胃癌組織TRAF4和RSK4蛋白表達與腹腔鏡根治術后復發(fā)的關系

吳嶺，王偉偉，陳大明，馮福梅，何志國，張建生

0 引言

胃癌是起源于胃黏膜上皮細胞病變的消化道惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率與死亡率[1]?；蛲蛔?、不良飲食結構、病菌感染及吸煙等因素均可誘發(fā)胃癌。與傳統(tǒng)開放根治手術相比，腹腔鏡胃癌根治術因具有創(chuàng)傷較小、術后恢復較快等特點，已成為臨床治療胃癌的主要外科手段，可有效提高患者生存質量，延長生存期，但仍有部分患者在術后出現復發(fā)，嚴重影響患者預后[2]。因此，積極探討影響胃癌腹腔鏡根治術后復發(fā)的相關因素，以指導臨床制定合適的防控措施，對減少患者術后復發(fā)具有重要意義。近年來，有研究顯示[3]有多種基因、細胞因子及化合物參與了腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展過程，其中腫瘤壞死因子受體相關因子4（tumor necrosis factor receptor associated factor 4,TRAF4）和核糖體S6蛋白激酶4（ribosomal s6 protein kinase 4,RSK4）在腫瘤細胞中存在異常表達。TRAF4屬于TRAF家族類蛋白，可介導腫瘤細胞內信號傳遞，有研究指出[4]TRAF4在乳腺癌、結直腸癌等腫瘤組織中高表達。RSK4為核糖體S6蛋白激酶家族成員之一，參與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信號通路的轉導，具有調控細胞生長、增殖、分化的作用，有研究指出[5]RSK4蛋白在結直腸癌細胞株中低表達，可能參與了結直腸癌的發(fā)生發(fā)展。以往研究大多是對TRAF4或RSK4蛋白在癌細胞中的作用及其與患者臨床病理特征的關系進行分析，但關于TRAF4和RSK4蛋白表達是否與胃癌患者腹腔鏡根治術后復發(fā)相關不甚明確。鑒于此，本研究探討了胃癌組織TRAF4和RSK4蛋白的表達與患者腹腔鏡根治術后復發(fā)的相關性，旨在為臨床制定合適的防控措施提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2016年1月～2019年1月收治的176例胃癌患者的臨床資料，其中男105例，女71例；年齡39～76歲，平均（53.18±10.09）歲；胃癌病變部位：胃竇80例，賁門55例，幽門28例，其他部位13例；胃癌組織類型：乳頭狀腺癌69例，管狀腺癌55例，黏液腺癌39例，其他組織類型13例；TNM分期：Ⅰ期28例，Ⅱ期85例，Ⅲ期63例；腫瘤分化程度：高分化48例，中分化63例，低分化65例。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準通過。

納入標準：（1）經臨床病理及胃鏡檢查確診為胃癌；（2）初治，滿足腹腔鏡胃癌根治術適應證且均接受腹腔鏡胃癌根治術治療及淋巴結清掃術；（3）患者或家屬知曉并簽署知情同意書。排除標準：（1）既往接受過放療、靶向治療、化療或胃癌根治術者；（2）嚴重精神疾病患者；（3）既往胃癌術后出現復發(fā)的患者；（4）嚴重心、腎衰竭或功能不全者；（5）合并患有其他惡性腫瘤者；（6）術前已出現胃癌遠處轉移者；（7）合并患有免疫系統(tǒng)或血液系統(tǒng)疾病者；（8）術后預計生存期<3個月。

1.2 方法

1.2.1 TRAF4和RSK4蛋白表達檢測 納入研究患者均采取腹腔鏡胃癌根治術治療，并于術中留取胃癌組織及癌旁組織（距腫瘤切緣外約3 cm）。將組織經10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋制備成組織蠟塊，使用免疫組織化學法測定TRAF4和RSK4蛋白表達。步驟如下：將胃癌及癌旁組織蠟塊連續(xù)切片（4 μm）3張，常規(guī)脫蠟水化，然后進行抗原修復，再使用1%過氧化氫（H2O2）-甲醇消除內源性過氧化物酶，室溫下靜置10 min后PBS洗3次，5%血清白蛋白（BSA）孵育20 min，分別加入兔抗人TRAF4多克隆抗體及兔抗人RSK4單克隆抗體，4℃孵育過夜。次日37℃復溫1 h，后PBS洗3次，分別加入山羊抗兔二抗抗體，室溫孵育2 h，PBS洗3次后，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）進行顯色，蒸餾水清洗終止顯色，蘇木精對比染色，充分水洗。脫水后，以中性樹膠封固，于顯微鏡下觀察。同時用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 結果判定 在400高倍鏡視野下隨機選取5個視野，各視野均計數100個細胞，記錄陽性細胞占比，其中TRAF4陽性細胞表現為細胞核或細胞質出現棕黃色或棕褐色顆粒，RSK4陽性細胞表現為細胞質出現棕黃色或棕褐色顆粒。

