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    3D 打印磷酸鈣涂層多孔鎂金屬支架的力學(xué)性能和生物相容性評估

    2023-06-14 09:39:34葉健廷繆鉑尊熊英杰孟昊業(yè)單驗博孫小涵盧雨征武艷斌林萬程關(guān)聰聰劉修志許文靜袁廣銀周成福
    關(guān)鍵詞:金屬支架力學(xué)力學(xué)性能

    葉健廷,繆鉑尊,熊英杰,孟昊業(yè),單驗博,孫小涵,盧雨征,4,武艷斌,林萬程,4,關(guān)聰聰,劉修志,王 鑫,許文靜,袁廣銀,彭 江,周成福

    1 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科,黑龍江佳木斯 154000;2 解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心骨科醫(yī)學(xué)部研究所,北京 100853;3 上海交通大學(xué)輕合金精密成型國家工程研究中心,上海 200240;4 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院骨科,北京 100038

    外傷、感染、人工關(guān)節(jié)失用等原因所致負(fù)重部位骨松質(zhì)缺損的治療是骨科面臨的一大挑戰(zhàn)[1]。負(fù)重部位骨松質(zhì)的修復(fù)強調(diào)整體化置入,置入材料必須保證力學(xué)結(jié)構(gòu)的完整性,同時與周圍骨床盡快實現(xiàn)整合,便于傳遞載荷。多孔鈦、鉭等金屬置入是目前有效的解決方法,但存在不可降解性、應(yīng)力遮擋等缺點。生物陶瓷類材料因具有較好的生物相容性,受到科學(xué)家的青睞,但脆性等缺點限制了其在臨床中推廣[2-3]。不銹鋼、金屬坦棒、鈦金屬等臨床常用金屬能為骨松質(zhì)缺損區(qū)提供足夠的力學(xué)支撐,其不可降解性及高彈性模數(shù)等缺陷極易引發(fā)應(yīng)力屏蔽和二次骨折,且上述金屬缺乏生物活性,無法與周圍組織實現(xiàn)快速整合[4]。生物可降解鎂金屬具有良好的生物相容性、優(yōu)異的力學(xué)性能、生物可降解性,降解產(chǎn)物鎂離子又是人體內(nèi)必須元素之一,這使其逐漸走向前臺[5-7]。但金屬鎂存在過快降解和大量產(chǎn)氣等缺點。人們逐漸意識到鎂金屬表面添加涂層的重要性[8]。將鎂金屬與各種生物活性涂層結(jié)合可克服局部嚴(yán)重產(chǎn)氣這一缺點?;诒狙芯克捌谘芯縖9],采用選擇性激光熔化工藝制備多孔鎂金屬支架,通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法在純鎂金屬表面制備生物可降解磷酸鈣涂層;本文側(cè)重探討磷酸鈣涂層多孔鎂金屬支架的力學(xué)性能和生物相容性。

    材料與方法

    1 主要材料、試劑與儀器 鎂粉(威豪,中國);胎牛血清(Gibco,美國);青-鏈霉素雙抗(Gibco 15070063); 胰酶(Gibco 15050065);磷酸鹽緩沖液(CORNING 21-031-CV);α-MEM 培養(yǎng)基(Gibco,美國);CCK-8 試劑盒(碧云天,中國);選擇性激光熔化機器(Solution,德國);體視顯微鏡(Nikon DSRi2);酶標(biāo)儀(Biotek,美國);掃描電子顯微鏡(Hitachi,日本)。

    2 多孔鎂金屬支架的制備 利用Rhinoceros 6.0軟件設(shè)計一種零平均曲率的三周期極小曲面結(jié)構(gòu)。調(diào)整支架厚度,支架的孔隙率為75%,平均孔徑為800 μm,支架的表面積/體積比為3.0 mm-1。制備過程中,惰性氣體中氧含量低于1/10 000,使用選擇性激光熔化機器將支架構(gòu)建在鎂基板上。采用氣體霧化法制備球形鎂粉末,并用于激光粉末熔煉。在能量密度為83.3 J/mm3、相鄰層間旋轉(zhuǎn)角度為73°的參數(shù)中打印,然后通過電火花加工將樣品從構(gòu)建板上移回,并在70%乙醇中超聲清洗10 min,以去除未粘連的松散粉末。最后支架在10%高氯酸和90% C2H5OH 組成的電解液中經(jīng)電化學(xué)拋光。

