靶向uPA-uPAR系統(tǒng)在腫瘤治療中的研究進展

蔡偉文，秦龍，張俊昶，文飛，張文濤，焦作義

0 引言

早在1878年Billroth在纖維蛋白性血栓中發(fā)現(xiàn)了腫瘤細胞，推測纖維蛋白可促進腫瘤的侵襲和轉移，并且同一時期的許多研究結果也支持這一觀點，證明纖維蛋白原、纖維蛋白和纖維蛋白溶解系統(tǒng)可能與腫瘤的生長及轉移存在關聯(lián)[1]。目前研究表明，由尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator,uPA）、尿激酶型纖溶酶原激活劑物體（urokinase-type plasminogen activator receptor,uPAR）和尿激酶型纖溶酶原激活抑制物（plasminogen activator inhibitor,PAI）組成的uPA-uPAR系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[2]。uPAR是一種糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol,GPI）錨定的膜蛋白，其既可以通過與uPA結合促進細胞外基質蛋白降解，還可以與整合素及玻連蛋白（Vitronection）結合介導RAS/RAF/MEK/ERK、PI3K/AKT等細胞信號通路激活，上述作用不僅可以增強腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，還能抑制腫瘤細胞凋亡，并促進腫瘤組織血管生成[3]。盡管PAI（PAI-1、PAI-2）對uPA-uPAR系統(tǒng)有抑制作用[4]，但在腫瘤中卻不盡相同。

大量的研究發(fā)現(xiàn)uPA-uPAR系統(tǒng)在人類的前列腺癌、乳腺癌、結直腸癌等多種腫瘤組織中表達增高，是腫瘤診斷和治療的潛在靶點[5]。據(jù)此研發(fā)了一批靶向uPA-uPAR系統(tǒng)的檢測方案：主要有測定血液和組織中uPA、PAI和可溶性尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（soluble urokinase-type plasminogen activator receptor,suPAR）的酶聯(lián)免疫吸附測定和實時熒光聚合酶鏈反應實驗的試劑盒，以及靶向uPA的抗體（如ATN-291）和靶向uPAR的多肽（如AE105）、抗體（如ATN-658,2G10）等腫瘤成像劑，進而對腫瘤進行早期診斷和預后評估，并且這些方案已經(jīng)呈現(xiàn)出較理想的效果[3,6]。同樣地，靶向uPA-uPAR系統(tǒng)在腫瘤的治療中也具有不容忽視的價值。

過去的三十多年里大量學者對靶向uPA-uPAR系統(tǒng)在腫瘤治療領域作出了巨大貢獻，這些成就主要包括開發(fā)了靶向uPA-uPAR系統(tǒng)的基因治療、藥物治療和免疫治療等方案，同時對其中一些方案進行了臨床試驗并取得了較為理想的治療效果。

