包被漆酶對公牛生長性能和瘤胃發(fā)酵的影響

■何金川 成采遙 劉強 張靜 郭剛 霍文婕 裴彩霞

（山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，山西太谷 030801）

漆酶（laccase）可由白腐真菌和曲霉菌的真菌或細菌分泌，能催化酚基的氧化而使木質素降解[1]。飼草干物質（DM）中細胞壁占40%～70%，主要由木質素、果膠、纖維素和半纖維素組成，這些化合物形成交聯(lián)的三維結構，牛對其消化率不到60%[2]。日糧添加纖維素分解酶和木聚糖酶，能促進瘤胃微生物的生長和細菌對飼料顆粒的附著；提高纖維消化率和公牛生長性能[2-3]。但是，植物細胞壁木質素和半纖維素的連接阻礙了纖維分解酶與飼料顆粒的結合，而且木質素會吸附外源纖維酶[4]，脫木質素處理能促進纖維素酶對飼料纖維底物的水解[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，漆酶可以氧化木質素的芳香環(huán)并在植物細胞壁表面形成微孔，有助于纖維分解酶對細胞壁的附著[1]；公牛日糧中添加漆酶，瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）產(chǎn)量和日糧養(yǎng)分表觀消化率提高[6]。但是，過量的外源酶降解飼料養(yǎng)分會產(chǎn)生酚類化合物等抗營養(yǎng)因子；外源酶與瘤胃微生物酶存在結合位點的競爭[4]；高水平的漆酶會激活植物纖維表面的木質素，引起游離木質素再次聚合[1]。在瘤胃中降解率低的包被漆酶（CL）添加劑，既可以避免上述負面影響，又可以實現(xiàn)對瘤胃和小腸養(yǎng)分消化的同時調(diào)控。因此，本試驗探究CL 對公牛生長性能、養(yǎng)分消化和瘤胃發(fā)酵的影響，以期為CL在反芻動物生產(chǎn)中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

漆酶（5 萬U/g）購于西安惠邦生物工程有限公司。CL 添加劑參照Wang 等[7]方法制作，用氫化植物油、硬脂酸鈣和膨潤土等作為材料，其中漆酶含量為33.3%。用裝有瘤胃和十二指腸瘺管的公牛，采用尼龍袋法，測得CL 在瘤胃和小腸中的釋放率分別為28%和67%。

1.2 試驗動物和試驗設計

選用（12.0±0.3）月齡體重（564.75±4.11）kg 的安格斯公牛48 頭，隨機分為對照、低CL（LCL）、中CL（MCL）組和高CL（HCL）組，分別以CL 的形式添加漆酶0、0.2、0.4、0.6 g/kg DM，添加量依據(jù)Yue等[6]的試驗結果確定。試驗期包括20 d預試期和60 d正試期，共80 d。

1.3 試驗日糧及飼養(yǎng)管理

試驗用全混合日糧（TMR），依據(jù)NRC（2001）配制[8]（見表1）。試驗牛單欄飼養(yǎng)，每日5：00和17：00飼喂，自由采食和飲水。晨飼前先將CL 混合于1/3 的TMR中，待牛采食完之后再喂其余TMR。

表1 試驗日糧組成和營養(yǎng)水平（DM，%）

1.4 樣品采集與分析

1.4.1 牛體重和采食量的測定

正試期的第1、30 天和第60 天，晨飼前分別連續(xù)2 d稱量每頭牛的體重，計算平均日增重（ADG）。記錄每頭牛每天的投喂量和剩料量，測定飼料和剩料的DM含量，計算干物質采食量（DMI）。

1.4.2 飼料草和糞樣的采集與測定

正式試驗期的第52～58天，收集每頭牛每天TMR和剩料樣，-20 ℃保存；每天于6：00、12：00 和18：00通過直腸采集每頭牛糞樣（300 g）。糞樣中添加鮮糞重1/4的10%酒石酸溶液，-20 ℃保存。試驗結束后，將TMR、剩料和糞便樣品分別以牛為單位按比例混勻，制成混合樣，65 ℃烘至恒重，粉碎過1 mm篩。依據(jù)實驗室常規(guī)方法[9]測定樣品中DM、粗蛋白（CP）、有機物（OM）、中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量。