    3 涂層的制備 采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法在多孔鎂金屬表面制備Ca-P 生物活性涂層。首先將60℃的NaOH/Na2CO3溶液1∶1 混合均勻,超聲清洗多孔鎂支架。去離子水和無水乙醇沖洗干凈、晾干。將晾干后的多孔鎂金屬支架浸泡于鈣磷處理溶液中12 h,用去離子水和無水乙醇清洗后晾干,即可獲得有鈣磷涂層的多孔鎂支架。

    4 支架材料的物理表征 利用體視顯微鏡觀察無涂層多孔鎂金屬支架及Ca-P 涂層支架的外觀。通過掃描電子顯微鏡和能量色散X 線能譜(Energydispersive X-ray spectrometry,EDS)觀察磷酸鈣涂層鎂基支架的表面形貌和元素組成。

    5 力學(xué)性能試驗 圓柱多孔鎂金屬支架固定于電子萬能試驗機托盤上,分別在X 軸和Z 軸方向上壓縮。調(diào)整位移速率為1 mm/min。自動記錄載荷-位移曲線,直至位移達到3.0 mm。并繪制出應(yīng)力-應(yīng)變曲線。

    6 制備浸提液 首先用75%乙醇將10 mm ×3 mm 的多孔鎂金屬支架消毒20 min 以上,密封袋封裝,鈷60 消毒。按照GB/T 16886.12-2017 和ISO 10993-12 標(biāo)準(zhǔn),按照樣品表面積與溶液體積比1.25 cm2/mL 將支架浸泡在添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的α-MEM 中,置于培養(yǎng)箱(5% CO2,37℃)中。72 h 后吸出浸提液,4℃保存用于后續(xù)實驗。

    7 細(xì)胞增殖實驗 小鼠來源的胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(MC3T3-E1)購于上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。在所有體外實驗中均采用第4 ~ 6 代MC3T3-E1 細(xì)胞。支架提取物用于細(xì)胞培養(yǎng)。將圓盤樣品(Φ10 × 3 mm)浸入3 mL 含10%胎牛血清的3 mL完全培養(yǎng)基中,100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。然后將MC3T3-E1 以每孔3 × 103/mL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,接種后第1 天細(xì)胞完全貼壁后,將浸提液取代完全培養(yǎng)基。細(xì)胞在37℃、5% CO2中孵育1 d、3 d、5 d 進行細(xì)胞增殖實驗,將完全培養(yǎng)基組設(shè)為空白對照組。CCK-8 試劑盒用于評估每孔培養(yǎng)1.5 h 后的活細(xì)胞數(shù),使用酶標(biāo)儀在450 nm 處測量光密度(OD)值。

    8 細(xì)胞黏附實驗 由于無磷酸鈣涂層鎂金屬降解過程中有明顯氣體產(chǎn)生,表面不適于接種細(xì)胞,因此細(xì)胞黏附實驗僅在磷酸鈣涂層支架進行。將MC3T3-E1 以1 × 104/孔接種于24 孔板無菌支架,培養(yǎng)7 d。接種細(xì)胞的支架用PBS 沖洗,在4.0%甲醛溶液中固定2 h,然后依次在50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液中脫水。CO2臨界點干燥除乙醇后噴金,掃描電鏡觀察。

    9 細(xì)胞活性實驗 用活死染色評估細(xì)胞的活性。活死染色實驗僅在浸提液培養(yǎng)下進行。MC3T3-E1以1 × 104/孔接種于24 孔板,待細(xì)胞貼壁后換支架浸提液培養(yǎng)72 h,將完全培養(yǎng)基組設(shè)為空白對照組,然后用500 μL 的混合染料染色10 min,體視顯微鏡觀察。與鈣黃素-AM 結(jié)合的活細(xì)胞呈綠色,而與乙錠-高二聚體-1 結(jié)合的死亡細(xì)胞呈紅色。

    10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析以及繪圖,計量資料以±s表示,組間比較采用t檢驗或單因素方差分析(Dunnett-t檢驗),P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 支架表面結(jié)構(gòu) 無涂層多孔鎂金屬支架及Ca-P涂層支架均具有高度相互聯(lián)通的大孔(圖1)。無涂層多孔鎂金屬支架呈現(xiàn)三維貫通的開孔結(jié)構(gòu)且孔壁表面較光滑(圖1A),表面僅存在少量氧化層;磷酸鈣涂層支架表面均勻覆蓋了一層結(jié)晶狀涂層(圖1B)。

