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    水稻光溫敏不育系gy157S的葉色表型鑒定與候選基因分析

    2023-03-09 09:47:52陳能剛張宏偉郝留根王珍珍易崇粉韓麗珍楊占烈
    核農(nóng)學(xué)報(bào) 2023年4期
    關(guān)鍵詞:葉色葉綠體突變體

    謝 英 陳能剛 張宏偉 郝留根 王珍珍 易崇粉 韓麗珍 楊占烈,*

    (1貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院,山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550025;2貴州省農(nóng)作物品種資源研究所,貴州 貴陽 550006;3貴州省水稻研究所,貴州 貴陽 550006)

    水稻(Oryza sativaL.)雜交種純度是雜交水稻生產(chǎn)的重點(diǎn)[1]。帶葉色標(biāo)記性狀的植株具有明顯的顏色表型,很容易被識別并去除,較分子標(biāo)記輔助育種成本低、效率高。因此,可將具有良好農(nóng)藝性狀的黃化、白條紋、白化轉(zhuǎn)綠等表型的葉色突變體作為改良材料,把葉色標(biāo)記性狀運(yùn)用到水稻雜交育種當(dāng)中,以提高雜交水稻種子純度[2-3]。此外,水稻葉色突變體是研究水稻光合作用、葉綠素合成與降解及其生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制的重要材料[4]。發(fā)掘更多的水稻葉色突變體,并開展相關(guān)基因克隆和功能分析,有助于闡明水稻葉色變異和光合作用的分子機(jī)制。迄今為止,被克隆的水稻葉色基因已經(jīng)超過120個,其中大部分是隱性核基因,有小部分是顯性核基因或細(xì)胞質(zhì)基因[5-6]。這些基因突變分別導(dǎo)致水稻葉色呈現(xiàn)出黃化、白化、持綠、條紋、斑馬、紫色、黃化轉(zhuǎn)綠、白化轉(zhuǎn)綠等表型,并且大多數(shù)突變體伴隨著葉綠素含量減少、葉綠體發(fā)育異常[7]。由于這些變化與葉綠素合成[8-9]與降解[10]、類胡蘿卜素合成[11]、葉綠體結(jié)構(gòu)與功能[12]、葉綠體發(fā)育[13]、光合作用與光形態(tài)發(fā)生[14]、細(xì)胞程序性死亡[15]等生物學(xué)過程密切相關(guān),導(dǎo)致許多葉色突變體光合速率下降,甚至嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和存活率[16]。然而,隨著生物技術(shù)的發(fā)展和葉色變異研究的深入,部分葉色突變體具有較高光合效率和較強(qiáng)的耐受光抑制能力,從而使水稻產(chǎn)量提高,如突變體ygl1[17]。也有一些葉色基因在粳稻或秈稻的不同遺傳背景下,葉片的顏色有所不同[18]或?qū)λ井a(chǎn)量和光合作用發(fā)揮著截然不同的作用[19]。前人研究發(fā)現(xiàn),在水稻中一些葉色基因與抗病性有關(guān),對水稻分子育種有很大應(yīng)用價(jià)值,如在易感紋枯病粳稻品種9522中,抑制OsNYC3基因的表達(dá)能大幅增加該品種對紋枯病的抗病性,并且對水稻產(chǎn)量和主要的農(nóng)藝性狀基本沒有影響[20];而水稻黃葉突變體lc7基因編碼鐵氧還蛋白依賴性谷氨酸合酶1 不僅可以調(diào)節(jié)氮同化和葉綠體發(fā)育,還在廣譜白葉枯病抗性中發(fā)揮重要作用[21]。此外,滯綠突變體由于整個生長周期葉片表型都為綠色,葉綠素含量增高,可以作為優(yōu)質(zhì)的稻草提供給畜牧業(yè)[22]。水稻葉色變化和光合作用的調(diào)控機(jī)制極其復(fù)雜,雖然近年來鑒定與克隆得到許多水稻葉色變異的基因,但仍然需要鑒定更多的涉及葉色突變和光合作用的功能基因[6]。除此之外,將葉色突變體應(yīng)用到雜交水稻生產(chǎn)當(dāng)中的難度仍較大。因此,本研究將由自然突變獲得的黃綠葉突變性狀導(dǎo)入水稻兩系不育系中,創(chuàng)制出攜帶黃綠葉標(biāo)記新的兩系不育系gy157S,結(jié)合葉色表型觀察和葉綠素含量測定、透射電鏡觀察、遺傳分析、基因定位和候選基因遴選、DNA 測序驗(yàn)證、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRTPCR)分析等研究,以期為探明目標(biāo)基因?qū)λ救~色的調(diào)控機(jī)制和生產(chǎn)應(yīng)用潛力提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    水稻黃綠葉光溫敏不育系gy157S(系譜來源:C815S///C815S/黃綠葉突變體//紫2B,貴州省農(nóng)作物品種資源研究所),是由黃綠葉自然突變體(軟紅米/粵泰B//品資5B/中9B 的F3代群體中發(fā)現(xiàn)的黃綠葉自然突變株)與C815S(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué))雜交獲得的F1代,然后與秈稻紫2B(貴州省水稻研究所)雜交獲得復(fù)交F1代,從中選擇黃綠葉單株與光溫敏不育系C815S 雜交,再經(jīng)多年多代系統(tǒng)選育而成。本研究以gy157S來源親本之一的光溫敏不育系C815S 作為試驗(yàn)對照材料(近似品種);秈稻R1638(貴州省農(nóng)作物品種資源研究所)為定位群體的親本。

