陳玉靜 丁一倩 周明兵
(浙江農(nóng)林大學(xué),省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,竹子研究院,浙江 杭州 311300)
植物細(xì)胞中,除可編碼蛋白的信使RNA(mRNA)以外,還存在著諸多類型的非編碼RNA,包含核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、反式作用tasiRNA、小干擾RNA(siRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)和環(huán)狀RNA(circRNA)等[1]。其中circRNA廣泛參與脅迫響應(yīng),逐漸成為近幾年的研究熱點(diǎn)。
circRNA 第一次被發(fā)現(xiàn)是在高等植物的類病毒中[2-3]。隨著高通量測(cè)序和生物信息學(xué)的發(fā)展,在古菌、秀麗線蟲、小鼠、大鼠和人類中同樣發(fā)現(xiàn)了大量環(huán)狀RNA[4-5]。雖然circRNA 在植物中被首次鑒定[6],但植物circRNA 的研究相對(duì)落后。近幾年circRNA 在單子葉植物水稻[7]、小麥[8]和玉米[9],雙子葉植物擬南芥[10]、茶樹[11]、沙棘[12]、苧麻[13]等植物中相繼被發(fā)現(xiàn)。為了大規(guī)模鑒定circRNA,很多預(yù)測(cè)circRNA 的軟件被開發(fā)出來,如CIRI2[14]、CIRI-full[15]、CircAST[16]、find_circ[17]、CircRNAwrap[18]等均為用于預(yù)測(cè)動(dòng)物circRNA 的軟件;CircPlant[19]和PCirc[20]是特異性針對(duì)植物circRNA 的鑒定軟件,能更準(zhǔn)確、有效地識(shí)別植物中的circRNA。
目前已有研究表明,circRNA 在受到非生物脅迫時(shí)會(huì)發(fā)生差異表達(dá)。例如,擬南芥在弱光和強(qiáng)光脅迫后,circRNA發(fā)生明顯的差異表達(dá)[1];在鹽脅迫下,對(duì)黃瓜進(jìn)行circRNA 分析,發(fā)現(xiàn)有差異表達(dá)[21];在高溫脅迫下,circRNA 在番茄葉片中的表達(dá)量也有所上升或者下降[22]。非生物脅迫不僅會(huì)使circRNA 表達(dá)量發(fā)生改變,而且會(huì)影響前體mRNA 的選擇性剪接,進(jìn)而影響circRNA的形成[16]。
有證據(jù)表明circRNA是細(xì)胞不同RNA互作的網(wǎng)絡(luò)重要組成部分。所有包含miRNA 結(jié)合位點(diǎn)的RNA 轉(zhuǎn)錄本可以通過競(jìng)爭(zhēng)共享與miRNA 的相互作用[6]。與miRNA 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,從而調(diào)控mRNA 的非編碼RNA稱為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)[23-25]。第一個(gè)ceRNA 是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的,該研究表明非編碼RNA IPS1 可以通過與miR399 結(jié)合來影響PHO2的表達(dá)水平[26]。近期同樣有研究表明circRNA 是ceRNAs的重要成員,通過miRNA 調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。例如,有報(bào)道發(fā)現(xiàn)CircFN1可以通過CircFN1-miR-19a/b-3p-ATF2網(wǎng)絡(luò)調(diào)控氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡以及增殖和遷移[27]。
毛竹在我國分布極其廣泛,是集眾多功能于一體的筍材兩用竹種。目前,關(guān)于circRNA 參與毛竹生長(zhǎng)發(fā)育的研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn),毛竹的開花植株比3 周齡幼苗、1 歲植株、明年開花植株和小花中存在數(shù)量更多的circRNA;circRNA 的側(cè)邊內(nèi)含子在長(zhǎng)末端重復(fù)(long terminal repeat,LTR)反轉(zhuǎn)座子中存在高甲基化和富集,說明circRNA 參與了毛竹開花的調(diào)控[28]。另有研究也發(fā)現(xiàn),circRNA 可以通過與miRNA 和mRNA 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相互作用,參與毛竹竹筍的生長(zhǎng)[29]。