    圖1 Ca-P 涂層覆蓋前后多孔鎂樣品數(shù)字圖像(6×)A:無涂層支架;B:Ca-P 涂層支架Fig.1 Digital images of porous magnesium samples before and after Ca-P coating (6×)A: Non-coated scaffolds; B: Scaffolds coated with Ca-P

    2 支架的表征 掃描電鏡結(jié)果顯示,無涂層支架表面光滑,呈現(xiàn)出融合體狀,未見散在鎂金屬顆粒(圖2A);Ca-P 涂層支架表面呈現(xiàn)花瓣狀結(jié)構(gòu),均一鋪展在多孔鎂金屬支架表面,且與多孔純鎂基體表面結(jié)合緊密,未觀察到明顯間隙(圖2B)。能量色散X 線能譜分析結(jié)果,無涂層支架主要成分為Mg(圖2C);Ca-P 生物活性涂層的主要成分為C、O、Ca、P元素(圖2D)。

    圖2 支架表面形貌和元素圖譜分析 (5 000×)A、C:無涂層支架及 EDS 能譜分析;B、D:Ca-P 涂層支架及EDS 能譜分析Fig.2 The surface morphologies and the corresponding elemental mapping images of the scaffolds (5 000×)A, C: Non-coated scaffolds and EDS analysis; B, D: Scaffolds coated with Ca-P EDS analysis

    3 支架的力學(xué)性能 兩種支架均具有優(yōu)異的力學(xué)性能(圖3)。Ca-P 涂層支架彈性模量高于無涂層組[(656 ± 8.7) Mpavs(623 ± 7.0) Mpa,P=0.007,n=3](圖3B);壓縮強度高于無涂層支架[(35.3 ±0.7) Mpavs(31 ± 1.0) Mpa,P=0.003,n=3](圖3C)。

    圖3 支架力學(xué)性能A:應(yīng)力-應(yīng)變曲線;B:彈性模量;C:壓縮強度Fig.3 The mechanical properties of the scaffoldsA: Stress-strain curves; B: Elastic modulus; C: Compression modulus

    4 生物相容性 CCK-8 結(jié)果顯示,與空白對照組相比,在第1 天和第3 天,無涂層支架浸提液未表現(xiàn)出顯著毒性(P>0.05),第5 天表現(xiàn)出顯著抑制(P<0.05);而Ca-P 涂層支架浸提液在各時間點對細(xì)胞都有顯著促增殖作用(圖4)。第3 天活死染色結(jié)果顯示,Ca-P 涂層組表現(xiàn)出更多的活細(xì)胞和更少的死細(xì)胞,并且呈現(xiàn)出正常的細(xì)胞形態(tài)(圖5)。涂層支架細(xì)胞黏附結(jié)果顯示,細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)舒展、片狀、絲狀多種形態(tài)與支架表面充分接觸,細(xì)胞在支架表面大量增殖(圖6)。

    圖4 CCK-8 法檢測細(xì)胞在不同支架浸提液中培養(yǎng) 1 d、3 d、5 d 的增殖情況Fig.4 Cell counting kit-8 assay showing cell proliferation after culturing in the extract of different scaffolds for 1,3 and 5 d respectively

    圖5 培養(yǎng)3 d 后 MC3T3-E1 細(xì)胞活力活/死染色(紅色,死亡細(xì)胞;綠色,活細(xì)胞。6×)Fig.5 Live/dead staining of MC3T3-E1 cell viability after 3 days of culture (red, dead cells; green, live cells. 6×)

    圖6 掃描電子顯微鏡觀察 MC3T3E1 細(xì)胞在 Ca-P 涂層支架上的附著情況(500×)Fig.6 Scanning electron microscopy observation of MC3T3-E1 cell attachment on Ca-P coated scaffold (500×)

