蒼術(shù)不同部位中揮發(fā)油的資源評價研究

王興源，張 杰，趙建華，羅思凡，王 欣，王飛娟

（陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 西安 712046）

蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodes lancea (Thunb.)DC.或北蒼術(shù)Atractyl odes chinensis (DC.) Koidz.的干燥根莖，臨床上可用于脘腹脹滿、風(fēng)濕痹痛及風(fēng)寒感冒等[1]。蒼術(shù)熏蒸空氣能夠解郁避穢，在病房、產(chǎn)房及手術(shù)室等均取得了滿意效果，而其揮發(fā)油為殺菌的主要活性成分[2-3]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)常用于中藥揮發(fā)油的研究[4-5]，對于蒼術(shù)揮發(fā)油的提取多使用根莖部位，而其地上部分資源的利用缺乏，有待深入研究。本研究通過提取北蒼術(shù)葉片和根莖中的揮發(fā)油，并對揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS 分析以及實(shí)驗(yàn)室抑菌實(shí)驗(yàn)，為實(shí)現(xiàn)蒼術(shù)地上部分的綜合利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

日本島津GC8040 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；BSA 323S 型電子天平為賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司生產(chǎn)；MH-1000 電熱套于北京科偉永興儀器有限公司購買；QE-100 型高速粉碎機(jī)購買于浙江屹立工貿(mào)有限公司；XSE105DU 型電子天平（METTLER TOLEDO）；RE2000B 型壓力蒸汽滅菌鍋生產(chǎn)于河南鞏義市予華儀器有限公司；96 孔微量板；普通培養(yǎng)箱。

無水硫酸鈉、乙醚、葡萄糖、氯化鈉、氫氧化鈉、碘硝基四唑紫（均為分析純），蒸餾水。PB 及PDA 培養(yǎng)基。抗菌活性實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干品由陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

實(shí)驗(yàn)用蒼術(shù)經(jīng)陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院賴普輝教授鑒定為菊科蒼術(shù)屬植物北蒼術(shù)的干燥根莖和葉片。

1.2 蒼術(shù)揮發(fā)油的提取

將蒼術(shù)葉置于裝有95%乙醇中加熱約30min 后干燥，以去除葉中的葉綠素。將蒼術(shù)根莖430g（粉碎至20 目）及蒼術(shù)葉200g 放于3000ml 的圓底燒瓶中，加入蒸餾水1000ml、重蒸乙醚200ml 蒸餾萃取4 小時，用無水Na2SO4去除萃取液中的水分并減壓回收乙醚，即得淡黃色蒼術(shù)揮發(fā)油，冷卻后為淡黃色固體，分別放入4℃冰箱保存待用。

1.3 GC-MS 工作條件

GC8040 型GC-MS 儀，色譜柱型號：Thermo TR-5-MS 毛細(xì)管質(zhì)譜柱（30m×0.25mm×0.33μm）；流動相為氦氣，流量為1.0ml/min，進(jìn)樣口溫度150℃；柱 溫60 ℃，以5 ℃/min 升 至80 ℃，保 持1min，以10℃/min 升至180℃，保持3min，再以15℃/min 升至250℃，保持5min；掃描模式：采用全掃描，選擇質(zhì)量30～350amu，EI 方式電離，電子能量70eV，離子源溫度200℃，傳輸線溫度250℃。分析方法：通過與計算機(jī)NIST 譜庫對比各色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖定性，根據(jù)總離子流圖采用面積歸一法計算其相對含量。

1.4 培養(yǎng)基的制備

細(xì)菌培養(yǎng)基的制備（PB 培養(yǎng)基）：準(zhǔn)確稱取3g 牛肉膏、10g 蛋白胨、5gNaCl 后加適量蒸餾水，用電爐加熱攪拌至其充分溶解，再加入15g 瓊脂粉使其融化后加水定容至1000mL。溶液冷卻至室溫后，用1mol/L 的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的PH 值至7.3，再將其裝入不同的錐形瓶中牛皮紙封好瓶口，用高壓蒸汽滅菌鍋（121℃，20min）滅菌后備用。

真菌培養(yǎng)基的制備（PDA 培養(yǎng)基）：將去皮的馬鈴薯切成塊狀并稱取200g，用適量蒸餾水煮沸（20～30min）后用雙層紗布過濾除去雜質(zhì)，再加葡萄糖20g，瓊脂15g，加水定容至1000mL。待溶液冷卻至室溫后，用1mol/L 的氫氧化鈉調(diào)節(jié)至溶液的PH 值為5.6，再將其傾倒于不同的錐形瓶中用牛皮紙封好瓶口，用高壓蒸汽滅菌鍋（115℃，20min）滅菌即得。