1.4.3 瘤胃液樣品的采集與測定

正試期的第59 天和第60 天，晨飼后3 h，用胃管采集每頭牛瘤胃液樣品約100 mL（將先采集的約200 mL 瘤胃液倒掉，確保不被唾液污染），立即用PHS-3 型酸度計（上海雷軍實驗儀器有限公司）測定瘤胃液pH。瘤胃液樣品用四層紗布過濾，分裝3 份，2 份-20 ℃保存，用于揮發(fā)性脂肪酸（VFA）和氨態(tài)氮（NH3-N）濃度的測定[9]；1 份-80 ℃保存，用于瘤胃菌群數(shù)量測定[9]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用SAS 9.0 統(tǒng)計分析軟件[10]的one-way ANOVA進行方差分析和LSD多重比較。當P＜0.05時表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 CL對安格斯公牛生長性能的影響

由表2可見，日糧添加CL對DMI無顯著影響（P＞0.05）。各組試驗牛第1 天體重無顯著差異（P＞0.05）。隨CL添加水平的增加，試驗牛第30天體重呈二次曲線顯著增加（P＜0.05），MCL 組最高，其次LCL組和HCL 組，對照組最低。第60 天體重和ADG 線性顯著增加（P＜0.05）；MCL 組和LCL 組第60 天體重顯著高于對照組和HCL 組（P＜0.05）；MCL 組ADG 顯著高于對照組（P＜0.05），與LCL組和HCL組相比無顯著差異（P＞0.05）。飼料轉化率（FCR）呈線性降低（P＜0.05），且各CL添加組顯著低于對照組（P＜0.05）。

表2 CL對安格斯牛公牛干物質采食量、平均日增重和飼料轉化率的影響

2.2 CL對安格斯公牛養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表3 可知，隨CL 添加水平的增加，DM、OM、CP、NDF 和ADF 表觀消化率線性顯著提高（P＜0.05）；MCL 組和HCL 組DM 表觀消化率顯著高于對照組（P＜0.05），與LCL 組相比差異不顯著（P＞0.05）；MCL 組OM 表觀消化率顯著高于對照組（P＜0.05），與HCL 組和LCL 組相比差異不顯著（P＞0.05）；MCL組CP 表觀消化率最高，HCL 組和LCL 組次之，對照組最低；各CL 添加組NDF 表觀消化率顯著高于對照組（P＜0.05）；各CL 添加組ADF 表觀消化率顯著高于對照組（P＜0.05），MCL 組顯著高于LCL 組（P＜0.05）。

表3 CL對安格斯公牛養(yǎng)分表觀消化率的影響（%）

2.3 CL對安格斯公牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表4 可見，隨CL 添加水平的增加，瘤胃pH、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸摩爾比無顯著變化（P＞0.05）；瘤胃TVFA 濃度、乙酸/丙酸和NH3-N濃度線性增加（P＜0.05）；MCL 組和HCL 組TVFA 含量顯著高于對照組和LCL組（P＜0.05）；HCL組乙酸/丙酸和NH3-N濃度顯著高于對照組（P＜0.05），與LCL組和MCL組相比差異不顯著（P＞0.05）。

表4 CL對安格斯公牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.4 CL對安格斯公牛瘤胃菌群數(shù)量的影響

由表5可知，隨CL添加水平的增加，瘤胃總細菌、總真菌、總原蟲、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量線性顯著提高（P＜0.05）；總產(chǎn)甲烷菌和嗜淀粉瘤胃桿菌數(shù)量無顯著變化（P＞0.05）?？偧毦⒖傉婢?、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和溶纖維丁酸弧菌數(shù)量，HCL 組最高，MCL和LCL組次之，對照組最低（P＜0.05）；HCL組總原蟲數(shù)量顯著高于對照組和LCL組（P＜0.05），與MCL組相比差異不顯著（P＞0.05）；產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量，HCL組最高，MCL組次之，LCL和對照組較低（P＜0.05）。