    討 論

    目前,關(guān)于骨缺損修復(fù)金屬支架的研究進展迅速,主要包括鎂、鋅、銅、鈣、鋁、鈦、鐵等金屬材料的研究,其中鎂金屬材料是目前研究最廣泛、最深入的可降解置入金屬材料之一,其研究成果得到了全世界的認(rèn)可,是目前非常有前途的醫(yī)用金屬材料。鎂離子是人體細(xì)胞內(nèi)僅次于鉀離子的金屬陽離子,參與催化和激活體內(nèi)上百種生化反應(yīng),是人體內(nèi)必不可少的一種金屬離子[5,10-12]。Mg2+可促進骨形成和促血管生成,這使得鎂基生物材料作為骨組織工程生物材料更具可行性[4,13-14]。鎂金屬(41 ~ 45 GPa)擁有與天然骨(3 ~ 20 GPa)相似的彈性模量和密度,能為置入?yún)^(qū)提供可靠且穩(wěn)定的力學(xué)支撐。結(jié)合選擇性激光熔化工藝,利用計算機程序構(gòu)建仿生天然骨結(jié)構(gòu)置入支架。因此,我們采用選擇性激光熔化工藝,設(shè)計并打印出純鎂金屬支架,并通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法在多孔鎂金屬支架表面添加Ca-P 生物活性涂層。

    負(fù)重部位骨松質(zhì)骨缺損支架材料應(yīng)用必須同時具備以下基本特征: (1)具有較好的力學(xué)性能,維持骨修復(fù)過程中力學(xué)完整性,同時傳遞分布載荷[15];(2)良好的生物相容性,與周圍組織實現(xiàn)快速整合[16];(3)具有多孔結(jié)構(gòu),利于新生骨和血管長入[17];(4)相對緩慢的降解速率,與新骨生成相匹配的降解速率和骨誘導(dǎo)是生物支架的重要功能[18]。

    適宜且穩(wěn)定的力學(xué)性能是維持負(fù)重部位骨缺損修復(fù)的重要前提,Wang 等[6]采用模板法制備的鎂合金Mg-Nd-Zn-Zr (JDBM),孔隙率為70.6%其屈服強度為6.87 MPa,彈性模量為0.4 GPa,并擁有很好的成骨成血管效果和適宜的降解速度。然而,JDBM 支架的初始力學(xué)強度稍低于骨松質(zhì),不足以滿足骨松質(zhì)骨缺損區(qū)的初始力學(xué)強度。一些學(xué)者使用低溫沉積技術(shù)制造PT 多孔支架,這種PT 支架呈現(xiàn)出具有適宜降解速率的小梁狀幾何形狀[19-22]。然而,PT 支架[彈性模量=(45.7±5.4) MPa]置入的初始機械性能不足[20]。選擇性激光熔化工藝是目前精確度較高,能準(zhǔn)確還原骨微結(jié)構(gòu)的先進手段,其推動了生物材料學(xué)的快速發(fā)展[23-24]。Lai 等[3]通過3D 打印方法制備了含不同鎂濃度的PLGA/TCP 多孔支架,這種支架具有與天然骨相似的孔隙率和高聯(lián)通性,并且擁有很顯著的成骨成血管效果,但力學(xué)性能仍小于骨松質(zhì),不能為缺損區(qū)提供足夠的初始力學(xué)支撐。Lin 等[14]采用3D 凝膠打印技術(shù)制備出多孔鎂支架,該支架在體內(nèi)外表現(xiàn)出很好的成骨效果,但該支架的屈服強度和彈性模量低于負(fù)重部位骨松質(zhì),表明該支架不能為負(fù)重部位骨松質(zhì)提供有效的力學(xué)支撐。Dimitriou 等[25]通過3D 打印技術(shù)制備的多孔鐵錳合金擁有很好的生物相容性和緩慢的降解速率。這種支架的力學(xué)性能結(jié)果表明,支架力學(xué)強度遠(yuǎn)高于負(fù)重部位骨松質(zhì),過高的力學(xué)強度易導(dǎo)致二次損傷。我們通過3D 打印工藝結(jié)合化學(xué)轉(zhuǎn)化法制備的Ca-P 涂層多孔鎂金屬支架具有很好的力學(xué)性能,其屈服強度(35.3 ± 0.7) MPa,高于天然骨松質(zhì)(12 MPa);Ca-P 涂層多孔鎂金屬支架彈性模量為(656 ± 8.7) MPa,在骨松質(zhì)彈性模量40 ~ 1 400 MPa范圍內(nèi),力學(xué)結(jié)果表明,我們制備的多孔鎂金屬支架的力學(xué)性能與骨松質(zhì)相匹配。

