離心管中，加入5 mL超純水，緩慢搖晃至混合均勻，12000 r/min離心10 min。抽取1 mL的上清液后，向其中加入0.2 mL的巴豆酸和偏磷酸混合液，之后使用規(guī)格為0.22μm的濾膜對上述混合液進行過濾，之后使 用毛細管 氣 相 色 譜 儀 （GC-2010 plus，Shimadzu，Japan）測定短鏈脂肪酸的濃度。

1.4 高通量測序和生物信息學(xué)分析 用341F（5＇-CCTAYGGGRB-GCASCAG-3＇）和806R（5＇-GGACTACNNGGG-TATCTAAT-3＇）對16S rRNA基因的高變區(qū)（V3～V4區(qū)）進行擴增，并借助于Illumina Hiseq平臺對擴增區(qū)域進行測定分析。用QIIME平臺對相似度為97%的測序數(shù)據(jù)按照不同操作單元（OTU）進行分類。用Sliva和RPD對OTU中全部典型序列進行物種匹配。之后按照最終有效數(shù)據(jù)對其不同分類下的相對豐度進行統(tǒng)計分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析 qPCR、SCFA兩個試試驗數(shù)據(jù)用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），用Duncan's法進行多重比較，以“平均值±標準誤”表示，P＜0.05為數(shù)據(jù)差異有意義。并用Graph Pad Prim7軟件包進行微生物多樣性作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌對仔豬盲腸菌群豐度和多樣性的影響 由表2可知，相比對照組，用丁酸梭菌處理可以使仔豬盲腸內(nèi)容物中菌群α多樣性的豐度指數(shù)（chao）指數(shù)和香農(nóng)（shannon）指數(shù)有明顯的升高趨勢。且本次測序樣本覆蓋度（Goods_coverage）指數(shù)為0.996～0.997，說明本次測序樣本的覆蓋度較全面，符合測序要求。

表2 仔豬盲腸菌群alpha多樣性分析

2.2 丁酸梭菌對仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)的分析 門和屬水平的盲腸內(nèi)容物中的細菌群落組成見圖1，在仔豬盲腸中相對豐度最高的三個優(yōu)勢菌門分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobac-teria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）、其厚壁菌門和變形菌門的相對豐度分別為61.67%～86.95%和4.96%～24.84%，擬桿菌門為3.37%～16.71%。且與Ctrl組相比，CB2000組的變形菌門和廣古菌門（Euryarchaeota）相對豐度分別下降了1.34%和6.62%（P＜0.05）。

圖1 丁酸梭菌對仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響

在屬水平上，其相對豐度最高的有梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）、土 孢 桿 菌 屬（Terrisporobacter）、直腸真桿菌屬（[Eubacterium]_rectale_group）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、幽門螺桿菌（Helicobacter）、普雷沃氏菌屬（Prevotella_9）、布勞特氏菌屬（Blautia）、罕見小球菌屬（Subdoligranulum）、羅斯氏菌屬（Roseburia）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）。相比對照組而言，CB500組中Terrisporobacter和Staphylococcus相對豐度分別增加了0.38%和0.14%（P＜0.05）。

由圖2可知，與Ctrl組相比，CB2000組的彎曲菌屬（Campylobacter）和瘤胃菌屬（Ruminococcaceae_UCG-014）的相對豐度分別下降了5.5%和0.72%（P＜0.05）。但相比于Ctrl組，CB500組的庫特氏菌屬（Kurthia）和鏈球菌屬（Streptococcus）分別增加了0.71%和0.03%（P＜0.05）。

圖2 仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)熱點圖（前35種菌屬）

2.3 不同水平丁酸梭菌對仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)Beta多樣性分析 由圖3可知，基于非加權(quán)法通過對不同水平丁酸梭菌對仔豬盲腸菌群樣品間的差異進行主坐標分析（PCoA）發(fā)現(xiàn)，當R=0.1065時，對照組和試驗組有顯著不同的聚類，且試驗組在不同水平下有不同的聚類，說明試驗組和對照組仔豬盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)存在差異，且試驗組在不同水平的丁酸梭菌濃度添加下其菌群結(jié)構(gòu)也存在差異。

圖3 仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)主坐標分析

2.4 丁酸梭菌對斷奶仔豬盲腸SCFA的影響由表3可知，與對照組相比，丁酸梭菌處理使斷奶仔豬盲腸中丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和總短鏈脂肪酸的含量有增多趨勢，其中丁酸含量增加趨勢較為明顯（P=0.064），且CB2000組丁酸含量比對照組增加了28.0%。