1.5 抑菌活性的測定

選擇濾紙片法對揮發(fā)油的抑菌活性進(jìn)行檢測[6-7]。以無水乙醇作為溶劑，分別將蒼術(shù)根莖和葉片揮發(fā)油配制成50mg/mL 的溶液。在無菌環(huán)境下，滴加試菌液0.1mL 于培養(yǎng)皿的平板表面上涂勻，并將滅菌的濾紙片（d=6mm）分別在樣品溶液中浸潤30min，待濾紙片充分吸收試液后取出瀝干貼于平板表面中央，每個培養(yǎng)皿貼兩個濾紙片，其中兩個小紙片分別為空白對照組（無水乙醇）和揮發(fā)油溶液組。用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌各做三組平行，放置平整后輕壓使濾紙片緊貼于平板表面，蓋上平皿蓋靜置30min 后置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。37℃下培養(yǎng)細(xì)菌24h，28℃下培養(yǎng)真菌48h。最后通過肉眼觀察結(jié)果并測量各組蒼術(shù)揮發(fā)油對4 種供試菌種的抑菌圈直徑。

1.6 抗菌實(shí)驗(yàn)

最低抑菌濃度（MIC）的測定：本實(shí)驗(yàn)在參考文獻(xiàn)[8]的基礎(chǔ)上稍作改動，采用微量稀釋法對蒼術(shù)根莖和葉片中揮發(fā)油的最低抑菌濃度進(jìn)行考察。在96 孔板中，供試樣品孔為第1 列至8 列，空白對照孔為第9列。每孔中加入100μL 液體培養(yǎng)基后，利用倍比稀釋法將其分為不同稀釋濃度，即濃度梯度依次為25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.57%、0.78%、0.39%、0.20%（V/V）。將50μL 不同濃度的揮發(fā)油藥液依次加入96 孔板中，其中空白對照組加入50μL 無水乙醇，并按順序向每孔中滴加50μL 菌液，每個濃度設(shè)置3 個復(fù)孔作為平行。37℃下培養(yǎng)細(xì)菌24h，28℃下培養(yǎng)真菌48h。每孔加入0.2g/L 的碘硝基四唑紫溶液50μL，若出現(xiàn)紫色則表明有活菌，首次出現(xiàn)紫色的溶液濃度則為蒼術(shù)揮發(fā)油的最低抑菌濃度。

最小殺菌濃度（MBC）的測定：采用平板轉(zhuǎn)種法測定MBC[9]。依次用無菌生理鹽水稀釋平板未生長孔的培養(yǎng)物（≥MIC）20 倍后，取0.05ml 接種在瓊脂平板上，并在培養(yǎng)箱（37℃，24h）條件培養(yǎng)。此時，細(xì)菌未生長區(qū)域的最小藥物濃度可認(rèn)為是該揮發(fā)油的最小殺菌濃度。

2 結(jié)果

2.1 蒼術(shù)揮發(fā)油成分分析

在上述氣相色譜試驗(yàn)條件下，北蒼術(shù)的根莖和葉片揮發(fā)油中分離出的峰數(shù)量分別為54 個、50 個。通過NIST 譜庫定性及文獻(xiàn)資料[10]直觀比較蒼術(shù)揮發(fā)油成分的基峰及相對豐度等，分別鑒定出化合物50 個、47 個。通過分析面積歸一法測得上述化合物在根莖和葉片揮發(fā)油總組分中的含量分別為98.4%和95.2%。

結(jié)果顯示，蒼術(shù)根莖和葉片中揮發(fā)油成分含量較高的均為4-聯(lián)苯甲醛，八氫四甲基萘甲醇、桉葉烯和茅術(shù)醇等，但并未檢出蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素。研究顯示，提取方法及所選溶劑的不同是影響蒼術(shù)揮發(fā)油抽提成分不同的重要因素。賈春曉等[11]采用蒸餾萃取法和索氏提取法分別鑒定出蒼術(shù)揮發(fā)油化合物49 種、22 種，同時以二氯甲烷、無水乙醚和正己烷為溶劑進(jìn)行抽提所得成分也各不相同。本研究使用水蒸氣蒸餾法提取出蒼術(shù)揮發(fā)油的有效成分主要為C15等倍半萜類成分，這可能與該實(shí)驗(yàn)所采用的揮發(fā)油提取方式及MS 的分離條件有關(guān)。