    1.2 苗期葉色表型觀察

    將gy157S與親本C815S種子在35 ℃條件下催芽3 d后,將發(fā)芽的種子分別播種于20和30 ℃的光照培養(yǎng)箱(12 h 光照/12 h 黑暗)中培育,每隔48 h 觀察1 次幼苗的生長情況,記錄葉片的表型變化。

    1.3 葉片光合色素含量的測定

    分別選取20 和30 ℃條件下生長20 d 的親本C815S和gy157S的全展葉,洗凈用濾紙晾干,然后稱取剪去中脈的新鮮葉片約0.2 g,剪碎放入10 mL 的離心管中,加入無水乙醇后放置于4 ℃冰箱中黑暗下浸提48 h,在浸提期間多次手動搖晃,以保證溶劑和葉片的充分接觸,直至葉片由綠色變?yōu)榘咨?。將浸泡后的提取液移?5 mL 容量瓶中,以無水乙醇定容以及調(diào)零。使用722N型分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)測量665、649 和470 nm 下的吸光值,重復(fù)測定3 次。然后參考Lichtenthaler[23]的方法,計(jì)算單位質(zhì)量葉綠素a(chlorophyll a,Chl a),葉綠素b(chlorophyll b,Chl b)和類胡蘿卜素(carotenoid,Caro)含量。

    1.4 葉片葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

    葉片取樣方法與1.3 相同,然后將葉片沿葉脈方向剪成面積約1 mm2的正方形,盡量減小牽拉、挫傷與擠壓等機(jī)械損傷,參照張?zhí)煊甑龋?4]的方法進(jìn)行制片染色,在hitachi HT7700 透射電子顯微鏡(日立高新技術(shù)公司,日本)下觀察并采集圖像。

    1.5 遺傳分析與群體構(gòu)建

    利用gy157S 與R1638 進(jìn)行正反雜交,按常規(guī)種植加代收獲的F1代和F2代種子,作為遺傳研究和基因定位的群體。

    1.6 DNA的提取和PCR擴(kuò)增

    水稻新鮮葉片DNA 使用十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)法提取,分別提取C815S、gy157S、gy157S與R1638雜交F2綠葉混池和黃綠葉混池及F2黃綠葉群體的DAN 用于基因定位。PCR 體系共10 μL:Taq酶5 μL、DNA 模板1 μL、ddH2O 2 μL、上下游引物各1 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,55~60 ℃(退火溫度根據(jù)引物差異稍有改動)退火30 s,72 ℃ 延伸45 s,30 個循環(huán);72 ℃終延伸2 min,此反應(yīng)產(chǎn)物用于分子標(biāo)記定位。