吳佳軍[30]前期構(gòu)建了低溫、高溫、紫外、高鹽等4種脅迫全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。為研究毛竹響應(yīng)脅迫機(jī)制,本研究利用上述4種脅迫全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,篩選并鑒定在紫外(ultar-violet,UV)脅迫和高溫下都差異表達(dá)的1個(gè)circRNA,命名為PhcircRNA1;分析與PhcircRNA1協(xié)同表達(dá)的miRNA 和mRNA,構(gòu)建circRNA - miRNA - mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),研究PhcircRNA1參與毛竹脅迫響應(yīng)和根尖中生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的機(jī)制,以期為circRNA 調(diào)控毛竹的生長(zhǎng)發(fā)育提供新思路。
毛竹(Phyllostachys edulis)種子均采自廣西桂林市靈川縣同一株母竹。剝好的種子用反滲透水浸泡3 d后,再用10%次氯酸鈉浸泡消毒,之后在墊上濾紙的培養(yǎng)皿中催芽培養(yǎng)后,再移栽到盆里,培養(yǎng)基質(zhì)為泥炭:蛭石:珍珠巖,體積比例為3∶1∶1。
毛竹長(zhǎng)至五葉一心時(shí)期,將其暗處理3 d后進(jìn)行脅迫處理。脅迫處理?xiàng)l件:1)42 ℃高溫脅迫(4、6、8 h)[31];2)紫外脅迫(2、4、6 h)[32];對(duì)照(CK)培養(yǎng)條件為正常光照下28 ℃培養(yǎng),取五葉一心葉片進(jìn)行液氮速凍,存于-80 ℃冰箱。毛竹種子催芽處理后,將其水培培養(yǎng)。根據(jù)毛竹根生長(zhǎng)的發(fā)育規(guī)律,待毛竹主根長(zhǎng)至0.5~1 cm時(shí),以水培15、30、35 d 的0.5 mm 左右根尖作為材料[33-35],進(jìn)行液氮速凍后于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。提取RNA時(shí),每管使用6株毛竹的根尖。所有樣品均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。
采用天根生化有限公司RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取RNA。RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 的試劑盒分為兩種:Hifair?III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)試劑盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司],和miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop)試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司);反轉(zhuǎn)錄miRNA 所用莖環(huán)引物:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT GGATACGACGTGCCC-3',同時(shí)加入5.8S rRNA 的下游引物一起進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。最后將得到的cDNA 保存在-20 ℃冰箱備用。
使用find_circ[17]軟件對(duì)毛竹中circRNA 進(jìn)行預(yù)測(cè)。首先從全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)[30]的毛竹基因組中不能比對(duì)上的序列片段(reads)兩端各取20 bp 作為錨點(diǎn),將錨點(diǎn)作為reads 與基因組進(jìn)行比對(duì),當(dāng)錨點(diǎn)比對(duì)位置與轉(zhuǎn)錄本中位置相反時(shí),延長(zhǎng)錨點(diǎn)read 直至找到circRNA 接合位置。選擇在兩端序列存在GT/AT 剪接信號(hào),且片段數(shù)量(read count)大于等于2 的circRNA作為候選circRNA。利用浙江農(nóng)林大學(xué)周明兵課題組(本課題組)前期研究得到的4 種脅迫全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[30],在該毛竹circRNA數(shù)據(jù)庫中,以|log2 fold change|≥1且P<0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn),篩選了1 個(gè)在紫外脅迫和高溫脅迫下都差異表達(dá)的circRNA,命名為PhcircRNA1。利用植物小RNA 標(biāo)靶分析軟件psRNATarget(v2)(參數(shù)設(shè)置:最大期待值設(shè)置為5,互補(bǔ)性評(píng)分長(zhǎng)度設(shè)置為19),分析得到PhcircRNA1的靶miRNA,該miRNA 與miRNA156 成熟序列[35]只相差1 個(gè)堿基,命名為PhmiR156。用TargetFinder[36]軟件對(duì)Ph-miR156 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),再在4 種脅迫全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[30]中篩選出在紫外和高溫脅迫下均差異表達(dá)的靶基因。