    掃描電鏡觀察顯示,我們所制備的Ca-P 涂層多孔鎂金屬支架的涂層呈現(xiàn)出均一花瓣狀結(jié)構(gòu),無縫隙結(jié)合緊密,這種獨特的結(jié)構(gòu),顯著增加了支架表面積和表面粗糙程度,意味著支架可接受更多細(xì)胞附著(圖6)[26]。Carluccio 等[27]通過微弧氧化方法,在鎂合金表面成功制備出厚約20 μm的涂層,此種方法制備的涂層擁有很好的生物相容性,并能降低鎂合金的降解速度,但該方法制備的涂層呈現(xiàn)出火山口狀的微孔,加大了外界與鎂金屬接觸面積,不利于保護基體鎂合金。同樣,電鏡下鎂金屬支架基體呈現(xiàn)完整一體性,與本課題組前期研究的3D 凝膠打印純鎂金屬支架微觀結(jié)構(gòu)明顯不同,未見顆粒狀鎂金屬[9];即使在力學(xué)測試實驗后,這種支架僅表現(xiàn)出輕微形變和微小裂痕,而未表現(xiàn)出松散的碎末樣結(jié)構(gòu)。

    良好的生物相容性是檢測金屬材料向臨床轉(zhuǎn)化的首要前提。CCK-8 結(jié)果表明,支架浸提液與MC3T3-E1 細(xì)胞共培養(yǎng)后,無涂層組表現(xiàn)為輕微毒性,而涂層組未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性,這種現(xiàn)象可能歸因于無涂層支架快速降解過程帶來的高鎂和高堿環(huán)境,抑制細(xì)胞生長;相反,Ca-P 生物活性涂層保護下的鎂金屬降解速率顯著降低,適宜濃度鎂和微環(huán)境有利于細(xì)胞生長。相較于本組前期3D 凝膠打印純鎂金屬支架[9],并未表現(xiàn)出顯著差異,同樣符合國家標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞活死染色結(jié)果顯示,隨著培養(yǎng)時間延長,經(jīng)染色后,死細(xì)胞數(shù)量少,活細(xì)胞數(shù)量隨時間呈現(xiàn)增加的趨勢,與本實驗室前期研究的3D 凝膠打印純鎂金屬支架類似。掃描電鏡下,支架表面細(xì)胞黏附結(jié)果表明,MC3T3-E1 細(xì)胞在支架表面附著,細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)扁平、舒展、片狀、絲狀多種形態(tài)充分與支架表面接觸,細(xì)胞在支架表面大量增殖。以上結(jié)果顯示,我們制備的這種支架具有良好的生物相容性。

    綜上所述,我們通過選擇性激光熔化工藝結(jié)合化學(xué)轉(zhuǎn)化法成功制備出Ca-P 涂層多孔鎂金屬支架,并研究其力學(xué)性能和生物相容性,發(fā)現(xiàn)該材料能夠為負(fù)重部位骨松質(zhì)骨缺損區(qū)提供足夠的力學(xué)支撐,且擁有良好的生物相容性,為骨松質(zhì)缺損修復(fù)鎂材料的深入研究奠定基礎(chǔ)。

    致謝感謝佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科、解放軍總醫(yī)院骨科研究所、上海交通大學(xué)材料研究院所有工作人員的技術(shù)指導(dǎo)和幫助。

    作者貢獻葉健廷:細(xì)胞培養(yǎng),實驗指標(biāo)檢測,實驗數(shù)據(jù)分析處理,論文撰寫;繆鉑尊:材料制備,實驗數(shù)據(jù)分析處理,論文撰寫;熊英杰、孟昊業(yè)、單驗博、孫小涵、盧雨征:細(xì)胞培養(yǎng),數(shù)據(jù)收集,實驗數(shù)據(jù)分析;武艷斌、林萬程、關(guān)聰聰、劉修志、王鑫、許文靜:實驗儀器操作,實驗數(shù)據(jù)分析;袁廣銀:材料設(shè)計,實驗設(shè)計,文章校對;彭江:實驗設(shè)計,文章校對;周成福:實驗設(shè)計,文章校對。

    利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

    數(shù)據(jù)共享聲明本篇論文相關(guān)數(shù)據(jù)可依據(jù)合理理由從作者處獲取,Email:yejianting12@126.com。

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