蛋白表達情況判定標準：（1）按照染色強度判定：細胞未著色記為0分，呈淡棕黃色記為1分，呈棕黃色記為2分，呈明顯的棕黃色或深褐色記為3分；（2）按照陽性細胞（棕黃色）所占比例判定：陽性細胞占比<5%記為0分，5%≤陽性細胞占比<25%記為1分，25%≤陽性細胞占比<50%記為2分，50%≤陽性細胞占比<75%記為3分，陽性細胞占比≥75%記為4分；將染色強度與陽性細胞占比兩者得分相乘，<2分為蛋白表達陰性，≥2分為蛋白表達陽性。

術后復發(fā)判定與分組：腹腔鏡胃癌根治術后，前3個月每月對患者電話或微信隨訪一次，上門訪問一次，3個月后每隔1個月電話隨訪1次，隨訪期間囑患者定期至醫(yī)院復診，共隨訪36個月。復發(fā)判定：經影像學檢查（CT、PET-CT、MRI）、組織病理學檢查（胃鏡活檢、穿刺或再次手術）明確，發(fā)現手術切除部位或附近新發(fā)腫瘤或出現遠處組織器官轉移等。將術后復發(fā)者歸為復發(fā)組，反之歸為未復發(fā)組。

1.2.3 影響因素分析 統(tǒng)計可能影響胃癌患者腹腔鏡根治術后復發(fā)的影響因素，包括患者年齡、性別、最大腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、Lauren分型、浸潤深度、腹水、淋巴結轉移、術后輔助化療、TRAF4蛋白表達、RSK4蛋白表達、規(guī)律飲食、家族胃癌病史、幽門螺旋桿菌感染等，將其作為自變量（X），對其進行賦值，結果見表1；另將腹腔鏡根治術后復發(fā)情況作為因變量（Y），未復發(fā)記為0，復發(fā)記為1；分析因變量與自變量間的關系。

表1 胃癌患者腹腔鏡根治術后復發(fā)影響因素賦值情況Table 1 Assignment of independent variables influencing recurrence after laparoscopic radical gastrectomy

1.3 觀察指標

（1）胃癌組織與癌旁組織TRAF4和RSK4蛋白表達；（2）不同病理特征患者胃癌組織TRAF4和RSK4蛋白表達；（3）術后復發(fā)情況及復發(fā)組與未復發(fā)組胃癌組織TRAF4和RSK4蛋白表達比較；（4）胃癌患者腹腔鏡根治術后復發(fā)的影響因素：風險比（HR）、95%CI；（5）胃癌組織TRAF4和RSK4蛋白表達對腹腔鏡根治術后復發(fā)的預測作用。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數資料采用例數和百分數（n（%））表示，采用χ2檢驗。當理論頻數為1～5則采用校正卡方檢驗，當理論頻數<1或樣本量<40則采用Fisher精確檢驗；等級比較采用秩和檢驗；采用單因素和多因素Cox回歸分析法分析胃癌腹腔鏡根治術后復發(fā)的影響因素；以術后實際復發(fā)情況為金標準，計算各影響因素預測術后復發(fā)的敏感度、特異性與準確度，比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁組織TRAF4和RSK4蛋白表達比較

胃癌組織中TRAF4蛋白陽性表達率高于癌旁組織（P<0.05），RSK4蛋白陽性表達率低于癌旁組織（P<0.05），見表2、圖1。

圖1 TRAF4和RSK4蛋白在胃癌和癌旁組織中的表達 (IHC ×400,scale bar=40 μm)Figure 1 Expressions of TRAF4 and RSK4 protein in gastric cancer and paracancerous tissues(IHC ×400,scale bar=40 μm)