設(shè)計(jì)引物前,先將5'端和3'端各自截取300 bp 序列,將3'端截取的序列置于5'端頭部,形成一個(gè)新序列,用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)跨環(huán)化位點(diǎn)的發(fā)散引物(divergent primers)。
核糖核酸酶R(ribonuclease R,RNase R)是一種來源于大腸桿菌RNR 超家族的3'→5'核糖核酸外切酶,可從3'→5'方向?qū)NA 逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R可消化幾乎所有的線性RNA分子,但不易消化環(huán)形RNA[37]。將0.5 μL RNase R加入到2.5 μg毛竹RNA 中,37 ℃孵育30 min,把消化后的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用發(fā)散引物鑒定PhcircRNA1穩(wěn)定性。
PhcircRNA1和靶基因用普通反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板,NTB作為內(nèi)參,用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix 試劑盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司]進(jìn)行PhcircRNA1和靶基因定量分析,通過Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR 引物(表1)。miRNA(PhmiR156)用miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到的cDNA 作為模板,以5.8S rRNA 作為內(nèi)參,利用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)進(jìn)行miRNA 定量分析。利用qRT-PCR 和2-△△Ct法分析PhcircRNA1、miRNA(Ph-miR156)和mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系共20 μL:10 μL SYBR,0.5 μL 上游引物,0.5 μL 下游引物,1 μL cDNA,8 μL ddH2O。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃復(fù)性30 s,共40個(gè)循環(huán)。
表1 qRT-PCR引物序列Table 1 The sequence of the primers for qRT-PCR
使用find_circ[35]軟件對(duì)毛竹中circRNA 預(yù)測(cè)后,結(jié)合4種脅迫全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[30],以|log2 fold change|≥1且P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn),篩選出在紫外脅迫和高溫脅迫下都差異表達(dá)的1 個(gè)circRNA,其前體序列位于moso_draft_hic_scaffold_16 染 色 體 (80360941~0361611、80385866~80388941),經(jīng)過反向剪接形成了由6 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子組成的外顯子-內(nèi)含子型circRNA(exon-intron circular RNA,EIciRNA),并命名為PhcircRNA1(圖1-A)。利用植物小RNA 標(biāo)靶分析軟件psRNATarget鑒定出與PhcircRNA1有17個(gè)互補(bǔ)配對(duì)堿基的1 個(gè)靶miRNA(圖1-B),該miRNA 與水稻miRNA156 相差1 個(gè)堿基(圖1-C),命名為PhmiR156。用TargetFinder[36]軟件對(duì)Ph-miR156 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)后,篩選出紫外脅迫和高溫脅迫(42 ℃)下均差異表達(dá)的4 個(gè)靶基因(圖1-D):PH02Gene02319(Glutamate Receptor - Like Gene 3.1,GLR3.1),PH02Gene31266(Ubiquitin-conjugating enzyme,UBC28),PH02Gene28384(Cyclic Nucleotide-Gated Channel 8,CNGC8)和PH02Gene33036(Vernalization Insensitive 3-Like 1,VIL1)(圖2)。
圖1 PhcircRNA1的鑒定Fig.1 Identification of PhcircRNA1
圖2 PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA在不同脅迫處理下的表達(dá)分析Fig.2 Expression analysis of PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA in different stress treatments