1 靶向uPA-uPAR系統(tǒng)在腫瘤基因治療中的應用

基因治療是一種將外源性遺傳物質轉移到患者體內的治療方式，最早被用于治療遺傳性疾病。近年來隨著研究的深入，基因治療已從治療單基因病種向傳染病、神經(jīng)退行性疾病和腫瘤等疾病發(fā)展[7-8]。在靶向uPA-uPAR系統(tǒng)的基因治療中，反義寡核酸（antisense oligonucleotide,aODN）技術、RNA干擾（RNA interference,RNAi）技術和核酸適配體技術是較為成熟的方案。由于uPA-uPAR系統(tǒng)具有促進腫瘤侵襲和轉移的作用，Anna等構建的uPAR-aODN通過抑制TGF-β而遏制黑色素瘤的上皮-間充質轉化過程，從而減緩腫瘤進展；同時Wu等構建的靶向環(huán)氧化酶-2的aODN通過間接抑制uPA和uPAR的轉錄而抑制人骨肉瘤細胞的侵襲[9-10]。以上靶向uPAuPAR系統(tǒng)的實驗均證實利用反義寡核酸技術的靶向治療在腫瘤的基因治療中具有可行性。在RNAi技術領域，GONDI等通過RNAi技術對人腦膠質瘤細胞的uPA和uPAR基因進行靶向抑制后發(fā)現(xiàn)RNAi通過下調PI3K/AKT/mTOR通路而促進半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9表達，最終共同促進腦膠質瘤細胞的凋亡，Anna等還利用RNAi技術靶向抑制uPAR在黑色素瘤中表達，進而增強維莫非尼治療黑色素瘤的敏感度[11-12]。最后，由于核酸適配體為單鏈核酸，并且具有穩(wěn)定的三維結構，同時對靶點有較高特異性和親和力、以及相對較小的分子結構和可控的化學合成方法，因此在腫瘤的診斷和治療中具有顯著的優(yōu)勢[13];盡管PAI對uPA-uPAR具有抑制作用，但在腫瘤中PAI-1還可以通過與Vitronection結合促進腫瘤進展，故其在腫瘤的基因治療中也是一個較為理想的靶點，F(xiàn)ortenberry等根據(jù)這一特性開發(fā)的靶向PAI-1的RNA適配體WT-15和SM-20在乳腺癌中能夠與PAI-1特異結合而競爭性抑制其與Vitronection結合，進而抑制腫瘤的侵襲與轉移[14-15]。盡管靶向uPA-uPAR系統(tǒng)的基因治療在腫瘤防治中已有較多的研究，但由于長時間以來人們對“核酸類”基因治療認識的不足，使得到目前為止沒有一個此類研究進入臨床試驗階段。然而，隨著最近基于CRISPR-Cas9技術的uPAR基因敲除在黑色素瘤治療中潛在價值的發(fā)現(xiàn)以及針對SARS-CoV-2的mRNA疫苗在全球的使用[16]，此類治療方案在未來可能會獲得較好的認可和發(fā)展。

2 靶向uPA-uPAR系統(tǒng)在腫瘤藥物治療中的應用

在靶向uPA-uPAR系統(tǒng)的抗腫瘤藥物中，靶向uPA的藥物最早被研發(fā)。隨著研究的深入，研究者不僅豐富了靶向uPA藥物的種類，還制備了大量靶向uPAR和PAI-1的抗腫瘤藥物，這些藥物主要包括抑制劑、天然產(chǎn)物和表觀遺傳藥物。

2.1 抑制劑

Upamostat是一種靶向uPA的絲氨酸蛋白酶抑制劑，其包括靜脈注射藥物WX-UK1和口服藥物WX-671。其中最早研發(fā)的WX-UK1可以顯著抑制小鼠乳腺癌的生長和淋巴結轉移，而基于WXUK1開發(fā)的口服前體藥物WX-671不僅在體外可將人乳腺癌細胞抑制在細胞周期的G1/S期，從而抑制其增殖能力；而且在體內實驗研究中，WX-671聯(lián)合吉西他濱可提高乳腺癌患者中位生存率，并具有較小的不良反應。同時已完成的藥代動力學研究和Ⅱ期臨床試驗證實其具有良好的安全性和耐受性[17-20]。如前所述uPA同uPAR結合可促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，因此基于目前較完善的小分子化合物（抑制劑）篩選和改造技術，近期研究者研發(fā)了一批靶向抑制uPA與uPAR結合的藥物，其中有明顯潛在價值的抗腫瘤藥物有IPR-3011和IPR-3242等[21-22]。盡管已經(jīng)開發(fā)的靶向PAI-1的藥物已超過50種[23]，但明確具有抗腫瘤效果的只有IMD-4482、TM5275和TM5441，分別具有抑制人卵巢癌和纖維肉瘤在體內的生長作用[24-26]。

