榆莢仁黃酮對(duì)慢性睡眠剝奪小鼠抗氧化能力的影響

李浩雨 徐興軍,2* 李雪涵 張澤鵬 張偉偉,2 邵淑麗,2

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，齊齊哈爾161006；2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，齊齊哈爾161006)

睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)是指由于環(huán)境或自身原因不能滿足正常睡眠的一種現(xiàn)象，包括急性睡眠剝奪和慢性睡眠剝奪，急性睡眠剝奪指快速的完全剝奪睡眠，而慢性睡眠剝奪指每日剝奪一定時(shí)間，持續(xù)幾天甚至幾個(gè)月[1]。慢性睡眠剝奪能夠?qū)е虏煌纳飳W(xué)效應(yīng)，例如神經(jīng)自主控制改變、氧化應(yīng)激損傷增加、炎癥的產(chǎn)生以及凝血反應(yīng)改變。Wang等[2]研究表明，慢性睡眠剝奪使小鼠腸道組織中抗氧化酶活性和總抗氧化能力降低，丙二醛含量升高，導(dǎo)致腸道出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷。Konakanchi等[3]研究表明，慢性睡眠剝奪誘導(dǎo)的空間記憶障礙和焦慮樣行為與氧化應(yīng)激和海馬CA3神經(jīng)元的樹(shù)突樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)減少有關(guān)。易沖等[4]研究表明，睡眠剝奪能顯著激活小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。以上研究表明，慢性睡眠剝奪會(huì)損害動(dòng)物的循環(huán)、內(nèi)分泌、免疫、消化、生殖等系統(tǒng)，從而使機(jī)體的代謝功能出現(xiàn)紊亂，嚴(yán)重?fù)p害動(dòng)物健康。同時(shí)，慢性睡眠剝奪是一種使動(dòng)物處在應(yīng)激環(huán)境的狀態(tài)，而動(dòng)物處于應(yīng)激環(huán)境時(shí)所表現(xiàn)出來(lái)的行為變化及生理變化可稱為動(dòng)物性情，其與動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、健康以及生產(chǎn)效率等方面密切相關(guān)[5]。

Ahmed等[6]研究表明，核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)相關(guān)通路能夠減輕睡眠剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥及氧化應(yīng)激損傷。Tang等[7]研究表明，蛇床子素通過(guò)激活Nrf2/血紅素氧合酶-1(heme oxygennase-1，HO-1)通路減輕了慢性睡眠剝奪誘導(dǎo)的認(rèn)知缺陷。Nrf2是一種主要的內(nèi)源性抗氧化調(diào)節(jié)因子，可介導(dǎo)活性氧(ROS)產(chǎn)生并維持氧化還原穩(wěn)態(tài)[8]。HO-1是抗氧化的重要靶點(diǎn)，通常受Nrf2信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，依賴還原型輔酶Ⅰ(Ⅱ)醌氧化還原酶1[NAD(P)H: quinine oxidoreductase 1，NQO1]是一類(lèi)分布廣泛的抗氧化酶，能夠解除醌類(lèi)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的毒害，同樣受到Nrf2的調(diào)節(jié)[9]，以上由Nrf2及Nrf2調(diào)控的下游抗氧化酶構(gòu)成的信號(hào)通路在對(duì)抗氧化應(yīng)激的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[10]。

榆莢仁為蕁麻目榆科植物榆樹(shù)(UlmuspumilaL.)的種子，原產(chǎn)于中亞、中國(guó)北部和印度[11]。研究表明，從榆莢仁中分離出來(lái)的黃酮類(lèi)物質(zhì)具有良好的抗氧化活性[12]。雖然榆莢仁在中藥領(lǐng)域已經(jīng)有了廣泛應(yīng)用，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)榆莢仁治療睡眠障礙的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)其治療睡眠障礙的機(jī)理仍不清楚。因此，本研究以不同濃度的榆莢仁黃酮連續(xù)灌胃慢性睡眠剝奪小鼠，從基因及酶學(xué)水平研究其對(duì)慢性睡眠剝奪小鼠大腦、肝臟和腸道中Nrf2、HO-1、NQO1基因表達(dá)及相關(guān)抗氧化酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物：試驗(yàn)以購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司42只4周齡無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性ICR小鼠為研究對(duì)象，體重(22.00±2.00) g。