    1.7 DNA文庫構(gòu)建、測序和數(shù)據(jù)處理及分析

    采用高通量測序技術(shù)與集團(tuán)分離分析法相結(jié)合(bulked segregant analysis sequencing,BSA-seq)的方法,分別從gy157S/R1638的F2群體中選取30 株葉片為正常綠色的單株和30 株葉片呈現(xiàn)黃綠葉的單株提取總DNA,分別等量混合成正常綠葉基因池和黃綠葉突變基因池,gy157S 和R1638 分別取10 株提取總DNA,待檢驗(yàn)合格后送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行測序。以秈稻品種R498的基因組序列為參考基因組,對所有混池進(jìn)行二代測序,親本池測序深度為10×,混池的測序深度為20×。參照Takagi等[25]和程鳳等[26]的方法,計(jì)算出兩個子代樣本的相對于參考基因組的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)頻率(SNP-index)和插入缺失(insertion/deletion,InDel)頻率,計(jì)算兩個極端混池樣本之間的ΔSNP-index 和ΔInDel-index:

    ΔSNP-index=SNP-index(黃綠葉混池,yellow-green leaf mixing pool,YP)-SNPindex(綠葉混池,green leaf mixing pool,GP)

    ΔInDel-index=InDel-index(黃綠葉混池,YP)-InDelindex(綠葉混池,GP)

    選取95%和99%置信水平作為篩選的閾值,統(tǒng)計(jì)閾值內(nèi)SNP 位點(diǎn)的ΔSNP-index 和ΔInDel-index 平均值繪制染色體分布圖。

    1.8 基因定位

    為了進(jìn)一步驗(yàn)證BSA-seq分析結(jié)果和縮小候選區(qū)間范圍,利用秈稻9311 和粳稻日本晴基因組間的差異,選上述染色體區(qū)段上均勻分布的簡單重要序列(simple sequence repeats,SSR)標(biāo)記,由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。對親本R1638 和gy157S 進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選,篩選到的多態(tài)性標(biāo)記用于連鎖分析,找到兩個池間有多態(tài)的標(biāo)記,用于基因定位,初步確定突變基因的位置。所用SSR 標(biāo)記序列下載至Gramene數(shù)據(jù)庫(http://www.gramene.org)(表1)。

    表1 與目標(biāo)基因連鎖的SSR引物序列Table 1 SSR primer sequences linked to the target gene

    1.9 總RNA 提取與qRT-PCR

    選取20 ℃條件下生長20 d的親本C815S和gy157S幼苗葉片相同部位提取總RNA,對候選相關(guān)基因、光合色素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行qRT-PCR 分析。候選基因分別為OsR498G0306815500.01、OsR498G03 06965500.01、OsR498G0306729500.01、OsR498G03069 57400.01。葉綠素合成基因分別為CHLH、OsPORA、YGL1、GSA-AT、HEMA1、OsCAO2、OsYLC2、OsDVR、OsCHLM。總RNA 的提取和qRT-PCR 分析參照鄢小青等[27]的方法,所有qRT-PCR 引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成(表2)。