與傳統(tǒng)的化療藥物相比，肽類藥物在腫瘤的治療中具有高靶向性、低毒性、低免疫原性及低制備成本等顯著優(yōu)點，因此肽類藥物在腫瘤的靶向治療中具有獨特的優(yōu)勢[27]。由于uPAR缺乏跨膜區(qū)和細胞內結構域，其介導的細胞信號轉導依靠整合素與Vitronection完成[2]，而這一過程需要進行蛋白質間相互作用（protein-protein interaction,PPI），同時uPA與uPAR的結合也要進行PPI，這為肽類藥物通過靶向uPA-uPAR系統(tǒng)治療腫瘤奠定了基礎。A6肽（乙?；?KPSSPPEE-氨基）是一個由8個氨基酸構成的可靶向抑制uPA與uPAR及Su-PAR結合的多肽；單獨使用時即可明顯抑制鼠乳腺癌的轉移，對于雌激素受體陽性的乳腺癌，其聯(lián)用他莫昔芬后表現(xiàn)出更顯著的抗腫瘤轉移作用。此外有臨床Ⅱ期試驗證實其在卵巢癌治療中具有良好的安全性和療效[28]。最近研發(fā)的靶向uPA的多肽Pep1和Pep2通過阻礙uPA與整合素αV結合而終止uPAR與整合素間的聯(lián)系達到抗腫瘤的作用[29]。此外，由于uPAR可以通過結合G蛋白偶聯(lián)的甲?；氖荏w（formylpeptide receptors,FPRs）促進腫瘤細胞遷移[30]，Minopoli和Carriero等依據(jù)這一特點開發(fā)了一系列靶向uPAR與FPR1結合的多肽抑制劑（如SRSRY、UPARANT等），其中多肽RI-3是此類藥物經(jīng)多次優(yōu)化后的代表藥物，具有令人鼓舞的抗腫瘤作用及安全性。最新研究提示RI-3可以顯著抑制黑色素瘤和轉移性肉瘤的遷移和侵襲能力，并且在骨肉瘤中還可以通過減少單核細胞招募達到遏制腫瘤轉移的作用[31-34]，因此多肽RI-3為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了一個新思路。

2.2 天然產(chǎn)物和表觀遺傳藥物

β-欖香烯是一種從姜科植物溫郁金（莪術）中提取的倍半萜類化合物，也是最早被我國中醫(yī)用來治療腫瘤的藥物之一，現(xiàn)代醫(yī)學研究證實其主要通過抑制細胞增殖、阻滯細胞周期和誘導凋亡等途徑發(fā)揮抗癌作用[35]。在uPAuPAR系統(tǒng)中其通過抑制uPA、uPAR、MMP-2和MMP-9等的表達減緩小鼠黑色素瘤的生長[36]。氧化苦參堿（Oxymatrine,OMT）是另一種從豆科槐屬植物中提取的生物堿，具有調節(jié)免疫、抗炎和抗病毒的作用，因此最早被用于治療慢性病毒性肝炎，但隨后大量研究發(fā)現(xiàn)其還可以通過PI3K/AKT、EGFR/AKT 和NF-κB等通路參與調節(jié)腫瘤細胞的增殖和凋亡等[37]，而Wang等研究發(fā)現(xiàn)OMT可通過抑制TGF-β1/Smad通路減少結直腸癌中PAI-1的表達，進而抑制結腸癌的侵襲[38]。槲皮素（Quercetin,Qu）是一種廣泛存在于植物中的黃酮醇類化合物，過去許多研究證明其可通過調節(jié)PI3K/AKT/mTOR、Wnt/β-Catenin和MAPK/ERK1/2等通路，促進腫瘤細胞凋亡和自噬[39]，同樣地在胃癌的治療中，Qu通過抑制NF-κB等通路和降低uPA及uPAR的表達抑制胃癌細胞的轉移能力[40]。來源于中草藥的天然產(chǎn)物在過去的幾十年里不僅得到了世界的認可，也豐富了新藥開發(fā)的來源，隨著天然產(chǎn)物安全性和有效性研究的不斷發(fā)展，這類藥物會在不久的將來為腫瘤臨床治療提供更多的選擇。由于在腫瘤的進展及轉移過程中往往伴隨著DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質結構異常等表觀遺傳失調活動，因此研發(fā)表觀遺傳藥物是腫瘤治療的潛在療法[41]。在乳腺癌中uPA基因啟動子的低甲基化可促進uPA表達，基于此開發(fā)的表觀遺傳藥物S-腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）通過阻止uPA基因啟動子去甲基化而抑制乳腺癌細胞的侵襲，并呈劑量依賴性抑制人骨肉瘤細胞的增殖和侵襲[42-43]，由于穩(wěn)定的SAM制劑多可口服，為腫瘤預防和治療提供了方便，同時將表觀遺傳療法與目前正在開發(fā)的各種治療策略相結合可發(fā)揮強大的協(xié)同效應。