在RNase R 消化處理后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,分別用內(nèi)參NTB的定量引物和PhcircRNA1的發(fā)散引物進(jìn)行PCR。結(jié)果顯示,RNase R 消化組中的NTB條帶明顯變淡,表明RNase R 對(duì)total RNA 中線性RNA 具有消化作用,而PhcircRNA1基本上沒有變化(圖3-A)。將PhcircRNA1的PCR 擴(kuò)增片段進(jìn)行膠回收,測(cè)序比對(duì)結(jié)果證實(shí)了PhcircRNA1首尾相連的特征(圖3-B),進(jìn)一步證明PhcircRNA1符合環(huán)狀RNA特征。
圖3 PhcircRNA1成環(huán)驗(yàn)證Fig.3 Verification of PhcircRNA1 cyclization
為研究PhcircRNA1在紫外脅迫下的表達(dá)模式,對(duì)不同時(shí)間紫外處理下的PhcircRNA1進(jìn)行差異表達(dá)分析。結(jié)果表明,在紫外脅迫(2、4、6 h)時(shí),PhcircRNA1表達(dá)量呈先下降后上升趨勢(shì),而4 個(gè)靶基因PH02Gene 02319(GLR3.1)、PH02Gene31266(UBC28)、PH02Gene2 8384(CNGC8)和PH02Gene33036(VIL1)表達(dá)量也先降低后升高,與PhcircRNA1表達(dá)趨勢(shì)一致,而Ph-miR156表達(dá)量呈先上升后下降趨勢(shì),與PhcircRNA1和靶基因表達(dá)趨勢(shì)相反(圖4)。表明PhcircRNA1表達(dá)量下降會(huì)引起Ph-miR156 表達(dá)量升高,進(jìn)一步降低4 個(gè)靶基因的表達(dá)量。說明在紫外脅迫下,PhcircRNA1-PhmiR156-mRNA調(diào)控通路符合競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA機(jī)制。
圖4 PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA在紫外脅迫下的表達(dá)模式Fig.4 Expression patterns of PhcircRNA1-Ph-miR156-mRNA under ultraviolet stress
為研究PhcircRNA1在高溫脅迫下的表達(dá)模式,對(duì)不同時(shí)間高溫脅迫下的PhcircRNA1進(jìn)行差異表達(dá)分析(圖5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在高溫脅迫(4、6、8 h)下PhcircRNA1表達(dá)量隨著高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而降低,Ph-miR156 表達(dá)量呈升高趨勢(shì),而4 個(gè)靶基因PH02Gene02319(GLR3.1)、PH02Gene31266(UBC28)、PH02Gene28384(CNGC8)和PH02Gene33036(VIL1)表達(dá)量呈降低趨勢(shì),與PhcircRNA1表達(dá)趨勢(shì)一致。結(jié)合上文PhcircRNA1在紫外脅迫下的變化,進(jìn)一步證實(shí)了PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA調(diào)控通路的真實(shí)性。
圖5 PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA在高溫脅迫下的表達(dá)模式Fig.5 Expression patterns of PhcircRNA1-Ph-miR156-mRNA under high temperature stress
取毛竹生長(zhǎng)不同時(shí)期(0、15、30、35 d)的根尖作為研究對(duì)象(圖6-A)。通過qRT-PCR 分析GLR3.1表達(dá)模式的變化,在0~15 d 時(shí),PhcircRNA1和GLR3.1表達(dá)量下降,15~30 d時(shí)表達(dá)量上升,30~35 d時(shí)表達(dá)量再次下降,Ph-miR156表達(dá)趨勢(shì)與PhcircRNA1和GLR3.1表達(dá)趨勢(shì)相反(圖6-B),說明PhcircRNA1可能通過調(diào)控Ph-miR156和GLR3.1參與毛竹根尖的生長(zhǎng)發(fā)育。
圖6 PhcircRNA1在毛竹四個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期根尖的表達(dá)模式Fig.6 Expression patterns of PhcircRNA1 in moso bamboo root tip at four growth stages