    表2 qRT-PCR引物序列Table 2 qRT-PCR primer sequences

    2 結(jié)果與分析

    2.1 黃綠葉光溫敏核不育系gy157S 在不同溫度下苗期表型觀察與光合色素含量變化

    為了探討gy157S的黃綠葉表型是否受溫度的影響,本研究以C815S為對照材料開展了不同溫度的處理試驗(yàn)。結(jié)果顯示,在20和30 ℃處理?xiàng)l件下,播種后20 d,對照材料C815S的幼苗均呈現(xiàn)正常綠葉表型(圖1-A、B);gy157S在20 ℃條件下,幼苗葉色呈現(xiàn)出黃綠表型(圖1-A),而在30 ℃條件下,呈現(xiàn)出淡綠色表型(圖1-B)。在不同溫度下測定C815S 和gy157S 光合色素含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在20 ℃條件下,gy157S植株葉片的總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均較對照C815S極顯著下降(圖1-C),分別降低54.7%、26.34%、76.49%、23.69%;在30 ℃條件下,gy157S 葉片的總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量也均較C815S 極顯著下降(圖1-D),分別降低37.85%、33.07%、55.65%、19.59%。上述結(jié)果表明,gy157S 的黃綠葉表型與葉片光合色素含量變化有關(guān),且受溫度的影響。

    圖1 不同溫度下C815S和gy157S幼苗表型及光合色素含量Fig.1 Phenotype and photosynthetic pigment content of the C815S and gy157S seedings under different temperature conditions

    2.2 黃綠葉光溫敏核不育系gy157S 葉綠體顯微結(jié)構(gòu)觀察

    為了檢測在不同溫度條件(20和30 ℃)下gy157S葉綠體的發(fā)育情況,采用透射電子顯微鏡觀察在不同溫度條件下生長20 d的gy157S和C815S秧苗葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示,在不同溫度條件下對照C815S 的葉肉細(xì)胞中葉綠體含量豐富,形態(tài)也比較飽滿(圖2-A、E),類囊體和基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)完整,且規(guī)則排列(圖2-C、G)。而gy157S在20 ℃條件下,部分葉肉細(xì)胞的葉綠體發(fā)育畸形,有部分沒有葉綠體,淀粉顆粒與同等條件下C815S相比,gy157S的數(shù)量更多、體積更?。▓D2-C、D),并且類囊體和基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)錯綜復(fù)雜地堆疊甚至缺失(圖2-D);30 ℃條件下,仍有少部分葉綠體發(fā)育異常,但大部分與C815S 相比無明顯差異(圖2-F、H)。結(jié)果表明,gy157S 的葉綠體發(fā)育在一定程度上受溫度的影響。

    圖2 不同溫度下C815S和gy157S葉綠體超微結(jié)構(gòu)比較Fig.2 Comparison of chloroplast ultrastructure between C815S and gy157S under different temperature conditions

    2.3 gy157S黃綠葉標(biāo)記性狀的遺傳分析

    為了分析gy157S黃綠葉表型的遺傳特性,將gy157S與R1638進(jìn)行正反交,所得F1植株均表現(xiàn)為正常葉色。在正反交F2群體中葉色發(fā)生了明顯的分離,分別對兩個F2代分離群體進(jìn)行調(diào)查,經(jīng)卡方(χ2)測驗(yàn),發(fā)現(xiàn)正常葉色和黃綠色植株的分離比例均符合3.84)(表3),表明兩系不育系gy157S 黃綠葉性狀受1對隱性核基因控制,將該基因暫命名為gy157S(t)。

    表3 gy157S的遺傳分析Table 3 Genetic analysis of gy157S

    2.4 BSA重測序分析與基因定位

    2.4.1 BSA 重測序分析 通過重測序共獲得原始數(shù)據(jù)38.056 G,過濾后為37.658 G,各樣本測序質(zhì)量高(Q20≥95.88%、Q30≥89.83),GC 含量占比在43.63%~44.14%之間。綜上,所有樣本的數(shù)據(jù)量足夠,測序質(zhì)量合格,GC分布正常,符合建庫測序要求(表4)。

    表4 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況匯總Table 4 Summary of sequencing data quality