表2 胃癌組織與癌旁組織TRAF4和RSK4蛋白表達比較 (n(%))Table 2 Comparison of TRAF4 and RSK4 protein expression between gastric cancer tissues and adjacent tissues (n(%))

2.2 不同病理特征患者胃癌組織TRAF4和RSK4蛋白表達比較

低分化、TNM Ⅲ期、浸潤深度T3～T4、淋巴結轉移患者胃癌組織TRAF4蛋白陽性表達率均分別高于中/高分化、TNMⅠ/Ⅱ期、浸潤深度T1～T2、無淋巴結轉移患者（P<0.05），而RSK4蛋白陽性表達率分別低于中/高分化、TNMⅠ/Ⅱ期、浸潤深度T1～T2、無淋巴結轉移患者（P<0.05），見表3。

表3 不同病理特征患者胃癌組織TRAF4和RSK4蛋白表達比較 (n(%))Table 3 Comparison of TRAF4 and RSK4 protein expression in gastric cancer tissues of patients with different pathological characteristics (n(%))

2.3 復發(fā)組與未復發(fā)組胃癌組織一般資料比較

對176例行腹腔鏡根治術的胃癌患者進行36個月的術后隨訪，隨訪率100%，其中有56例患者胃癌復發(fā)，120例患者未復發(fā)，復發(fā)率為31.82%（56/176）。復發(fā)組胃癌組織TRAF4蛋白陽性表達率高于未復發(fā)組（P<0.05），RSK4蛋白陽性表達率低于未復發(fā)組（P<0.05），復發(fā)組最大腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移、術后輔助化療、規(guī)律飲食、家族胃癌病史與未復發(fā)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表4。

表4 復發(fā)組與未復發(fā)組一般資料比較 (n(%))Table 4 Comparison of general data between recurrence group and non-recurrence group (n(%))

2.4 影響腹腔鏡胃癌根治術后復發(fā)的單因素Cox回歸分析

結果顯示最大腫瘤直徑>5 cm、低分化程度、TNM分期Ⅲ期、浸潤深度T3～T4、淋巴結轉移、術后未輔助化療、TRAF4蛋白陽性表達、家族胃癌病史均是腹腔鏡胃癌根治術后患者復發(fā)的危險因素（P<0.05），而RSK4蛋白陽性表達、規(guī)律飲食是保護因素（P<0.05），見表5。

表5 影響腹腔鏡胃癌根治術后復發(fā)的單因素Cox回歸分析Table 5 Cox regression analysis of single factor influencing recurrence after laparoscopic radical gastrectomy

2.5 影響腹腔鏡胃癌根治術后復發(fā)的多因素分析

以單因素Cox回歸分析中P<0.10的因素為自變量，進行多因素Cox回歸分析，結果顯示最大腫瘤直徑>5 cm、低分化程度、TNM分期Ⅲ期、浸潤深度T3～T4、淋巴結轉移、術后未輔助化療、TRAF4蛋白陽性表達均是胃癌患者腹腔鏡根治術后復發(fā)的危險因素（P<0.05），而RSK4蛋白陽性表達、規(guī)律飲食均是保護因素（P<0.05），見表6。

表6 影響腹腔鏡胃癌根治術后復發(fā)的多因素Cox回歸分析Table 6 Cox regression analysis of multiple factors influencing recurrence after laparoscopic radical gastrectomy

2.6 TRAF4和RSK4蛋白表達對胃癌腹腔鏡根治術后復發(fā)的預測作用

胃癌組織TRAF4和RSK4蛋白表達聯(lián)合預測胃癌腹腔鏡根治術后復發(fā)的準確度高于各蛋白單獨預測（χ2=34.566、47.239,P<0.001），且高于最大腫瘤直徑>5 cm、低分化、TNMⅢ期、浸潤深度T3～T4、淋巴結轉移、術后未輔助化療、未規(guī)律飲食（χ2=18.810、4.380、15.286、17.902、6.588、10.570、20.682，P=0.000、0.036、0.000、0.000、0.010、0.001、0.000），而與TRAF4、RSK4蛋白表達聯(lián)合其他七項比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.982,P=0.084），見表7。

表7 TRAF4和RSK4蛋白表達對胃癌腹腔鏡根治術后復發(fā)的預測作用Table 7 Predictive effect of TRAF4 and RSK4 protein expression on recurrence of gastric cancer after laparoscopic radical surgery