circRNA 是一種具有多種生物學(xué)功能的新型調(diào)控RNA,在植物中大量分布,通常來自外顯子、內(nèi)含子以及基因間區(qū)域。本研究根據(jù)本課題組前期研究得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選并鑒定到PhcircRNA1以及其調(diào)控的miRNA 和4 個(gè)靶基因,PhcircRNA1是由位于moso_draft_hic_scaffold_16 染 色 體(80360941~0361611、80385866~80388941)的前體序列反向剪接形成的EIciRNA。在植物中,circRNA 的反向剪接位點(diǎn)側(cè)翼序列中重復(fù)元件或反向互補(bǔ)區(qū)域的富集較少[38],具有更多的選擇性剪接位點(diǎn)以及非規(guī)范反向剪接位點(diǎn)[39],在不同物種之間的保守性較低[40]。circRNA 作為ceRNAs,在miRNA 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。如在擬南芥中,circRNAs 可能通過螯合影響與過氧化氫、植物激素和熱應(yīng)激有關(guān)基因的表達(dá)[41];在番茄中,circRNA45和circRNA47可能通過調(diào)節(jié)miRNA-mRNA 表達(dá)水平,在番茄抗性中起正調(diào)節(jié)作用,最終增強(qiáng)植物抗性[42]。但是circRNA 的研究主要集中在人類和動(dòng)物疾病中[43],而在植物中circRNA 的研究相對(duì)較少,大量circRNA 及其功能需要進(jìn)一步挖掘。
PhcircRNA1調(diào)控的miR156 是調(diào)控植物開花的重要因子[44],4 個(gè)靶基因中PH02Gene31266(UBC28)、PH02Gene28384(CNGC8)和PH02Gene33036(VIL1)均與植物開花相關(guān)[45-47],其中UBC28是泛素結(jié)合酶基因,可以編碼一種新的RING finger 蛋白,在泛素蛋白酶體系統(tǒng)中參與了蛋白質(zhì)降解的調(diào)控,影響煙草的生長(zhǎng)發(fā)育[48]。在擬南芥中,UBC突變體在長(zhǎng)日照和短日照條件下均表現(xiàn)出早花表型[45]。CNGC8是環(huán)狀核苷酸化通道,有研究報(bào)道花粉管特異性環(huán)狀核苷酸化通道(CNGC8)與鈣調(diào)蛋白2 共同構(gòu)成一個(gè)分子開關(guān),該開關(guān)可根據(jù)細(xì)胞鈣水平控制鈣通道的開啟或關(guān)閉,從而控制開花植物的花粉管生長(zhǎng)[46]。VIL1是春化相關(guān)基因,短日照時(shí)通過染色質(zhì)修飾可以抑制FLOWER LOUS M(FLM),從而促進(jìn)擬南芥開花[47]。GLR3.1在水稻中可以編碼一種典型的谷氨酸受體樣蛋白,與根頂端分生組織(root apical meristem,RAM)中的細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活有關(guān),在水稻中GLR3.1的缺失會(huì)抑制根尖的伸長(zhǎng)[49]。本研究結(jié)果表明,在紫外線脅迫和高溫脅迫下,PhcircRNA1-Ph-miR156-mRNA 在毛竹中均有差異表達(dá),且PhcircRNA1與4 個(gè)靶基因表達(dá)趨勢(shì)一致,與Ph-miR156 表達(dá)趨勢(shì)相反。在高溫脅迫下,PhmiR156 表達(dá)量上升,與在擬南芥中的研究結(jié)果一致[50-51]。4個(gè)靶基因的qRT-PCR結(jié)果與全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相同,在高溫脅迫與紫外脅迫下表達(dá)量都呈現(xiàn)下降趨勢(shì),說明PhcircRNA1可能通過調(diào)控Ph-miR156 來調(diào)控靶基因的表達(dá),參與毛竹的開花和生長(zhǎng)發(fā)育。本研究展示了PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA 調(diào)控通路,后期將通過雙熒光素酶試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的準(zhǔn)確性。
已有研究表明,毛竹根生長(zhǎng)速率在15 d 時(shí)最快,30 d 變緩慢直至35 d 時(shí)趨于停滯[33]。本研究調(diào)查了PhcircRNA1在不同生長(zhǎng)速率毛竹根尖的表達(dá)模式,結(jié)果表明PhcircRNA1和GLR3.1表達(dá)趨勢(shì)一致,與PhmiR156 表達(dá)趨勢(shì)相反。毛竹生長(zhǎng)至15 d 時(shí),PhmiR156 表達(dá)量最高,毛竹根長(zhǎng)生長(zhǎng)速率最高,說明PhcircRNA1通過Ph-miR156調(diào)控GLR3.1的表達(dá),可能影響毛竹根的生長(zhǎng)發(fā)育。但是PhcircRNA1如何通過調(diào)節(jié)Ph-miR156從而影響靶基因表達(dá)的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。
本研究鑒定了1 個(gè)參與毛竹高溫脅迫和紫外脅迫的非編碼調(diào)控RNA-PhcircRNA1,構(gòu)建了PhcircRNA1-Ph-miR156-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò),推測(cè)PhcircRNA1可能作為Ph-miR156 海綿,調(diào)控GLR3.1的表達(dá),在毛竹根尖的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。