儀器設(shè)備：TECAN M1000酶標(biāo)儀(帝肯上海貿(mào)易有限公司)；VORTEX-5旋渦混合器(德國(guó)IKA公司)；TS-DI-20L/H實(shí)驗(yàn)室超純水設(shè)備(陶氏水處理設(shè)備工程有限公司)；恒溫干燥箱(天津市南郊區(qū)東泥沽鐵工廠)；大功率磁力加熱攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；BS124S電子天平(德國(guó)賽多利斯股份公司)；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；DK-S26數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；WD-9403D紫外儀(北京市六一儀器廠)；TH-86-340-LA(-80 ℃)超低溫冰箱(北京天地精儀科技有限公司)；TGL-16C離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Applied Biosystems實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；2000/2000C Nanodrop(賽默飛世爾科技公司)；7220G可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

主要試劑：反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、HO-1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)試劑盒、NQO1 ELISA檢測(cè)試劑盒、8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OH-dG)ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自百杰斯生物公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后的42只SPF級(jí)4周齡雄性ICR小鼠按體重隨機(jī)分為7組，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低濃度榆莢仁黃酮組(低酮組)、中濃度榆莢仁黃酮組(中酮組)和高濃度榆莢仁黃酮組(高酮組)，每組6只，各組間體重差異不顯著(P>0.05)。利用改良多水平臺(tái)睡眠剝奪法[13]對(duì)小鼠進(jìn)行為期30 d的慢性睡眠剝奪，每日18 h(16:00至次日10:00)[14]，睡眠剝奪過(guò)程中保證晝夜節(jié)律穩(wěn)定，溫度適宜。

慢性睡眠剝奪30 d后，各組每天進(jìn)行灌胃，低、中、高酮組分別灌胃30、60、120 mg/kg的榆莢仁黃酮，空白對(duì)照組(不再進(jìn)行睡眠剝奪)灌胃等量的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃等量的褪黑素，模型對(duì)照組灌胃等量的生理鹽水，CMC-Na對(duì)照組灌胃等量的0.5% CMC-Na溶液。各組小鼠自由飲食、飲水，室溫下灌胃28 d。

1.3 樣品采集和檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 慢性睡眠剝奪小鼠器官、血清樣品制備

末次灌胃后禁食24 h，小鼠摘眼球法取血后采用斷頭法處死，冰上解剖并取出各臟器。血液離心制備成血清，各器官用預(yù)冷生理鹽水沖洗后濾紙吸干，置于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 慢性睡眠剝奪小鼠抗氧化酶活性的測(cè)定

采用試劑盒法檢測(cè)大腦、肝臟、腸道中HO-1、NQO1活性，并測(cè)定血清中8-OH-dG含量。

1.3.3 慢性睡眠剝奪小鼠抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定

采用Trizol法提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將Trizol提取后的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)HO-1、NQO1、Nrf2的mRNA相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR反應(yīng)體系15.0 μL，包括7.5 μL 2×qPCR Mix，1.5 μL 2.5 μmol/L基因引物，2.0 μL cDNA，4.0 μL ddH2O。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，60℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。循環(huán)后檢測(cè)其溶解曲線，用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作內(nèi)參基因，采用2-△△Ct計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物均由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Graphpad Prism 8.0及SPSS 22.0軟件進(jìn)行作圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 榆莢仁黃酮對(duì)慢性睡眠剝奪小鼠大腦、肝臟、腸道中HO-1、NQO1活性的影響

由表2可知，低、中、高酮組大腦中HO-1、NQO1活性均顯著高于模型對(duì)照組和CMC-Na對(duì)照組(P<0.05)，表明榆莢仁黃酮對(duì)慢性睡眠剝奪小鼠大腦中HO-1、NQO1活性有明顯提高作用；模型對(duì)照組和CMC-Na對(duì)照組大腦HO-1、NQO1活性差異不顯著(P>0.05)，表明CMC-Na對(duì)小鼠大腦中抗氧化酶活性無(wú)明顯影響。

表2 榆莢仁黃酮對(duì)慢性睡眠剝奪小鼠大腦、肝臟、腸道中HO-1、NQO1活性的影響

低、中、高酮組肝臟中HO-1、NQO1活性均顯著高于模型對(duì)照組和CMC-Na對(duì)照組(P<0.05)，表明榆莢仁黃酮對(duì)慢性睡眠剝奪小鼠肝臟中HO-1、NQO1活性有明顯提高作用；模型對(duì)照組和CMC-Na對(duì)照組肝臟中HO-1、NQO1活性差異不顯著(P>0.05)，表明CMC-Na對(duì)小鼠肝臟中抗氧化酶活性無(wú)明顯影響。