表3 仔豬盲腸短鏈脂肪酸含量

2.5 丁酸梭菌仔豬盲腸產(chǎn)丁酸代謝關(guān)鍵功能基因的影響 由表4可知，與對照組相比，丁酸梭菌處理組的丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶的相對表達含量增加，尤其是丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶的表達量增加顯著（P＜0.05），且CB2000組丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶的表達量與對照組相比增加了15%。

表4 仔豬盲腸丁酸激酶和丁酰－CoA：乙酰－CoA轉(zhuǎn)移酶基因相對表達量

3 討論

丁酸梭菌制劑作為一種活菌被廣泛應(yīng)用于豬、牛和家禽飼料中，其產(chǎn)生的芽孢能夠抵制外界環(huán)境的惡劣變化，并且在生物體內(nèi)能夠耐酸、耐熱、耐膽汁。Scalfaro（2017）研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌進入人和動物腸道后，通過產(chǎn)生抗菌化合物如有機酸和細菌素來增強腸上皮屏障功能，進而對病原體起到一定的拮抗效果，導(dǎo)致病原菌的增殖生長速率大幅下降，改善免疫狀態(tài)、腸黏膜結(jié)構(gòu)和腸道微生物的分布。Wang（2019b）用不同水平濃度的丁酸梭菌對仔豬空腸進行處理后發(fā)現(xiàn)，處理組腸道內(nèi)TLR4、MyD88、NF-κB的表達水平明顯下調(diào)，這說明丁酸梭菌能夠?qū)LR4炎癥通路起到一定的調(diào)節(jié)控制作用，進而使LPS誘導(dǎo)的機體炎性反應(yīng)明顯減緩。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌能夠使仔豬腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群含量明顯增多，進而對毒害菌群的增殖和生長產(chǎn)生一定的抑制作用，進而使機體免疫系統(tǒng)生物學(xué)功能顯著增強，并有效促進機體的生長發(fā)育（趙敏孟，2018）。本研究中，在斷奶仔豬日糧中添加500 mg/kg的丁酸梭菌可以顯著增加盲腸菌群厚壁菌門的相對豐度，通過進一步對屬水平上進行分析發(fā)現(xiàn)，盲腸內(nèi)容物中鏈球菌屬（Streptococcus）的相對豐度顯著增加，彎 曲 菌 屬（Campylobacter）和 瘤 胃 菌 屬（Ruminococcaceae_UCG-014）等條件致病菌的相對豐度顯著降低（P＜0.05），這與Han（2020）和王遠霞（2020）的研究結(jié)果一致。說明用丁酸梭菌處理可以調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，有效的緩解仔豬腹瀉。

丁酸作為腸上皮細胞的主要能源物質(zhì)，在人體結(jié)腸內(nèi)超過95%的丁酸被吸收利用，既維持了生物體內(nèi)結(jié)腸細胞的穩(wěn)定，又可以防止或抑制細胞發(fā)生病變，且一定水平的丁酸能夠通過調(diào)節(jié)腸道菌群來治療腸應(yīng)激綜合征。在動物中，丁酸作為具有多種生物學(xué)特性的脂肪酸，能夠促進動物的生長性能并影響動物產(chǎn)品品質(zhì)（黃翠翠，2021）。Elamin（2013）研究發(fā)現(xiàn)，丁酸通過增加黏液層的厚度來對Caco-2細胞起保護作用。丁酸梭菌代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸（SCFA）特別是丁酸等可以被后腸迅速吸收，既維持了大腸的正常功能，又降低了腸道滲透壓和pH，有利于提高動物腸道內(nèi)消化酶的活性（林華林，2019）。本研究中丁酸梭菌處理的斷奶仔豬盲腸內(nèi)容物中丙酸、丁酸、戊酸的含量均有增加趨勢，產(chǎn)丁酸代謝關(guān)鍵酶丁酰－CoA：乙酰－CoA轉(zhuǎn)移酶基因的相對表達量明顯升高。這表明丁酸梭菌有助于生成多種對機體有益的代謝物，例如維生素和胞外酶等，進而改善機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和消化，更好的塑造腸道代謝環(huán)境，有益于斷奶仔豬健康。

4 結(jié)論

丁酸梭菌處理能夠增加仔豬盲腸鏈球菌屬、庫特氏菌屬、土孢桿菌屬的豐度，顯著降低仔豬腸道內(nèi)彎曲菌屬和瘤胃菌屬等條件致病菌的豐度。丁酸梭菌處理能夠使腸道短鏈脂肪酸含量呈增加趨勢，且產(chǎn)丁酸的關(guān)鍵酶丁酰－CoA：乙酰－CoA轉(zhuǎn)移酶的表達水平顯著上調(diào)。