3 討論

胃癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來，我國胃癌發(fā)病率逐漸上升且呈年輕化趨勢，嚴重威脅患者的身心健康[6]。腹腔鏡根治術是目前臨床治療胃癌較為廣泛的微創(chuàng)術式，但術后復發(fā)仍是不容忽視的問題[7]。本研究中，胃癌患者腹腔鏡根治術后3年的復發(fā)率為31.82%，稍低于趙車冬等[8]研究顯示的胃癌根治術后復發(fā)率（術后隨訪3年，復發(fā)率41.67%），可能與所選樣本間的個體差異性、具體手術方式、術后干預措施等差異有關，但均表明胃癌根治術后有較高的復發(fā)風險，嚴重影響患者預后。因此，對影響胃癌腹腔鏡根治術后復發(fā)的因素進行探索分析很重要。

本研究顯示，胃癌組織中TRAF4蛋白陽性表達率較癌旁組織高，RSK4蛋白陽性表達率較癌旁組織低，提示TRAF4、RSK4蛋白在胃癌組織中均異常表達，可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關。TRAF家族蛋白主要參與細胞的增殖、分化及凋亡的調控，在多種生命活動中發(fā)揮重要的作用，其中TRAF4通過間接作用或形成復合體的方式在細胞質、細胞膜和細胞核中遷移而發(fā)揮作用[9]。TRAF4與絲裂原活化蛋白激酶激酶4結合可激活c-Jun氨基酸末端激酶（JNK）途徑，而JNK途徑與腫瘤發(fā)生密切相關[10]。有研究表明[11]，結直腸癌組織中TRAF4蛋白陽性表達率顯著高于癌旁組織，與本研究結果相似。RSK4作為細胞內重要的調控因子，可以調節(jié)細胞周期（G0/S期、G1/S期）細胞比例，對癌細胞的過度增殖具有抑制作用[12]。有研究顯示[13]RSK4蛋白在多種腫瘤細胞中如乳腺癌、結直腸癌等低表達，表明RSK4蛋白可能具有類似抑癌基因的作用。因而胃癌組織中RSK4蛋白陽性表達率較癌旁組織低，且RSK4蛋白陽性表達率下降會降低機體對腫瘤發(fā)生的調控作用，增加腫瘤發(fā)生的風險。另本研究結果顯示，低分化、TNMⅢ期、浸潤深度T3～T4、淋巴結轉移患者胃癌組織TRAF4蛋白陽性表達率較中/高分化、TNMⅠ/Ⅱ期、浸潤深度T1～T2、無淋巴結轉移患者高，而RSK4蛋白陽性表達率較中/高分化、TNMⅠ/Ⅱ期、浸潤深度T1～T2、無淋巴結轉移患者低，提示TRAF4和RSK4蛋白表達可能與胃癌患者分化程度、TNM分期、浸潤深度以及淋巴結轉移情況存在一定的關聯(lián)。TRAF4可通過調控PI3K/AKT/Oct4、Wnt/β-catenin等多條信號通路促進癌細胞的增殖、侵襲、遷移以及上皮間質轉化[14-15]。RSK4表達下降可促使其阻礙細胞蛋白合成的作用減弱，喪失保護腫瘤細胞分化調控作用，抑制腫瘤生長的功能減退，導致腫瘤進展，其過表達可能通過抑制PI3K/AKT信號通路而抑制腫瘤細胞遷移、侵襲與生長[16]。