表5 CL對安格斯公牛瘤胃菌群數(shù)量的影響

3 討論

日糧添加CL 對安格斯公牛的DMI 沒有顯著影響，因此，ADG 的提高歸因于日糧養(yǎng)分表觀消化率和瘤胃總VFA 濃度的提高。試驗結果表明，CL 提高了公牛對飼料的利用效率，表現(xiàn)為飼料轉化率的降低。Yue等[6]的試驗同樣發(fā)現(xiàn)，日糧添加漆酶，公牛ADG提高，F(xiàn)CR 降低。添加纖維素酶和木聚糖酶的復合物，肉牛ADG增加[11]。

日糧DM、OM、CP、NDF、ADF表觀消化率的提高，表明添加CL促進了養(yǎng)分在瘤胃和小腸的消化。漆酶可以氧化木質素的芳香環(huán)，在植物細胞壁上形成微孔，增加了飼料表面積，利于消化道微生物和酶對飼料顆粒的附著[1]。而且，瘤胃TVFA 濃度升高的結果表明CL 改善了養(yǎng)分在瘤胃中的降解。前期試驗發(fā)現(xiàn)，公牛日糧中添加漆酶，玉米青貯DM 和NDF 瘤胃降解率提高[6]；體外試驗表明，漆酶處理提高了玉米秸稈營養(yǎng)物質在瘤胃降解率[12]。另外，試驗用的CL 添加劑中約67%的漆酶能到達小腸。研究發(fā)現(xiàn)，反芻動物日糧中添加的纖維類分解酶在小腸仍具有活性[13]；大鼠日糧中添加漆酶，DM、OM、NDF、ADF 的表觀消化率提高[14]。

日糧添加CL 對牛瘤胃pH 無顯著影響，各組pH處于6.33～6.54，對瘤胃微生物的生長和飼料養(yǎng)分的降解無負面影響[15]。瘤胃TVFA濃度的增加，與總細菌、總真菌和總原蟲數(shù)量增加的結果相一致。試驗結果表明，CL的添加刺激了瘤胃微生物的生長，進而促進了飼料養(yǎng)分在瘤胃中的降解，歸因于外源添加的漆酶與內(nèi)源瘤胃微生物之間的協(xié)同作用[16]。飼料養(yǎng)分在瘤胃中的降解為微生物的生長提供了能量和氮源，而漆酶對木質素的降解為微生物降解飼料養(yǎng)分提供了條件[6]。瘤胃乙酸摩爾比無顯著變化，但用TVFA 濃度乘以乙酸摩爾比計算出的乙酸濃度（對照、LCL、MCL、HCL 組分別為79.2、82.1、87.9、86.5 mmol/L）增加，表明瘤胃發(fā)酵模式趨于產(chǎn)生更多的乙酸，表現(xiàn)為乙酸/丙酸增加。試驗結果歸因于添加CL 瘤胃總原蟲、總真菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌數(shù)量的增加。這些微生物通過分泌的纖維分解酶降解飼糧中的纖維物質，產(chǎn)生乙酸[17]。此外，真菌的菌絲可以穿透植物細胞壁，使植物內(nèi)部纖維素裸露，促進瘤胃微生物和纖維素的結合[18]。

瘤胃NH3-N 濃度的升高和CP 表觀消化率提高的結果相一致，表明添加CL 促進了CP 在瘤胃中的降解。試驗結果歸因于日糧添加CL 后，瘤胃總原蟲、溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量的增加。另外，添加CL 后纖維分解菌數(shù)量的增加也有助于CP 在瘤胃中的降解。棲瘤胃普雷沃氏菌和溶纖維丁酸弧菌是瘤胃中的主要蛋白質降解菌，通過分泌蛋白酶，降解飼糧CP 生成NH3-N[15]。原蟲對細菌的吞噬和消化過程中也產(chǎn)生NH3-N[19]。纖維素酶釋放纖維基質中的植物蛋白，促進蛋白酶對蛋白質的消化[20]。其他研究同樣發(fā)現(xiàn)，公牛日糧添加漆酶，瘤胃TVFA 濃度、總細菌、總真菌、纖維分解菌和蛋白分解菌的數(shù)量提高[6]；體外試驗表明，添加曲霉培養(yǎng)物，TVFA 產(chǎn)量以及真菌和纖維分解菌數(shù)量增加[21]。

4 結論

日糧添加CL，改善了公牛生長性能、養(yǎng)分消化和瘤胃發(fā)酵，CL的最佳添加水平是漆酶0.4 g/kg DM。