低、中酮組腸道中HO-1、NQO1活性均顯著高于模型對(duì)照組和CMC-Na對(duì)照組(P<0.05)，表明莢仁黃酮對(duì)慢性睡眠剝奪小鼠腸道中HO-1、NQO1活性有明顯提高作用；模型對(duì)照組和CMC-Na對(duì)照組腸道中HO-1、NQO1活性差異不顯著(P>0.05)，表明CMC-Na對(duì)小鼠腸道中抗氧化酶活性無(wú)明顯影響。

2.2 榆莢仁黃酮對(duì)慢性睡眠剝奪小鼠血清8-OH-dG含量的影響

由圖1可知，小鼠血清8-OH-dG含量從高到低依次為模型對(duì)照組>CMC-Na對(duì)照組>高酮組>低酮組>陽(yáng)性對(duì)照組>中酮組>空白對(duì)照組。模型對(duì)照組和CMC-Na對(duì)照組小鼠血清8-OH-dG含量顯著高于其他各組(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.3 榆莢仁黃酮對(duì)慢性睡眠剝奪小鼠抗氧化基因表達(dá)的影響

2.3.1 榆莢仁黃酮對(duì)慢性睡眠剝奪小鼠大腦中Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖2可知，陽(yáng)性對(duì)照組及低、中、高酮組大腦中Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和CMC-Na對(duì)照組(P<0.05)。

圖2 榆莢仁黃酮對(duì)慢性睡眠剝奪小鼠大腦中Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3.2 榆莢仁黃酮對(duì)慢性睡眠剝奪小鼠肝臟中Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖3可知，陽(yáng)性對(duì)照組及低、中、高酮組小鼠肝臟中Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和CMC-Na對(duì)照組(P<0.05)。

圖3 榆莢仁黃酮對(duì)慢性睡眠剝奪小鼠肝臟中Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3.3 榆莢仁黃酮對(duì)慢性睡眠剝奪小鼠腸道中Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖4可知，陽(yáng)性對(duì)照組及中、高酮組小鼠腸道中Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于模型對(duì)照組和CMC-Na對(duì)照組(P<0.05)，低酮組腸道中NQO1和HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組比差異不顯著(P>0.05)。

圖4 榆莢仁黃酮對(duì)慢性睡眠剝奪小鼠腸道中Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討 論

氧化應(yīng)激是由細(xì)胞和組織中ROS的產(chǎn)生和積累造成的[15]，并且與多種疾病有關(guān)，如癌癥、免疫缺陷疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病等，此外它與自由基的過(guò)多產(chǎn)生有關(guān)[16]。自由基是含有1個(gè)或多個(gè)不穩(wěn)定電子的化學(xué)物質(zhì)，去除這些原子中的電子則可以達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)[17]。植物中的黃酮類(lèi)化合物可以通過(guò)增加尿酸水平、金屬螯合活性和抗氧化活性，以減輕氧化應(yīng)激損傷[18]。而榆莢仁黃酮中的酚羥基可以和自由基產(chǎn)生性質(zhì)較穩(wěn)定的半醌自由基(semiquinone radical，UQH)，導(dǎo)致自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)被終止，因此能夠提高機(jī)體的抗氧化能力。

Son等[19]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可通過(guò)激活Nrf2，上調(diào)HO-1、NQO1等抗氧化酶的表達(dá)，最終對(duì)鉻誘導(dǎo)的惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化起保護(hù)作用。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，燈盞花乙素通過(guò)激活Nrf2相關(guān)通路，進(jìn)一步上調(diào)相關(guān)抗氧化酶的表達(dá)。本試驗(yàn)測(cè)定了小鼠大腦、肝臟和腸道中HO-1、NQO1活性的變化，結(jié)果顯示，榆莢仁黃酮均能提高慢性睡眠剝奪小鼠大腦、肝臟和腸道中HO-1、NQO1活性，以中酮組效果最為明顯，與上述研究相符。HO-1能夠通過(guò)催化血紅素轉(zhuǎn)化為膽紅素、游離鐵和一氧化碳發(fā)揮抗氧化作用[21]。而NQO1能夠?qū)⒉煌滈L(zhǎng)的輔酶Q(CoQ)底物還原為它們的抗氧化氫醌形式，并且在自由基攻擊后再生抗氧化形式的α-生育酚(維生素E)，進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激損傷[22]。榆莢仁黃酮通過(guò)增強(qiáng)相關(guān)抗氧化酶活性，從而減輕慢性睡眠剝奪造成的氧化損傷。