    基于基因分型的結(jié)果,篩選兩個親本間純合差異的SNP和InDel標(biāo)記,共挑選出569 146個SNP和167 026個InDel位點(diǎn)。分析計(jì)算兩個子代在親本SNP 和InDel 標(biāo)記位點(diǎn)的△SNP-index 和△InDel-index。分別將△SNP-index和△InDel-index 結(jié)果進(jìn)行1 000 次置換檢驗(yàn),選取95%置信水平作為篩選的閾值(圖3-A、B)。為直觀反映子代SNP-index 和InDel-index 合并后的All-index 在染色體上的分布情況,對All-index 在染色體上的分布進(jìn)行作圖,計(jì)算△All-index。進(jìn)行1 000次置換檢驗(yàn),選取95%置信水平作為篩選的閾值(圖3-C)。結(jié)果顯示,以1 Mb為窗口,95%置信水平下在3 號染色體定位出17 個符合的區(qū)域,主要集中在4 780 001~5 868 000、26 606 001~30 593 000 和31 378 001~32 445 000 位置,總長分別為1.09、3.99 和1.07 Mb 的候選區(qū)域內(nèi),候選區(qū)間初步估計(jì)為Chr3:4.78~11.9 Mb和Chr3:26.61~32.45 Mb;以1 Mb為窗口,99%置信水平下在3 號染色體定位出7 個符合的區(qū)域,主要集中在26 779 001~30 376 000 bp之間,長度為3.60 Mb,候選區(qū)域初步估計(jì)為Chr3:6.92~11.43 Mb 和Chr3:26.76~31.15 Mb(表5)。

    表5 gy157S/R1638 F2群體ΔAll-index候選區(qū)域Table 5 Candidate regions of gy157S/R1638 F2 population with ΔAll-index/bp

    圖3 兩個混池之間的差異分布和SSR分子定位Fig.3 Difference distribution between two pools and SSR molecular localization

    2.4.2 gy157S 黃綠葉標(biāo)記基因的定位 利用親本gy157S 和R1638 間的差異,篩選出多態(tài)性好的SSR 引物,然后利用定位群體中的10個正常單株混池和10個黃綠葉單株混池進(jìn)行遺傳連鎖分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),黃綠葉表型與第3號染色體上的SSR標(biāo)記RM15824和RM15848連鎖。同時(shí)對附近的SSR 引物進(jìn)行多態(tài)性篩選,獲得多態(tài)性標(biāo)記RM15678、RM15824、RM15848及RM16200。分別對192個F2黃綠葉單株進(jìn)行分析,初步將黃綠葉基因gy157S(t)定位于分子標(biāo)記RM15678 與RM15824 之間,遺傳距離分別為13.2和4.7 cM,該區(qū)間約為2.4 Mb(圖3-D),且位于BSA-Seq 置信度為95%候選區(qū)域Chr3:26.61~32.45內(nèi)。

    2.4.3 黃綠葉基因gy157S(t)的候選基因預(yù)測 對于質(zhì)量性狀的BSA 分析,在候選區(qū)間內(nèi)All-index 為1 且造成基因功能改變的移碼突變、提前終止或者非同義突變極有可能是引起表型變異的位點(diǎn),可將其作為候選基因篩選的重點(diǎn)。根據(jù)分子育種信息庫(http://mbkbase.org)的基因注釋信息和BSA分析結(jié)果,第3號染色體26.61~32.45 Mb 區(qū)間All-index 為1,且造成基因功能變異位點(diǎn)有4 個,分別位于基因OsR498G03067 29500.01、OsR498G0306815500.01、OsR498G0306957400.01和OsR498G0306965500.01,因此將這4 個基因作為候選基因篩選的重點(diǎn)。OsR498G0306729500.01編碼胰蛋白酶半胱氨酸/絲氨酸肽酶結(jié)構(gòu)域,外顯子區(qū)域存在一個堿基缺失;OsR498G0306815500.01編碼鐵氧還蛋白OsFdC2,其外顯子上存在1 個非同義突變;OsR498G0306957400.01編碼腺苷酸環(huán)化酶蛋白,其外顯子區(qū)域發(fā)生了非同義突變,OsR498G0306965500.01編碼三磷酸肌苷焦磷酸酶,其3'UTR 存在一個堿基缺失(表6)。采用qRT-PCR 技術(shù)對gy157S 和C815S中OsR498G0306729500.01、OsR498G0306815500.01、OsR498G0306965500.01和OsR498G0306957400.01表達(dá)量進(jìn)行分析(圖4)。結(jié)果顯示,與C815S 相比,OsR498G0306815500.01的表達(dá)量極顯著增加,OsR498G0306729500.01和OsR498G0306965500.01的表達(dá)量極顯著下降,OsR498G0306957400.01的表達(dá)量顯著下降。利用在線工具h(yuǎn)ttps://www.genscript.com/蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測,顯示OsR498G0306815500.01、OsR498G0306957400.01和OsR498G0306965500.01定位于葉綠體,OsR498G0306729500.01位于細(xì)胞質(zhì)(表7)。以上分析結(jié)果表明,4個預(yù)測基因均有可能是本研究黃綠葉突變體的候選基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),以上4 個候選基因中,只有OsR498G0306815500.01位于候選區(qū)間RM15678和RM15824內(nèi),因此推測該基因可能為候選基因。進(jìn)一步對OsR498G0306815500.01測序結(jié)果顯示,該基因第7個外顯子上第2 594 bp位由T突變?yōu)镚,導(dǎo)致酪氨酸(Y)突變?yōu)樘於彼幔―)。