2.2 抑菌活性分析

蒼術(shù)不同部位對4 種菌種的抑制作用結(jié)果顯示，蒼術(shù)根莖和葉片揮發(fā)油均有一定的抑菌效果，而抑菌活性卻有差別。根莖揮發(fā)油和葉片揮發(fā)油對4 種菌種的抑菌效果一致，無顯著差異。其中兩部位所提取的揮發(fā)油對大腸桿菌及枯草芽孢桿菌的抑制作用較金黃色葡萄球菌、白色念珠菌次之。

2.3 抗菌活性結(jié)果分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證不同部位的蒼術(shù)揮發(fā)油抑制作用，本實(shí)驗(yàn)采用倍比稀釋法研究其對不同試驗(yàn)菌種的MIC和MBC。

由此可知，兩部位提取的蒼術(shù)揮發(fā)油對不同菌株的MIC 結(jié)果一致，且其對G+（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）及真菌（白色念珠菌）的抑制作用較強(qiáng)，對G-（大腸桿菌）的作用較弱。

蒼術(shù)不同部位揮發(fā)油對供試菌株的MIC 范圍在0.79%～1.58%（V/V）。其中兩部位提取的揮發(fā)油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的MIC 值均為0.79%（V/V），對枯草芽孢桿菌的MIC 值為1.58%（V/V）；而其對不同菌株的MBC結(jié)果有差異，范圍在1.58%～12.5%（V/V）。

3 討論

本研究通過分析水蒸氣蒸餾法提取的北蒼術(shù)根莖和葉片中揮發(fā)油的成分及含量，并對其揮發(fā)油的生物活性進(jìn)行初步驗(yàn)證。

結(jié)果表明，蒼術(shù)不同部位揮發(fā)油化學(xué)成分復(fù)雜多樣且以萜類成分為主，其中含量較高的均為4-聯(lián)苯甲醛，八氫四甲基萘甲醇、桉葉烯和蒼術(shù)醇等，這與李迎春等的研究中揮發(fā)油中的主要成分相一致[12]，說明植物與其所含化學(xué)成分有一定的相關(guān)性。而北蒼術(shù)葉片中所含的揮發(fā)油成分與習(xí)用部位（根莖）的化學(xué)成分相一致且其相對含量的差異亦并不明顯，提示北蒼術(shù)的葉片也有潛在利用價值，為蒼術(shù)藥用資源的綜合利用及開發(fā)奠定了一定的理論依據(jù)。

抑菌活性分析結(jié)果顯示，北蒼術(shù)根莖與葉片中的揮發(fā)油對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌及白色念珠菌均有抑制作用，且蒼術(shù)不同部位提取的揮發(fā)油對同一供試菌種的抑制效果無明顯差異。抑菌圈的大小能夠反映病菌對藥物的敏感度，即抑菌圈直徑越大該病菌對藥物越敏感。

本研究結(jié)果顯示，蒼術(shù)揮發(fā)油對大腸桿菌及枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑較金黃色葡萄球菌、白色念珠菌小，提示蒼術(shù)根莖與葉片中的揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的抑制作用較強(qiáng)，對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑制作用較弱。

抗菌活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同部位的蒼術(shù)揮發(fā)油對不同菌株的最小抑菌濃度結(jié)果一致，對實(shí)驗(yàn)所選用的4 種菌株均有明顯的抑制和滅活作用。其中，以G+及真菌的抑制作用較強(qiáng)，這也與金詩鳳等、施綺云等利用蒼術(shù)作為空氣消毒劑的研究結(jié)果相同[13-14]。由于北蒼術(shù)揮發(fā)油化學(xué)成分的復(fù)雜多樣性[15]，本實(shí)驗(yàn)僅驗(yàn)證了其部分抗菌的生物活性，抗菌殺菌實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步研究。

綜上，提取的蒼術(shù)根莖及葉片揮發(fā)油的化學(xué)成分相一致，且蒼術(shù)葉片亦具有抑菌抗菌活性，為蒼術(shù)全珠資源的開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。而本研究僅采用水蒸氣蒸餾法提取了不同部位蒼術(shù)揮發(fā)油，后續(xù)亦可通過不同提取方法及溶劑萃取分離出不同的蒼術(shù)揮發(fā)油成分，并選用不同的菌種進(jìn)行相應(yīng)的活性研究，以期為蒼術(shù)的綜合利用及資源開發(fā)提供參考。