Wang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，山楂葉總黃酮能夠顯著提高非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟組織中Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)而在抗氧化應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Wu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，金合歡素通過(guò)激活Nrf2上調(diào)HO-1表達(dá)，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。上述研究表明，Nrf2在細(xì)胞防御自由基損傷方面發(fā)揮著重要作用[25]。睡眠剝奪會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，而Nrf2相關(guān)通路是抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵信號(hào)通路，在氧化應(yīng)激的條件下，Nrf2會(huì)被激活并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，然后與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，導(dǎo)致特定位點(diǎn)的基因后續(xù)表達(dá)[26-29]。Nrf2能夠編碼代謝和抗氧化蛋白的基因，如NQO1、HO-1、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶A2(GSTA2)、谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)等；并調(diào)控相關(guān)抗氧化酶的表達(dá)，進(jìn)而清除ROS等有害物質(zhì)，保持氧化還原平衡[30]。因此，針對(duì)Nrf2的抗氧化治療，可能在治療慢性睡眠剝奪相關(guān)方面發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)以30、60、120 mg/kg的榆莢仁黃酮灌胃慢性睡眠剝奪小鼠，結(jié)果表明，慢性睡眠剝奪小鼠大腦、肝臟和腸道中Nrf2、HO-1和NQO1的表達(dá)下調(diào)，灌胃榆莢仁黃酮后，Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，可能是由于榆莢仁黃酮能消除體內(nèi)自由基，緩解其對(duì)細(xì)胞的氧化損傷，使Nrf2核轉(zhuǎn)位增強(qiáng)，提高Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)而提高慢性睡眠剝奪小鼠大腦、肝臟和腸道中HO-1、NQO1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。而HO-1、NQO1 mRNA相對(duì)表達(dá)量雖然也呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，但未表現(xiàn)出明顯的規(guī)律，可能是Nrf2為抗氧化相關(guān)通路的關(guān)鍵因子，榆莢仁黃酮表現(xiàn)出的抗氧化活性對(duì)其作用更為明顯，而HO-1、NQO1還受到其他因子的調(diào)控，如蛋白激酶C-α(PKC-α)、芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)、芳香烴受體核轉(zhuǎn)位因子(AhR nucleart ranslocator，ARNT)等[31-32]，榆莢仁黃酮對(duì)相關(guān)因子的作用效果未知。

8-OH-dG通常作為DNA氧化損傷的評(píng)價(jià)指標(biāo)[33]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，慢性睡眠剝奪會(huì)導(dǎo)致血清8-OH-dG含量增加，說(shuō)明慢性睡眠剝奪會(huì)造成機(jī)體DNA氧化損傷，經(jīng)過(guò)灌胃榆莢仁黃酮后，血清8-OH-dG含量降低，其原因可能是榆莢仁黃酮通過(guò)清除慢性睡眠剝奪小鼠體內(nèi)自由基與上調(diào)抗氧化酶的活性來(lái)緩解小鼠因慢性睡眠剝奪所致的氧化應(yīng)激，從而使血清8-OH-dG含量降低，進(jìn)而減少小鼠因慢性睡眠剝奪所致的DNA氧化損傷。

綜上所述，榆莢仁黃酮能改善慢性睡眠剝奪小鼠大腦、肝臟、腸道的氧化應(yīng)激狀態(tài)，提高慢性睡眠剝奪小鼠大腦、肝臟、腸道中HO-1、NQO1活性，降低血清8-OH-dG含量，提高大腦、肝臟、腸道中HO-1、NQO1和Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

4 結(jié) 論

① 榆莢仁黃酮可降低慢性睡眠剝奪小鼠血清8-OH-dG的含量，改善DNA的氧化損傷。

② 榆莢仁黃酮可提高慢性睡眠剝奪小鼠大腦、肝臟和腸道中HO-1、NQO1活性和Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA相對(duì)表達(dá)量，改善各器官的氧化應(yīng)激損傷。