    表6 突變位點(diǎn)All-index信息Table 6 All-index information of mutation sites

    圖4 20 ℃條件下C815S及gy157S葉片中候選基因的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of candidate genes in C815S and gy157S leaves at 20 ℃

    表7 候選基因蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測Table 7 Candidate gene protein subcellular localization prediction

    2.5 葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)分析

    由于gy157S植株葉綠素含量較對照C815S顯著下降,低溫下葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重,推測gy157S中葉綠素合成相關(guān)基因可能會受到影響。qRT-PCR 定量分析結(jié)果顯示,在20 ℃條件下,與對照材料C815S 相比,葉綠素生物合成相關(guān)葉綠素合酶基因(YGL1)、谷氨酰-1-半醛氨基酸轉(zhuǎn)移酶基因(GSA-AT)、尿卟啉原Ⅲ脫羧酶基因(HEMA1)、亞鐵血紅素加氧酶基因(OsYLC2)、鎂原卟啉甲基轉(zhuǎn)移酶基因(OsCHLM)表達(dá)量呈顯著或極顯著上調(diào),而原葉綠素酸酯氧化還原酶A 基因(OsPORA)表達(dá)量顯著下降,其余幾個葉綠素合成基因鎂離子螯合酶基因(CHLH)、葉綠素酸酯a氧化酶基因(OsCAO2)、聯(lián)乙烯還原酶基因(OsDVR)表達(dá)量無顯著變化(圖5)。

    圖5 20 ℃條件下C815S及gy157S葉片中葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of chlorophyll synthesis related genes in C815S and gy157S leaves at 20 ℃