3 靶向uPA-uPAR系統(tǒng)在腫瘤免疫治療中的應用

通過增強體內免疫反應來消除腫瘤的免疫療法為腫瘤治療提供了新策略，并隨著雜交瘤技術的發(fā)展，許多團隊開發(fā)了靶向腫瘤抗原的單克隆抗體并在腫瘤免疫治療中取得了顯著的療效，近年來Carl H.June等構建的嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T-cell,CAR-T）免疫療法在腫瘤免疫治療中也取得了不菲的成就[44]。

由于uPAR既是膜蛋白又在多種腫瘤組織中顯著高表達，這使其成為腫瘤免疫治療的新靶點。在過去十幾年的研究中大量靶向uPAR的單克隆抗體被研制，其中ATN-658和2G10是目前研究較深入的單克隆抗體。首先，ATN-658在體內外對人前列腺癌細胞的生長、侵襲及轉移均有抑制作用，而這種作用可能通過抑制uPAR與整合素CD11b結合來實現(xiàn)[45-46]。隨后經(jīng)人源化改造后的huATN-658無論是單用還是聯(lián)合使用唑來膦酸在人乳腺癌及乳腺癌相關骨病模型中均表現(xiàn)出可觀的抗腫瘤作用[47]。2G10是另一種靶向uPAR的單克隆抗體，雖然目前主要被應用在腫瘤成像劑領域，但其在體內外實驗中均表現(xiàn)出具有抑制人乳腺癌細胞增殖和遷移的能力，并且基于2G10開發(fā)的抗體藥物偶聯(lián)物（antibody-drug conjugates,ADCs）在高侵襲性三陰性乳腺癌的小鼠異種種植模型的治療中取得了較好的療效[48-49]。近年來隨著抗體制備技術的完善和發(fā)展，特別是PD-1及其配體PD-L1單克隆抗體的研發(fā)與應用，將為腫瘤的免疫治療帶來更大的空間。最近Qin等針對uPAR在彌漫型胃癌（diffuse-type gastric cancer,DGC）中高表達的現(xiàn)象，制備了靶向uPAR的單克隆抗體Anti-uPAR，其在聯(lián)用PD-1抗體后可明顯促進免疫細胞在人DGC組織（人源腫瘤細胞系異種移植鼠模型和人源腫瘤組織來源移植瘤鼠模型）中的浸潤，同時該抗體還通過結合uPAR的DⅡ-DⅢ結構域而抑制下游激酶ERK的磷酸化，最終促進了DGC的免疫治療[50]。

Wang等于2019年首次報道了靶向uPAR的CAR-T細胞療法，其在體外對卵巢癌細胞具有明顯的殺傷作用[51]，隨后Amor等的研究發(fā)現(xiàn)靶向uPAR的CAR-T細胞不僅可以高效地清除體內衰老的細胞和改善肝纖維化，甚至還延長了負荷肺腺癌鼠的生存時間[52]。此外，在DGC的治療中，Qin等研究發(fā)現(xiàn)靶向uPAR的CAR-T細胞療法在體內和體外對DGC均有較好的殺傷效果[50]。上述研究均為CAR-T細胞療法在實體瘤中的應用開辟了新思路。CAR-T細胞療法在血液學相關惡性腫瘤的治療方面已經(jīng)顯示出巨大的前景，盡管在實體瘤的治療中仍存在著一定的困難，但隨著腫瘤特異性靶標的發(fā)現(xiàn)和CAR-T細胞結構的優(yōu)化，CAR-T細胞療法在腫瘤的免疫治療中將會取得較好的發(fā)展。