本研究結果還顯示，復發(fā)組胃癌組織TRAF4蛋白陽性表達率高于未復發(fā)組，RSK4蛋白陽性表達率低于未復發(fā)組，且多因素分析表明TRAF4蛋白陽性表達是胃癌患者腹腔鏡根治術后復發(fā)的危險因素，RSK4蛋白陽性表達是其保護因素，提示胃癌組織TRAF4和RSK4蛋白表達情況與患者根治術后復發(fā)密切相關。TRAF4是一種定位于細胞核內的重要信號轉導蛋白，已被證實參與了多種腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展過程。相關研究報道[17]顯示，TRAF4表達上調可以誘導G1/S-特異性周期蛋白-D1、調節(jié)基因、癌基因、聚ADP核糖聚合酶1等靶分子的表達，還具有激活Wnt/β-catenin信號通路促進癌細胞生長、遷移的作用。因此，TRAF4蛋白高表達可促進腫瘤進一步生長與轉移，增加胃癌患者術后復發(fā)的風險。RSK4是位于細胞質內的一種核糖體修飾因子，可以通過對核糖體羧基末端進行修飾而降低染色體DNA配對的錯配風險，還可以提高錯配修復因子半胱氨酸的活性[18]。另RSK4對癌細胞低分化具有重要的抑制作用，可降低癌細胞黏附血管內皮或淋巴管內皮的能力，抑制癌癥進展[19]。有研究表明[20]，過表達RSK4能夠抑制乳腺癌細胞的侵襲與轉移。當RSK4蛋白表達降低時，其抑制癌細胞低分化、侵襲與轉移等的能力減弱，則腫瘤進展的風險增加，患者術后復發(fā)的概率升高。因此，RSK4蛋白陽性表達可以及時監(jiān)控腫瘤的發(fā)生，抑制癌細胞低分化，為胃癌患者腹腔鏡根治術后復發(fā)的保護因素。本研究結果顯示，TRAF4和RSK4蛋白表達聯(lián)合用于預測胃癌腹腔鏡根治術后復發(fā)中具有較高的準確度，提示臨床可根據此兩種蛋白表達情況而對胃癌患者根治術后復發(fā)進行評估，盡可能及早地給予針對性干預對策以減少術后復發(fā)。

此外，本研究結果顯示，最大腫瘤直徑>5 cm、低分化程度、TNMⅢ期、浸潤深度T3～T4、淋巴結轉移、術后未輔助化療亦均是胃癌患者腹腔鏡根治術后復發(fā)的危險因素，而規(guī)律飲食是其保護因素。淋巴管壁較薄且管徑較細，常與靜脈或血管伴行，當腫瘤直徑越大，侵犯周圍淋巴結的程度就越深，當淋巴管壁被腫瘤細胞逐步浸潤后，進入淋巴管隨淋巴液被帶至淋巴結，并以此為中心長出同樣腫瘤，最終引起腫瘤轉移至淋巴結[21]。有研究顯示[22]，術前出現淋巴結轉移的腫瘤患者術后復發(fā)率超50%，與本研究結果一致，表明淋巴結轉移可能在腫瘤復發(fā)中起重要作用，成為術后評估腫瘤復發(fā)轉移的重要預測指標；與此同時，腫瘤直徑越大，浸潤程度越深，就會越容易突破漿膜層對周圍組織或肝、腎器官產生侵犯，可能會導致腫瘤發(fā)生轉移，引起局部復發(fā)[23]。分化程度越低，TNM分期越高，表示惡性程度越高，出現淋巴結轉移的可能性越大，術后復發(fā)的風險越高[24]。行根治性手術治療時，可能存在微小或潛在癌灶沒有發(fā)現而未能完全被清除，術后實施一定周期的輔助化療可殺滅癌細胞，控制腫瘤進展，但若未進行化療干預，殘留的病灶則可逐漸發(fā)展甚或轉移，導致術后復發(fā)。有研究表明[25]，術后化療>3周期的患者相較于未化療或化療≤3周期的患者具有更低的術后復發(fā)率。另規(guī)律飲食可以保證機體營養(yǎng)的正常供應，提高患者免疫力，降低術后復發(fā)的風險。

綜上所述，TRAF4蛋白在胃癌組織異常高表達，而RSK4蛋白則異常低表達，二者異常表達均與胃癌患者腹腔鏡根治術后復發(fā)密切相關，可對術后復發(fā)進行較好地預測。最大腫瘤直徑>5 cm、低分化程度、TNMⅢ期、浸潤深度T3～T4、淋巴結轉移、術后化療情況、是否規(guī)律飲食等是胃癌腹腔鏡根治術后復發(fā)的影響因素，臨床中可據此加強對胃癌患者的監(jiān)督與管理，制定針對性干預方案，以促進患者預后改善。本研究通過對胃癌組織中TRAF4和RSK4蛋白表達情況與患者腹腔鏡根治術后復發(fā)的關系分析，而為臨床術后及時制定合理的防控方案提供了指導依據，同時亦為胃癌的治療研究提供了一個新方向，但本研究納入復發(fā)的樣本量較小，且未對深層作用機制進行探討，后續(xù)需擴大樣本量進一步探索。