    3 討論

    葉綠素的合成和葉綠體的發(fā)育在植物光合作用中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在水稻葉色突變中,葉綠素合成和葉綠體發(fā)育相關(guān)基因變異往往會導(dǎo)致葉色發(fā)生改變。目前已克隆的參與葉綠素合成途徑的葉色基因有OsHemA[28]、CHLH[29]、YGL2[30]、CHLD[31]、OsCAO1[32]、OsDVR[33]、CHLI[34]、FGL[35]、OsCAO2[36]和OsYLC2[37]等;調(diào)控葉綠體發(fā)育的基因有GRA78[38]、WGL2[39]、WSL6[40]、Z15[41]和RA1[42]等。葉色突變體的表型通常與光合色素含量相關(guān),如ygl80[43]、ys53[44]、ygl11(t)[45]在整個生育期都呈現(xiàn)黃化表型,突變體的光合色素含量均比野生型低,本研究中g(shù)y157S的表型變化受光合色素含量影響,在20 ℃條件下表現(xiàn)出黃綠葉表型,在高溫30 ℃條件下表現(xiàn)出淡綠葉表型;在不同溫度條件下葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量均極顯著低于對照C815S。葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的主要場所,很多水稻葉色突變體葉綠體發(fā)育異常,與類囊體結(jié)構(gòu)和基粒結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變有關(guān)。如突變體ys53葉綠體沒有完整的類囊體和基粒結(jié)構(gòu),表現(xiàn)出明顯的空泡化[44];ye1類囊體層狀數(shù)量減少、排列不良[46]。本研究中,與C815S相比,gy157S 類囊體和基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)錯綜復(fù)雜地堆疊(圖2-D),導(dǎo)致葉綠體發(fā)育受到抑制。在水稻中存在一類溫敏型葉色突變體,不同溫度條件下,該類突變體的葉片顏色和葉綠體發(fā)育狀態(tài)不同,可以利用它們研究水稻的葉綠素合成,葉綠體發(fā)育,以及對光溫響應(yīng)的分子機(jī)制等。如tcm5突變體的葉片在28 ℃時(shí)為黃綠葉表型,葉綠素含量較野生型顯著降低,而在20 ℃時(shí)葉片顏色和葉綠素含量與野生型無明顯差異[47];ygl4在20 ℃條件下比25和30 ℃條件下黃化表型加重且光合色素含量更低[48]。本研究中,gy157S在20 ℃條件下,部分葉肉細(xì)胞的葉綠體發(fā)育畸形,甚至缺失,淀粉顆粒與對照C815S相比數(shù)量更多、體積更小(圖2-C、D),并且類囊體和基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)錯綜復(fù)雜地堆疊甚至缺失(圖2-D)。在30 ℃條件下,仍有少部分葉綠體發(fā)育異常,但大部分與C815S 相比無明顯差異(圖2-F、H),與葉色變化相一致。因此,推測gy157S 的黃綠葉表型不僅受溫度調(diào)控,還可能影響葉綠體發(fā)育和光合色素的合成。

    水稻葉色基因的克隆和功能研究有助于闡明葉色調(diào)控的分子機(jī)制[49]。本研究利用gy157S 與R1638 進(jìn)行正反雜交構(gòu)建F2群體,遺傳分析結(jié)果表明,gy157S黃綠葉性狀受1 對隱性核基因控制(表3)。從F2群體中選擇黃綠葉植株和綠葉植株構(gòu)建極端表型的DNA 混池,采用BSA分析發(fā)現(xiàn),在第3號染色體短臂和長臂上各存在1個明顯的ΔSNP指數(shù)曲線的峰(圖3),這兩個區(qū)間可能存在控制gy157S 黃綠葉表型的候選基因。而短臂上的測序覆蓋度不高,該區(qū)間的峰可能是測序覆蓋度低引起的假陽性。因此,根據(jù)BSA 分析的95%置信度區(qū)間,將第3 染色體長臂26.61~32.45 Mb 作為候選基因的重點(diǎn)區(qū)間。采用連鎖分析,進(jìn)一步對目標(biāo)基因進(jìn)行驗(yàn)證并將其定位于標(biāo)記RM15678 與RM15824 之間。該區(qū)間內(nèi)只有基因OsR498G0306815500.01的SNP指數(shù)為1,且造成基因編碼氨基酸的變異。候選基因雙親測序結(jié)果顯示,OsR498G0306815500.01的第7 外顯子上的2 594 bp 處堿基T 突變?yōu)镚,導(dǎo)致酪氨酸(Y)突變?yōu)樘於彼幔―)。qRT-PCR 結(jié)果表明,gy157S 中OsR498G0306815500.01的表達(dá)量相比C815S 極顯著上調(diào)(圖4)。因此,推測OsR498G0306815500.01可能是導(dǎo)致黃綠葉兩系不育系gy157S 葉色變化的候選基因。OsR498G0306815500.01編碼鐵氧還蛋白(ferredoxin,F(xiàn)d)的一種Fd-like 蛋白(FdC)OsFdC2。前人研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)dC 能夠與需氧環(huán)化酶結(jié)合參與葉綠素的合成[50],與psbA 轉(zhuǎn)錄[51]以及對青枯菌菌株抗病性[52]等功能有關(guān),到目前為止,F(xiàn)dC蛋白在高等植物中的研究較少,其功能仍有待研究。