4 其他新型靶向治療藥物在腫瘤治療中的應用

多肽偶聯(lián)藥物（peptide-drug conjugates,PDCs）是一種將細胞毒性藥物或放化療藥物通過與靶向多肽共價連接的新型抗腫瘤藥物，因其可以靶向傳遞，所以與普通抗腫瘤藥物相比具有更好的靶向性和安全性[53]。AE105是能與uPAR高度親和的人工合成肽，以往主要作為靶向探針被用在腫瘤的診斷中，但在最近的研究中Persson等人將放射性核素镥（177Lu）與AE105偶聯(lián)制備的177Lu-DOTA-AE105顯著遏制了人前列腺癌在小鼠模型中的轉移[54]。在腫瘤光熱治療領域，Yu等將金屬銥（Iridium,Ir）與AE105結合形成的新型光熱劑GNS@Ir@P-AE105在體內外均可促進腫瘤細胞內產(chǎn)生活性氧而導致其DNA嚴重損傷，進而促進腫瘤細胞凋亡，最終在三陰性乳腺癌的治療中取得療效[55]，同時Simón等將熒光探針吲哚菁綠（indocyanine green,ICG）與AE-105結合制備的ICG-Glu-Glu-AE105在人腦膠質瘤小鼠模型中不僅可以通過釋放熱能殺傷腫瘤，還可以在術中進行腫瘤定位[56]。此外，由A6肽與長春新堿組裝的PDCs（A6-cPS-VCR）可顯著減少急性髓系白血?。╝cute myelocytic leukemia,AML）模型鼠體內的腫瘤細胞并延長模型鼠生存時間[57]。在腫瘤的免疫毒素治療中，Provenzano等利用基因工程技術將uPA的部分氨基末端（amino-terminal fragment,ATF）片段與皂草素（Saporin,SAP）融合后制備了嵌合蛋白ATF-SAP，該蛋白通過靶向結合uPAR后再用毒素SAP對腫瘤進行殺傷，并且已在人血液腫瘤疾病、膀胱癌、乳腺癌細胞中得到初步驗證[58-59]。最后，基于同樣的原理研發(fā)的eBAT通過雙特異靶向uPAR和表皮生長因子受體（EGFR）來調節(jié)實體瘤中血管生成，最終達到抗腫瘤作用[60]。此外，基于材料學和分子生物學的發(fā)展，此類新興的藥物制劑將會使更多的腫瘤患者受益。

一些重要的靶向uPA藥物總結見表1。

表1 靶向uPA-uPAR系統(tǒng)在腫瘤中的治療Table 1 Summary of targeting uPA-uPAR system in tumor therapy

5 總結與展望

在過去三十多年的研究中，越來越多的研究證實uPA-uPAR系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，主要表現(xiàn)為該系統(tǒng)在多數(shù)腫瘤組織中高表達并且激活后可明顯促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移等，就此研究者從基因和蛋白水平入手，對該系統(tǒng)進行了大量的基因、藥物和免疫治療等實驗，并提出和驗證了一批具有良好效果的治療方案，尤其在藥物治療領域的抑制劑WX-671及A6肽已經(jīng)完成相應的Ⅱ期臨床研究。此外基于抗體和多肽的ADCs及PDCs在該系統(tǒng)的腫瘤靶向治療中有較好的前景。最后，盡管目前靶向uPAuPAR系統(tǒng)在腫瘤的基因治療和免疫治療領域有較大的挑戰(zhàn)，但CRISPR-Cas9技術和mRNA疫苗技術的成熟可很好地彌補基因治療的局限，而在免疫治療方面，成熟的抗體制備技術和迅速發(fā)展的CAR-T技術也將克服這一困難，最終共同促進腫瘤的靶向治療。