    水稻中OsFdC2已被克隆,該基因與擬南芥FdC2基因(AT1G32550)有較高相似性[53]。研究表明,OsFdC2可以將光合電子從PSI 傳輸?shù)狡渌鸉d 依賴性代謝途徑參與光合電子傳遞和碳同化[54]。水稻突變體501ys中OsFdC2編碼區(qū)第1 447 位(cDNA 的314 位)堿基由C替換為T,導(dǎo)致其DNA序列發(fā)生錯義突變。與野生型的葉色相比,501ys在整個生育期都表現(xiàn)為黃綠葉,并且葉綠素含量減少,與野生型相比,501ys突變體中的葉綠體更膨脹,葉綠體中顆粒堆減少,且嗜鋨顆粒顯著增多[53]。ygl18編碼OsFdC2的基因LOC_Os03g48 040的5'UTR 發(fā)生突變,與野生型相比,黃綠葉突變體ygl18自三葉期起葉片開始變黃,同時(shí)伴隨著光合速率與葉綠素含量下降[55]。突變體hdy1編碼OsFdC2的基因LOC_Os03g48040剪接位點(diǎn)單堿基突變(G→A)導(dǎo)致移碼突變,與野生型相比,hdy1表現(xiàn)為抽穗期延遲和黃葉表型,葉肉細(xì)胞中葉綠體的數(shù)量沒有明顯差異,但類囊體片層結(jié)構(gòu)異常且含有更少的基質(zhì)片層[56]。本研究的gy157S 是通過雜交選育的方式,將自然變異的黃綠葉突變性狀導(dǎo)入水稻兩系不育系中創(chuàng)制出新的攜帶黃綠葉性狀兩系不育系。與501ys,gyl18,hdy1不同,gy157S是基因OsFdC2第7外顯子上的2 594 bp處發(fā)生單堿基突變,導(dǎo)致編碼氨基酸發(fā)生改變,在大田種植整個生育期都為黃綠色,與501ys表型相似。然而,gy157S在20 ℃條件下表現(xiàn)出黃綠葉表型,葉綠體發(fā)育嚴(yán)重受阻,在高溫30 ℃條件下表現(xiàn)出淡綠葉表型,葉綠體發(fā)育大部分恢復(fù)正常,這與OsFdC2相關(guān)的其他突變體表型存在差異。綜上,推測gy157S(t)對葉綠體發(fā)育和葉色的調(diào)控可能受溫度影響。

    下一步將通過基因編輯和功能互補(bǔ)確認(rèn)gy157S(t)的候選基因,并探索在水稻生長發(fā)育途徑中的作用,為闡明gy157S(t)基因?qū)θ~綠體發(fā)育和葉綠素合成的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    4 結(jié)論

    光溫敏核不育系gy157S的黃綠葉表型受溫度的影響,在20 ℃條件下,呈現(xiàn)黃綠葉表型,葉片中光合色素含量極顯著降低,葉綠體發(fā)育缺陷。在30 ℃條件下,gy157S幼苗呈現(xiàn)淡綠葉表型,葉片光合色素含量呈現(xiàn)極顯著降低,但葉綠體發(fā)育大部分恢復(fù)正常。gy157S的黃綠葉表型由1 對隱性核基因控制,BSA 分析和連鎖分析結(jié)果將其定位于第3號染色體標(biāo)記RM15678和RM15824之間,候選區(qū)間的基因功能分析、雙親測序和qRT-PCR結(jié)果表明,OsFdC2可能是gy157S 黃綠葉表型的候選基因。

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